PERCOBAAN VI

UJI CEMARAN MIKROBA ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)

1. Tujuan :

Mahasiswa dapat melakukan penetapan jumlah cemaran mikroba yang terdapat pada sediaan
farmasi (baik obat, kosmetika, maupun bahan baku), makanan serta minuman

2. Prinsip :

Jika mikroorganisme yang hidup/ada dalam suatu bahan/cuplikan. Ditumbuhkan pada media
dengan kondisi sesuai, suhu optimal dan nutrisi yang cukup, maka sel akan berkembangbiak
dengan membentuk koloni yang dapat diamati dengan mata. Tiap sel yang hidup akan
berkembang menjadi 1 koloni. Jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan petunjuk
bagi jumlah mikroorganisme hidup yang terkandung dalam bahan/cuplikan tersebut.

3. Teori Umum :

Uji Angka Lempeng Total (ALT) dilakukan untuk menentukan jumlah atau angka bakteri aerob
mesofil yang mungkin mencemari suatu produk, baik itu makanan-minuman, obat tradisional
ataupun kosmetika. Media yang digunakan untuk uji ALT adalah PCA (Plate Count Agar). Masa
inkubasi dilakukan dengan membalik cawan petri yang berisi biakan. Hal ini dimaksudkan untuk
menghindari jatuhnya butir air hasil pengembunan disebabkan suhu inkubator. Apabila sampai
terdapat air yang jatuhmaka akan merusak pembacaan angka lempeng total dari sampel yang diuji.
Cara inokulasi yang dipilih adalah cara tuang, dimana hal ini dimaksudkan untuk melihat
pertumbuhan baketri aerob mesofil, yang membutuhkan oksigen dalam pertumbuhannya, sehingga
akan teramati bahwa pertumbuhan bakteri aerob mesofil tersebut akan berada dipermukaan
lempeng agar. Untuk sampel makanan-minuman, obat tradisional, dan kosmetik yang diduga
menggunakan pengawet digunakan pengencer yaitu Letheen Broth (LB) yang dapat
menginaktivasi pengawet dalam sampel karena mengandung lesitin 0,5% yang berfungsi sebagai
inaktivator, sehingga hasil pengujian yang negatif dari sampel benar-benar menunjukkan hasil
yang negatif bukan karena aktifitas dari pengawet. Sedangkan untuk sampel tanpa pengawet,
pengenceran dilakukan dengan menggunakan Pepton Dilution Fluid (PDF).
Pada pengujian angka kapang/khamir digunakan pengencer PDF yang mengandung nutrisi pepton
yang baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir serta menggunakan media Potato Dextrose Agar
(PDA) yang merupakan media padat (agar) dengan kandungan nutrisi karbohidrat (dekstrosa) yang
baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir. Inkubasi sampel dilakukan pada suhu 20-25°C yang
merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan kapang dan khamir. Inkubasi sampel tidak boleh
diposisikan terbalik karena kapang/khamir akan tumbuh dan memiliki spora yang terus dan
berkembangbiak, jika posisi cawan dibalik maka spora fungi tersebut akan bertebaran dan tumbuh
dimana-mana pada media agar, sehingga jumlah koloni mfungi yang tumbuh akan semakin banyak
dari jumlah koloni sebenarnya, hal ini dapat menyebabkan kesalahan perhitungan koloni
kapang/khamir. Pada media PDA ditambahkan klorampenikol sebanyak 10mg/100ml dengan
tujuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri sehingga yang akan tumbuh pada media tersebut
hanya kapang dan khamir.
Cawan yang dipilih untuk perhitungan koloni adalah yang mengandung antara 30-300 koloni.
Untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan mengandung koloni dalam jumlah yang
memenuhi syarat maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah
organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang
terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan.

Tabel
Pengamatan Cawan I Cawan II Keterangan
Pengenceran
Dipilih koloni
10-2 150 300
cawan I
Dipilih koloni
10-3 20 25
cawan II

Perhitungan:
Kisaran yang paling tepat dalam menghitung koloni pada cawan adalah 25-250 koloni percawan.
dalam perhitungan percobaan ini, lihat kembali bahan kuliah anda!
 Jumlah koloni rata-rata = jumlah kedua cawan dikalikan dengan faktor pengencerannya
150+250
 Maka Angka Lempeng Total adalah : x 102 = 200 x 102.
2

4. Bahan/alat yang diperlukan :

- Media Nutrien Agar (NA) atau media Plat Count Agar (PCA)
- Media Sabouraud Dekstrosa Agar (SDA) atau media Potato Dekstrosa Agar (PDA) +
 kloramfenikol 100 mg/1 liter media
- Larutan NaCl 0.9% b/v
- Cawan petri Steril, tabung reaksi steril, rak tabung reaksi, pipet agar 20 mL steril, pipet
ukur 10 mL steril, pipet ukue 1 mL steril
- Sampel yang akan diperiksa

5. Prosedur Percobaan :
Cairkan media dalam tangas air. Setelah cair, biarkan dalam water bath 45-50oC selama kurang
lebih 30 menit.
1) Buat pengenceran decimal dari sampel dengan menggunakan NaCl 0.9% b/v steril, sampai
didapat pengenceran 10%
2) Tandai cawan petri dengan nama media dan tingkat pengencerannya
3) Pipet 1 mL dari masing-masing pengenceran dan masukkan ke dalam cawan petri yang
sesuai
4) Tuangkan agar cair yang suhunya kurang lebih 50oC dan homogenkan dengan cara
menggoyangkan cawan dengan searah gerakan jarum jam 5x dan gerakan berlawanan
sebanyak 5x. Usahakan supada tidak tumpah. Lakukan duplo untuk setiap pengenceran dan
lakukan pula control media untuk setiap media.
Keterangan :
a. Media NA untuk penetapan jumlah bakteri aerob, Media SDA untuk penetapan jumlah kapang
dan khamir
b. Biarkan agar padat, setelah itu inkubasi pada suhu yang sesuai Media NA pada suhu 37oC,
amati 1-5 hari Media SDA pada suhu 20oC, amati 1-7 hari.
c. Hitung jumlah koloni bakteri, kapang dan khamir yang tumbuh pada lempeng agar dan
nyatakan dalam satuan cfu/mL

Hasil Pengamatan :
1. Media NA Jumlah Koloni pada hari
ke
1 2 3 4 5 6 7
Kontrol Media
Pengenceran 10-1
Pengenceran 10-2
Pengenceran 10-5
Pengenceran 10-6
2. Media PDA Jumlah Koloni pada hari
ke
1 2 3 4 5 6 7
Kontrol Media
Pengenceran 10-1
Pengenceran 10-3
Pengenceran 10-2
Pengenceran 10-4

Diskusi :