KIMIA FORENSIK

Judul Jurnal :
A RELIABLE AND VALIDATED LC-MS/MS METHOD FOR
THE SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF 4
CANNABINOIDS IN 40 CONSUMER PRODUCTS

Nama Anggota :

1. Sri Anggita Surya F. (051511133031)

2. Danik Mahfirotul H. (051511133098)
3. Ruswien Nona Amine (051511133160)
4. Pertiwi Kesuma Y. (051511133172)
5. Lutvia Alnizar (051511133191)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2019
PENDAHULUAN
 EKSPERIMENTAL

a. Bahan
b. Instrumentasi
c. Preparasi standar
d. Preparasi kurva kalibrasi
e. Preparasi sampel
f. Kondisi HPLC-MS/MS
Kolom Agilent Eclipse Plus 95A C18
Fase gerak Isokratik air (0.1%asam format) :
acetonitrile (0.1% asam format) 10:90
Flow rate 0,5 mL/menit
Suhu kolom 400C
Suhu autosampler 40C
Volume injeksi 20µL
Gas Nitrogen
Mode (terdapat 2 yang diterapkan) Mode negatif dan mode positif

g. Validasi metode
Validasi mengikuti FDA Bioanalytical Method Validation Guidelines for
Industry and Health Canada. Matriks yang digunakan adalah minyak zaitun.

h. Selektifitas&LOQ
 8 sumber matriks dianalisa  ekstraksi (dibuat rangkap 3)  observasi
peak area  bandingkan dengan LLOQ analit dan standar internal.
 Kriteria penerimaan: peak area matrix kosong < 1/5 LLOQ pada Rt analit.
 LLOQ ditentukan sebagai konsentrasi terendah yang memunculkan peak
area sebesar 5x peak area matriks kosong, akurasi< 20% nilai teoritis dan
presisi < 20%
 LLOD ditentukan sebagai konsentrasi terendah yang memunculkan peak
area > 3x peak area matriks kosong,

i. Kurva kalibrasi, presisi, akurasi

Dilakukan plotting antara rasio peak area analit terhadap standar
internal dengan konsentrasi. Dilakukan 5 replikasi untuk setiap baku kerja
 konsentrasi (0,5;5;50;200 ng/mg) yang diekstrak dan di uji selama 3 hari.
Presisi dan akurasi inter-day dan intra-day dihitung ( syarat penerimaan: rata-
rata <15% dari nilai teoritis; presisi ≤ 15% CV.

j. Efek Matriks dan Recovery

 Efek matriks diukur dengan membandingkan peak area ekstrak matriks
kosong lalu di-spike dengan standar pada konsentrasi yang sama dalam
pelarut.
 Recovery ekstraksi diukur dengan membandingkan peak area ekstrak
matriks kosong di spike dengan standar sebelum dilakukan ekstraksi dan
setelah ekstraksi.

k. Stabilitas
Stabilitas kimia semua analit dievaluasi digunakan 5 replikasi untuk
setiap konsentrasi. Selanjutnya membandingkan rasio peak area sampel yang
sudah dipreparasi pasca 12 jam dengan yang baru saja selesai dipreparasi;
serta sampel yang telah disimpan selama 3 hari.

l. Analisis sampel
Tiap sampel uji dibuat tiga rangkap dan dianalisis dengan metode
tervalidasi, diikuti kurva kalibrasi dan baku kerja. Jika > 2/3 dari sampel baku
kerja pada 4 konsentrasi ≤ 15% nilai teoritis, maka batch diterima. Jika tidak,
maka batch ditolak. Satu sampel uji dalam tiap kelompok batch dipilih acak
untuk menilai reproduksibilitas metode. Diterima bila 2/3 dari total tidak
berbeda 20% antar batch.
 HASIL DAN PEMBAHASAN

a. Pengembangan metode
- Metode HPLC-MS/MS menguntungkan karena sangat senitif dan mampu
menampung 4 analit C.sativa sekaligus.
- Semua parameter MS/MS dioptimasi dengan larutan standar analit
tunggal.
Mode ion positif Mode ion negatif

Identifikasi CBD dan THC CBDA dan THCA-A

Transisi MRM 315.0193.0 357.0339.0

Senyawa dibedakan dengan Retention time Retention time

- Kondisi isokratik dikembangkan untuk memisahkan analit target dari

senyawa lain yang mungkin ada dalam ekstrak C.sativa, serta untuk
menghasilkan peak terbaik.
- Asam format berfungsi sebagai dapar fase gerak HPLC untuk
menghasilkan konjugat tunggal selama pemisahan.
- Pengenceran besar pada prosedur ekstraksi efektif untuk mengekstraksi
analit dan mengencerkan matriks secara optimal, sehingga meniadakan
efek matriks.
- Metode ini mampu meng-kuantifikasi konsentrasi di bawah level relevan
untuk peraturan standar.
- Metode ini divalidasi untuk pengenceran tambahan untuk mengatasi
konsentrasi analit yang sangat tinggi pada produk komersil, sehingga
dapat dikatakan bahwa metode ini memfasilitasi rentang konsentrasi
yang sangat luas.
 b. Validasi metode
Prosedur validasi metode ini diambil berdasarkan Guideline dari
FDA, yaitu menggunakan minyak zaitun sebagai matriks. Terdapat 2
tambahan matriks, yaitu krim Delivra SR dan bahan tanaman kering.
Terdapat 7 dari 8 matriks berupa minyak yang dianalisis selektivitas dan
dipilih yang tidak mempengaruhi analit yang di uji atau standar internal.
Minyak bunga matahari terdapat komponen yang dapat mempengaruhi
analisis dari Cannabidiol (CBD), sehingga tidak digunakan.
Dalam validasi metode ini dilakukan profiling cannabinoid dalam
matriks menggunakan LC-MS/MS, LLOD (Lower Limit of Detection) dan
LLOQ (Lower Limit of Quantification), akurasi dan presisi, recovery
extraction dan efek matriks, dan stabilitas.
1) Profiling cannabinoid dalam matriks menggunakan LC-MS/MS
2) LLOD dan LLOQ

LLOD dari Cannabidiol (CBD) dan Tetrahydrocannabinol (THC) adalah

0,048 ng/ mL. LLOD dari bentuk asam dari CBD dan THC (CBDA dan THCA-A)
adalah 0,024 ng/mL. LLOQ untuk analit adalah 0,195 ng/mL dan koefisien korelasi
> 0,99.
3) Akurasi dan Presisi

Sampel dalam matriks minyak zaitun dianalisis dalam 3 hari (n=5) pada
konsentrasi dari 0,5 ng/mL – 200 ng/mL. Akurasi Intra-day dari 4 cannabinoid (94,2-
112,7%) dan Inter-day (97,2-110,9%). Presisi (RSD) dari 4 cannabinoid: Intra-day
(8,1%) dan Inter-day (12,4%).
Sampel cannabinoids pada bahan tanaman dan Krim Delivra SR dianalisis dalam
3 hari (n=5) pada konsentrasi dari 0,5 ng/mL – 200 ng/mL. Akurasi dari THC
(100,4-105,6%%) dan CBD (101,5-108,1%) pada bahan tanaman. Presisi (RSD)
dari THC dan CBC (dibawah 13,2%) pada bahan tanaman. Akurasi dari THC
(91,7-113,7%) dan CBD (98,7-114,1%) pada matriks krim. Presisi (RSD) dari
THC dan CBC (dibawah 13,2%) pada matriks krim. Tidak seperti pada matriks
minyak zaitu, akurasi dan presisi dari CBDA dan THCA-A berada diluar rentang
yang dapat diterima oleh FDA.
4) Recovery Extraction dan Efek Matriks

Recovery Extraction analit dalam minyak zaitun: THC (87,5-98,5%), CBD

(86,9-109,6%), CBDA (91,6-100%), dan THCA-A (83,7-102%). Hal tersebut
menunjukkan bahwa prosedur ekstraksi yang dilakukan telah tepat. Efek matriks
dari THC, CBD, CBDA dan THCA-A: 110,4-116,0%, 105,4-112,2%, 96,3-
117,8%, dan 92,7-107,8%. Hal tersebut menunjukkan tidak ada efek matriks
yang signifikan.

Recovery Extraction analit dalam bahan tanaman: THC (102.0-112,8%) dan

CBD (98,3-114,6%). Recovery Extraction analit dalam krim: THC (85,1-90%)
dan CBD (86,8-94,1%). Hal tersebut menunjukkan bahwa prosedur ekstraksi
yang dilakukan telah tepat. Efek matriks dari THC dan CBD dalam bahan
tanaman: 102,0-112,8% dan 91,2-129,4%. Efek matriks dari THC dan CBD
dalam krim: 79,4-93,1% dan 83,8-100,2%. Efek matriks lebih terlihat pada
CBDA dalam bahan tanaman dengan terjadinya peningkatan efek bahkan pada
konsentrasi yang rendah.
5) Stabilitas
Tabel tersebut mendeskripsikan tentang stabilitas analit dalam kondisi
pemrosesan dalam pelarut ekstraksi dengan matriks minyak zaitun pada
benchtop (suhu 20º, selama 12 jam) dan pada aut]osampler (suhu 4º, selama 3
hari). Semua analit stabil dalam pelarut ekstraksi. Sampel di analisis kembali
dengan dipilih salah satu sampel dari setiap batch secara acak dan di analisis
kembali setelah lebih dari 1 bulan penyimpanan. Perhitungan dilakukan dengan:

Dari hasil tersebut, diketahui bahwa analit stabil dalam penyimpanan pada suhu
4º selama 1 bulan.

c. Cannabinoid dalam Berbagai Produk

Metode yang divalidasi diterapkan pada 40 produk jadi yang tersedia
di Kanada, dipesan secara online atau dibeli di dalam toko. Diantaranya
dilakukan pengujian pada produk minyak, bahan tanaman, krim dalam
bentuk kosmetik, produk perawatan pribadi, minyak untuk memasak,
minyak pijat, lotion tubuh, tincture, dan suplemen . Dalam 40 produk yang
diuji, 38 produk memiliki level THC jauh di bawah batas legal Kanada
yaitu 10 μg / g, ditemukan satu minyak rami (10,01 μg / g) dan satu tingtur
(337 μg / g) jauh lebih tinggi. Produk – produk tersebut juga memiliki
berbagai konsentrasi CBD yang diukur, di bawah batas kuantifikasi (<0,19
μg / g) hingga 8,410 μg / g. Produk dengan kandungan THC dan CBD
terukur tertinggi masing-masing mengandung 337 μg / g dan 8.410 μg / g
(Gambar 2, produk 17). Produk berbasis minyak tersebut ditemukan
memiliki tingkat CBD dan CBDA yang secara keseluruhan lebih tinggi
daripada produk non-minyak pada umumnya. Sebagian besar produk
kosmetik tidak mengandung kadar cannabinoid di atas LLOQ yang sangat
rendah. Ada perbedaan besar dalam konten CBD dari tiga produk dengan
konten CBD tertinggi (Gambar 2, produk 13, 15, dan 17; > 2,800 μg / g)
dan produk yang tersisa (<20 μg / g).
Terdapat hal menarik yaitu konsentrasi CBD dalam sampel komersial
dan rasio CBD: CBDA dalam sampel yang sama. 90% produk yang
mengandung CBD dan CBDA memiliki konsentrasi CBDA yang lebih
tinggi dari CBD. Sebaliknya, ketiga produk dengan konsentrasi CBD
tertinggi dimiliki tingkat CBDA relatif sangat rendah dengan rasio CBD:
CBDA antara 1.000: 1,4 dan 1.000.000: 1,7. Rasio THC: THCA atau CBD:
CBDA dapat bervariasi pada tanaman dari strain ke strain, tetapi
kekurangan CBDA dalam sampel kaya CBD menunjukkan pemalsuan
dalam sampel, baik melalui perbedaan yang signifikan dalam metode
pengolahan atau penambahan CBD murni ke produk akhir. Banyak negara
menetapkan kebijakan tanpa toleransi atau konten THC maksimum dalam
produk yaitu 10 μg / g . Dosis medis THC umumnya dijelaskan dalam
peningkatan 10 mg atau 2,7 mg / dosis untuk produk obat yang diatur
seperti Sativex . Sebaliknya ada tidak ada tingkat CBD yang dapat diterima
atau ambang batas untuk pertanian C. Hal ini didorong oleh kurangnya
pengujian yang diperlukan dan keamanan umum CBD, dengan laporan
kasustingkat konsumsi yang aman 3–1,500 mg / hari dan berbagai uji klinis
menggunakan 300-600 mg / hari mengakui efek samping yang setara atau
lebih rendah dibandingkan dengan plasebo. Meski diperlukan studi
keamanan, konsensus adalah bahwa CBD tidak memiliki efek buruk pada
manusia, meskipun terdaftar sebagai zat yang dikendalikan di banyak
negara. Pasien medis yang menerima CBD dalam studi investigasi atau
obat yang diatur akhirnya (mis. Epidiolex) harus dilengkapi dengan
pengetahuan konsumen yang memadai untuk menghindari secara tidak
sengaja memodifikasi dosis yang ditentukan mereka.
 KESIMPULAN

1. LC-MS/MS merupakan metode yang sensitif, mudah, dan cepat untuk

kuantifikasi simultan THC, CBD, THCA-A dan CBDA yang terdapat pada
beberapa produk komersial.
2. Metode ini dikembangkan dan divalidasi untuk menguji produk berbasis
minyak, senyawa dalam tanaman dan produk berbasis krim/kosmetik.
 DAFTAR PUSTAKA

Meng Q, Buchanan B, Zuccolo J, Poulin M-M, Gabriele J, Baranowski DC. 2018. A

Reliable and Validated LC-MS/MS Method for the Simultaneous
Quantification of 4 Cannabinoids in 40 Consumer Products. PLoS ONE
13(5): p.1-16.