Ringkasan

Wawasan Struktural dari Peptida 9-Residu Perakitan Sendiri dari ekor C-

terminal E-protein Virus SARS Corona dalam DPC dan SDS Micelles: Studi
Spektroskopi Resolusi Tinggi dan Resolusi Rendah Gabungan

ABSTRAK
Dalam beberapa tahun terakhir, beberapa studi yang didasarkan pada interaksi peptida
pendek yang dirakit sendiri yang berasal dari Viroporins dengan membran model,
telah meningkatkan pemahaman kami tentang mekanisme molekul infeksi virus
Corona (CoV) dalam kondisi fisiologis. Dalam penelitian ini, kami telah
mengkarakterisasi mekanisme interaksi membran dari pendek, 9-residu peptida TK9
(T55VYVYSRVK63) yang telah diturunkan dari terminal karboksil dari Sindrom
Pernafasan Akut Parah (SARS) Virus korona (SARS CoV) Amplop (E) protein.
Peptida telah dipelajari untuk perubahan fisiknya dengan adanya DPC zwitterionik
dan misel membran model SDS yang bermuatan negatif, masing-masing, dengan
bantuan baterai teknik biofisik termasuk solusi dua dimensi keadaan spektroskopi
NMR. Menariknya, di kedua lingkungan misel, TK9 mengadopsi konformasi alfa
heliks; Namun, kecenderungan heliks jauh lebih tinggi dalam kasus DPC
dibandingkan dengan misel SDS, menunjukkan bahwa TK9 memiliki lebih banyak
spesifisitas terhadap membran sel eukariotik daripada membran sel bakteri. Orientasi
peptida TK9 juga bervariasi dalam lingkungan misel yang berbeda. Afinitas peptida
selanjutnya dimanifestasikan oleh kemampuan gangguan membran yang nyata
terhadap mamalia dibandingkan dengan mimik membran bakteri. Secara kolektif,
informasi struktural yang mendalam tentang interaksi TK9 dengan lingkungan
membran yang berbeda menjelaskan spesifisitas inang dan orientasi membran karena
gangguan membran selanjutnya yang terlibat dalam patogenesis virus.

1. Introduction
Virus Corona (CoV) telah dikenal selama beberapa dekade sebagai agen
penyebab masalah pernapasan umum pada fauna manusia dan domestik 1 dan
menginfeksi saluran pernapasan serta saluran pencernaan, dalam skala global. Di
antara berbagai jenis korona virus yang secara ekonomi penting, SARS-CoV, virus
korona manusia, telah menjadi sangat penting dalam beberapa dekade terakhir karena
bertanggung jawab atas Sindrom Pernafasan Akut Parah, biasanya disebut penyakit
SARS. Virus yang mematikan ini merupakan penyebab epidemi global dengan sekitar
8.096 infeksi pernapasan yang mengakibatkan hampir 10% kasus kematian di seluruh
dunia pada tahun 2003. SARS CoVs adalah sekelompok virus ssRNA dengan
morfologi yang khas, karena protein lonjakan (S) yang membentuk bagian luar
'Corona' memberi nama genera.Terlepas dari protein lonjakan, keseluruhan struktur
ditentukan oleh keberadaan amplop (E), membran (M) dan protein nukleokapsid (N).
Dalam penelitian ini, fokusnya pada aspek struktural peptida di hadapan
membran inang yang meniru misel membran dan vesikel unilamellar besar (LUVs).
Memahami signifikansi biologis dari peregangan amiloidogenik ini dalam patogenesis
virus. Asosiasi membran telah sering dipelajari untuk inisiasi perubahan struktural,
memicu agregasi protein dan peptida amiloid dalam banyak penyakit amiloidogenik.
Penelitian ini, akan memungkinkan untuk mengkorelasikan sifat amiloidogenik dari
peptida dalam terang membrannya mengganggu aktivitas.
Interaksi TK9 dengan membran model biologis yang disederhanakan seperti
zwitterionic dodecyl phosphocholine (DPC) dan sodium dodecyl sulfate (SDS) yang
bermuatan negatif dipelajari dengan menggunakan berbagai percobaan NMR larutan
biofisik dan resolusi tinggi.
2. BAHAN DAN METODE
2.1 Reagen
4, 4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid (DSS), deuterium oxide (D2O),
methanol yang dideuterasi (d4-MeOH), SDS perdeuterated (d35-SDS) dan DPC
perdeuterated (d38-DPC) dibeli dari Cambridge Isotope Laboratories, Inc.
(Tewksbury, MA). Lipid (POPG, POPE, dan POPC) dibeli dari Avanti Polar Lipid
(Alabama, USA) dan disiapkan menggunakan ekstruder lipid dari pabrik yang sama.
Pereaksi lain seperti DPH, Carboxyfluorescein, dll. Diperoleh dari Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO).
2.2 Sintesis peptida.
Peptida TK9 disintesis dalam synthesizer peptida semi-otomatis menggunakan
asam amino yang dilindungi Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) (Novabiochem)
dan Rink Amide MBHA seperti dijelaskan di tempat lain. Peptida mentah dimurnikan
dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) menggunakan instrumen
SHIMADZU (Jepang) dengan kolom Phenomenix C18 (dimensi 250 × 10 mm,
ukuran pori 100 Å, ukuran partikel 5-μm) dan elusi gradien linier. Rasio metanol: air
bervariasi secara linier dari 0 hingga 100% selama elusi dan fraksi eluen diliofilisasi.
Spektroskopi massa dan NMR digunakan untuk mengkonfirmasi kemurnian dan berat
molekul peptida terelusi.
2.3. Spektroskopi Dichroism Edaran
Spektra dichroism melingkar (CD) direkam dengan spektrometer Jasco J-815
(Jasco International Co., Ltd. Tokyo, Jepang) dilengkapi dengan dudukan sel Peltier
dan pengatur suhu CDF-426L. Spektrum CD direkam untuk TK9 saja (25 μM) dan di
hadapan berbagai konsentrasi SDS dan DPC pada 370C. Rentang pemindaian
membentang 190-260 nm, dengan interval data 1 nm. Spektra dirata-rata lebih dari 4
pemindaian berturut-turut untuk setiap rangkaian percobaan. Data mentah dikoreksi
untuk kontribusi buffer dan diubah menjadi eliptisitas molar (θ) (deg.cm2.dmol-1),
menggunakan persamaan berikut:
Eliptitas molar (θ) = m0 M / 10 × L × C
dimana m0 adalah mili-derajat, M adalah berat molekul, L merupakan panjang jalur
kuvet (cm), dan C menunjukkan konsentrasi molar.
2.4.Kalorimetri Titrasi Isotermal
Eksperimen titrasi kalorimetri (ITC) isotermal dilakukan menggunakan VP-ITC
MicroCalorimeter pada 310 K. DPC dan larutan stok TK9 disiapkan dalam 10 mM
buffer natrium fosfat pada pH 7,2 dan diturunkan sebelum digunakan. Titrasi
melibatkan 20 injeksi 25 mM DPC pada interval 180 detik, ke dalam ruang sampel
yang mengandung 10 μM TK9. Sel reaksi terus diaduk pada 200 rpm. Panas
pengenceran DPC dalam buffer dikurangi dari data mentah dan dianalisis
menggunakan perangkat lunak Micro-Cal Origin 7.0 dalam instrumen.
2.5 Uji fluoresensi DPH
Fluoresensi DPH (1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene) diukur untuk menjelaskan
interaksi peptida dengan misel yang berbeda yaitu SDS dan DPC. Peningkatan
intensitas fluoresensi DPH relatif (  F) dihitung menggunakan persamaan berikut
  F = 10 × (F-F0 / F0)
2.6 Uji pelepasan bocor pewarna
Vesikel unilamellar besar (LUV) disiapkan dengan lipid yang meniru bakteri
(Escherechia coli) dan komposisi lipid membran mamalia. Untuk LUV yang meniru
membran bakteri, POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)
dan POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol) dicampur dalam
rasio 7: 3.
 Film lipid kemudian dihidrasi menggunakan 300 bufferL buffer yang
mengandung pewarna, 6carboxyfluorescein (yaitu, 70 mM 6-carboxyfluorescein dan
100 mM NaCl dalam larutan buffer fosfat 10 mM dengan pH disesuaikan hingga 7,4)
sehingga dihasilkan konsentrasi lipid dalam larutan adalah 10 mg / ml. Elusi berwarna
dari kolom yang diperoleh mengandung vesikel berisi pewarna yang dipisahkan dari
pewarna yang tidak dienkapsulasi, yang akhirnya digunakan untuk uji kebocoran.
Untuk uji kebocoran membran, peningkatan konsentrasi (5 hingga 30 M) TK9
diinkubasi dengan pewarna 6-karboksfluorescein yang terperangkap dalam LUV dan
intensitas fluoresensi pewarna diukur.
Total fluoresensi (I100) ditentukan dengan penambahan 5 μL Triton X100 10%,
dengan fluoresensi dipantau selama minimal 1 menit atau sampai pembacaan
fluoresensi telah stabil. Persentase kebocoran dihitung sebagai berikut:
Persen kebocoran = [(I –I0) / (I100 - I0)]x100
di mana I adalah intensitas fluoresensi sampel setelah inkubasi dengan peptida, I0
adalah intensitas fluoresensi yang diperoleh tanpa adanya peptida dan I100 adalah
intensitas fluoresensi yang diperoleh setelah penambahan 1 μL dari 10% Triton X-
100, yang berfungsi sebagai kontrol positif, menyebabkan gangguan 100% pada
vesikel.
2.7 Eksperimen Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Eksperimen NMR satu dan dua dimensi dilakukan pada 298 K dan 310 K
menggunakan spektrometer Bruker Avance III 500 MHz, dilengkapi dengan probe
pintar 5-mm.
Dinamika masing-masing residu TK9 dalam konformasi terikat misel, transversal
satu dimensi (R2) dan eksperimen relaksasi longitudinal (R1) untuk proton dilakukan
pada spektrometer Bruker Avance III 500 MHz. Intensitas puncak dari spektrum 1H
NMR diplot terhadap penundaan yang berbeda dan dipasang menggunakan
persamaan eksponensial untuk estimasi tingkat relaksasi.
Percobaan Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE) dilakukan dengan
menambahkan konsentrasi tetap (0,5 mM) quencher paramagnetik, asam 16-doxyl-
stearic (16DSA) yang dilarutkan dalam metanol yang dideuterasi (d4-MeOH), ke
dalam sampel NMR yang mengandung peptida dan misel. Sampel diizinkan untuk
menyeimbangkan selama 1 jam sebelum akuisisi spektrum 2D TOCSY dengan
parameter akuisisi yang sama.
2.8 Perhitungan struktur yang diturunkan oleh NMR
 Struktur tiga dimensi NMR untuk TK9 dalam SDS dan DPC misel dihitung oleh
perangkat lunak CYANA 2.1. Dari spektra NOESY dari TK9 yang diperoleh dengan
adanya SDS dan DPC, kendala jarak batas atas dihitung dari kurva build-up NOE
dengan sehubungan dengan intensitas NOE proton cincin yang dipecahkan dari Y3.
Jarak ini diperoleh dari kurva bangun NOE sebagai kuat (2,5 Å), sedang (2,6 - 3,5 Å)
dan lemah (3,6 - 5,0 Å). Terlepas dari itu, pengekangan sudut dihedral dihitung dari
server web PREDITOR dengan bantuan pergeseran kimia Hα dan 13CαH dan sudut
torsional yang diprediksi selanjutnya dilonggarkan dengan ± 30 ° sebagai batas atas
dan bawah untuk perhitungan struktur lebih lanjut. Selanjutnya, beberapa putaran
perhitungan struktur diulangi berdasarkan pelanggaran pengekangan jarak, tidak
termasuk kendala yang tidak memuaskan secara iteratif.
Akhirnya, ansambel 100 struktur, yang memenuhi sebagian besar jarak
eksperimental dan kendala sudut dihedral, dipilih. Di antara 100 struktur ini, 20
struktur teratas dengan nilai fungsi target terendah dan RMSD dipilih untuk analisis
struktural lebih lanjut. Aspek stereokimia dari struktur akhir divalidasi menggunakan
paket perangkat lunak PROCHECK-NMR.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 TK9 mengadopsi perubahan dalam struktur sekunder di hadapan misel
TK9 mengadopsi konformasi koil acak dalam larutan air, seperti yang terlihat
dari minima negatif karakteristik tunggal pada 195 nm dalam spektrum CD.
Menariknya, di hadapan misel, spektrum CD menunjukkan dua minimum minimum
pada 208 dan 222 nm, menunjukkan transisi struktural dari koil acak ke konformasi
alfa-heliks di lingkungan misel. Keadaan mendalam percobaan NMR percobaan di
kedua sistem misel membantu untuk mendapatkan pemahaman resolusi atomistik
lebih lanjut dari pergantian konformasi TK9 dalam kedua kasus.
Sudah diketahui bahwa misel seperti DPC atau SDS berguna untuk penjelasan
struktural yang diturunkan dari NMR peptida dalam larutan karena gerakan jatuh
cepat dari kompleks peptidemik dalam larutan. Oleh karena itu, perubahan pada
konformasi peptida di hadapan dari misel dipelajari lebih lanjut menggunakan
spektroskopi NMR keadaan larutan. Lebih jauh lagi, tingkat dispersi yang lebih besar
di daerah proton amida 1D dalam kasus DPC misel bila dibandingkan dengan SDS
mungkin menunjukkan perbedaan konformasi yang halus di antara dua lingkungan
misel.
Kurangnya NOE jangka menengah dan panjang dari TK9 dalam larutan air
menandakan bahwa struktur sebagian besar fleksibel dan tidak mengadopsi
konformasi tertentu yang didefinisikan dengan baik dalam larutan air. Di sisi lain,
spektrum NOESY dalam DPC dan SDS misel berisi jumlah yang cukup dari puncak
lintas sekuensial dan jarak menengah NOE yang mengindikasikan adanya lipatan
struktural yang berbeda.
Deviasi pergeseran kimia dari resonansi 13Cα dan Hα dari nilai koil acak standar
juga memberikan tanda tangan dari struktur sekunder peptida. Segmen heliks ditandai
dengan deviasi pergeseran kimiawi negatif dari Hα dan deviasi pergeseran kimia
positif dari 13Cα untuk empat residu berturut-turut sementara tren sebaliknya adalah
tanda tangan dari struktur lembaran beta.
Deviasi pergeseran kimia rata-rata untuk 13Cα dan Hα sedikit lebih besar dalam
hal misel DPC bila dibandingkan dengan SDS. Ini mungkin memberikan indikasi
kualitatif kecenderungan heliks yang lebih besar dari TK9 di lingkungan misel DPC.
3.2 Penjelasan struktural konformasi terikat TK9 dalam lingkungan misel
Kami menggunakan NOESY berasal kendala jarak dalam kombinasi dengan ± 30
° santai sudut torsional, berasal dari PREDITOR berdasarkan nilai pergeseran kimia
Hα dan 13Cα, untuk menguraikan konformasi solusi tiga dimensi dari TK9 di DPC
dan SDS misel. Untuk menghitung struktur dalam misel DPC, total 81 pengekang
jarak termasuk 20 intraresidue, 35 sekuensial dan 26 batasan jarak menengah
diterapkan sedangkan dalam kasus SDS misel 20 intra-residu, 29 sekuensial dan 8
kendala jarak menengah (semuanya 57 NOE kendala) digunakan.
Dalam misel DPC dan SDS, TK9 mengadopsi konformasi alfabet yang
distabilkan oleh interaksi hidrofobik dan hidrofilik kumulatif, tetapi orientasi relatif
residu aromatik dan hidrofobik berbeda di dua lingkungan misel.
RMSD keseluruhan 0,9 Å dari superposisi TK9 di kedua lingkungan misel
disebabkan oleh penyimpangan orientasi rantai samping residu Tyrosine dan Lysine.
Namun demikian, amphipathicity dari TK9 terjaga dengan baik dalam konformasi
dalam kasus kedua sistem misel. Ini terbukti dari representasi potensial permukaan
elektrostatik dari ensemble konformasi yang menggambarkan pemisahan kutub
(berwarna biru) dan residu netral (berwarna putih) di kedua sisi heliks.
Secara bersama-sama, struktur tiga dimensi TK9 dalam DPC dan SDS misel
sangat sesuai dengan hasil spektral CD, menunjukkan kecenderungan konformasi alfa
heliks dari TK9 yang lebih jelas di hadapan misel DPC dibandingkan dengan SDS
bermuatan negatif misel.
 3.3 Dinamika dan orientasi TK9 di lingkungan misel
Secara umum, studi relaksasi 1H NMR (transversal dan longitudinal) sangat
berguna untuk menyelidiki peristiwa pengikatan peptida-misel, yang menunjukkan
interaksi yang lemah (konstanta disosiasi, kisaran KD ≈ μM ke mM) dan dinamika
backbone polipeptida yang jatuh dalam skala waktu cepat hingga menengah. Tingkat
relaksasi longitudinal (R1) dari proton amida (NH) dari “konformasi micellebound
dari TK9” relatif pendek jika dibandingkan dengan “TK9 gratis”. Penurunan tingkat
relaksasi ini disebabkan efek pengikatan peptida dengan misel.
Percobaan Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE) dilakukan untuk
mendapatkan wawasan tentang lokalisasi spesifik TK9 di kedua sistem misel. Asam
stearat 16-doxyl (16-DSA), probe berlabel spin yang mengandung elektron tidak
berpasangan, dalam kelompok nitroksida paramagnetik, yang melekat pada posisi
karbon ke-16 rantai, digunakan untuk pengukuran PRE. Berdasarkan hasil, dapat
disimpulkan bahwa TK9 cenderung mengikat ke permukaan misel SDS di sepanjang
kelompok kepala lipid, sedangkan itu mengarahkan dirinya jauh lebih dalam ke
daerah hidrofobik lapisan lipid, mengadopsi lebih atau kurang paralel orientasi dalam
misel DPC.
Sejalan dengan data NMR, uji fluoresensi berbasis DPH (1,6-Diphenyl-1,3,5-
hexatriene) juga membantu untuk menjelaskan penyisipan / orientasi molekul dalam
lingkungan membran. DPH pada dasarnya nonfluorescent dalam larutan air, namun
interaksinya dengan rantai asil molekul lipid mengarah untuk meningkatkan intensitas
fluoresensi dan fenomena ini dapat dimanfaatkan untuk menyelidiki interaksi biofisik
peptida yang akan mengarah pada perubahan lipid.TK9 berinteraksi dengan misel
DPC zwitterionic jauh lebih mudah, menyebabkan emisi fluoresensi DPH hampir
lima kali lebih besar daripada misel SDS. Dengan demikian, orientasi struktural
peptida di lingkungan misel mengarah ke paparan daerah hidrofobik dari molekul
lipid, pada gilirannya memungkinkan hubungan fisik dengan molekul DPH dalam
larutan.
3.4 Gangguan membran melalui uji kebocoran pewarna berbasis fluoresensi
dalam dua model mimik membran yang berbeda
Uji pewarna-kebocoran berbasis fluoresensi, selanjutnya membantu untuk
memahami aktivitas peptida yang mengganggu membran terhadap zwitterionic dan
mimik membran anionik. TK9 diharapkan menjadi motif yang diarahkan membran
dari protein virus yang akan bertanggung jawab atas fungsi pengganggu membran
yang sama. Dalam hal ini, mimalia membran mamalia (POPC dengan 30% kolesterol)
berfungsi sebagai LUZ zwitterionik yang disiapkan untuk mempelajari uji kebocoran
zat warna dan meniru membran bakteri, terdiri dari POPE dan POPG dalam
perbandingan 7: 3 yang berfungsi sebagai pasangan anionik.
3.5 TK9 memiliki afinitas pengikatan diferensial terhadap lingkungan misel
yang berbeda
 Kalorimetri titrasi isotermal (ITC) membantu menyediakan parameter
termodinamika seperti perubahan entalpi (ΔH), perubahan entropi (ΔS), perubahan
energi bebas Gibbs (ΔG) dan afinitas pengikatan (KD) untuk mempelajari fenomena
pengikatan reseptor-ligand. Oleh karena itu , telah dilakukan eksperimen ITC untuk
mengidentifikasi kekuatan termodinamika penting yang mendasari pengikatan TK9 ke
misel DPC. Perlu dicatat juga bahwa tanda negatif ΔH (ΔH = -3.05 × 104 ± 540.4
cal.mol-1) dan ΔS (ΔS = -76.5 cal.mol-1. K-1) menyarankan proses menjadi entalpi
didorong dan karenanya, interaksi hidrofobik, van der Waal, serta ikatan-H,
memainkan peran dominan untuk interaksi pengikatan ini. Afinitas pengikatan
kesetimbangan berada dalam mikromolar (KA = 4,33 × 10-5 ± 6,7 × 10-4 mol-1)
kisaran dan perubahan yang sesuai dalam energi bebas Gibbs adalah -6188,87
cal.mol-1, mendiktekan spontanitas proses. Data pengikatan juga sesuai dengan NMR
dan data uji kebocoran fluoresensi pewarna kami yang menunjukkan interaksi
hidrofobik yang signifikan di antara residu TK9 dan rantai asil lipid dalam misel
karena kedekatan fisik yang dekat dengan interior misel. Secara keseluruhan, temuan
ini menyoroti afinitas ikatan mikromolar dari TK9 dengan misel DPC zwitterionik di
mana interaksi hidrofobik memainkan peran penting dalam pengikatan. Percobaan
ITC dengan SDS, bagaimanapun, tidak praktis karena deterjen yang signifikan seperti
perilaku buih dari misel SDS.

4. KESIMPULAN
Studi ini menyoroti perspektif struktural resolusi tinggi dari interaksi membran
peptida TK9, yang berasal dari SARS CoV E-protein dalam dua lingkungan misel
yang berbeda. Dengan demikian, penelitian kami menekankan motif pendek 9-residu
dari TK9, yaitu, T55-K63, integral dengan wilayah heliks alpha terikat membran
terminal-C, memiliki peran fungsional langsung dalam identifikasi membran host dan
gangguan selanjutnya. TK9 mudah mengalami perubahan konformasi dengan adanya
misel peniru membran host, seperti yang dikonfirmasi oleh analisis spektroskopi CD.
Spesifisitas tinggi terhadap membran zwitterionik, dibandingkan dengan yang
bermuatan negatif, terlihat dari tes kebocoran zat warna yang menunjukkan
kecenderungan inheren TK9 untuk berinteraksi dengan mamalia yang bertentangan
dengan sel bakteri. Afinitas pengikatan antara peptida dan zwitterionik DPC
ditentukan berada dalam kisaran mikromolar seperti yang disarankan oleh eksperimen
ITC, yang juga mengungkapkan bahwa interaksi peptida-misel ini sebagian besar
diatur oleh pasukan van-der-Waal dan merupakan proses yang didorong oleh entalpi.
Lebih lanjut, percobaan solusi resolusi tinggi NMR menyatakan konformasi heliks
amphipathic dari TK9 di hadapan dua lingkungan misel. Bukti eksperimental diajukan
untuk hubungan kuat peptida dengan rantai asil dari molekul lipid. Namun, orientasi
fisik TK9 terbukti berbeda tergantung pada muatan membran target. Secara khusus,
motif "VYVY" dari peptida dimasukkan secara dalam ke inti hidrofobik dari lipid
DPC seperti diungkapkan oleh percobaan PRE. Patut dicatat untuk menyebutkan
bahwa motif TK9 yang sama ini telah ditunjukkan sebelumnya untuk dirakit sendiri
dalam larutan untuk membentuk fibrillar amyloid kaya beta-sheet yang dipesan nano-
assemblies.10 Dengan demikian, urutan peptida yang mendasari spesifisitas inang dan
afinitas juga diarahkan heliks. konformasi di hadapan membran yang mengarah ke
agregasi hilir dari unit protein dalam membentuk struktur pentamerik. Karena
diketahui bahwa beberapa peptida amiloidogenik mengganggu membran melalui
mekanisme agregasi diri, kecenderungan agregasi dari motif "VYVY" pada TK9
berkorelasi baik dengan fungsionalitas viroporin yang diperlihatkan oleh SARS CoV
E-protein dalam membran inang. Selain itu, di masa depan, mutan motif "VYVY"
menjadi sasaran studi kinetika pada agregasi TK9 di hadapan membran sel host yang
sesuai meniru LUV menggunakan teknik berbasis fluoresensi in vitro (misalnya uji
emisi Thioflavin T), dapat mengungkapkan signifikansi dari Peregangan 9-residu
protein-E dalam mediasi asosiasi membran inang dan kerusakan sel berikutnya, yang
sangat penting untuk perbanyakan virus.