I.

PENDAHULUAN
Enantiomer digunakan untuk menyataan hubungan antara dua molekul yang merupakan

bayangan cermin antara molekul satu dengan molekul yang lain. Sementara diastereomer
kebalikan dari enantiomer, yaitu isomer ruang antar molekul yang tidak merupakan bayangan
cermin satu sama lain. Isomer cis dan trans termasuk dalam golongan diastereomer.
Contoh senyawa enantiomer

Dalam pemisahan enantiomer kadang-kadang ditunjukkan sebagai pemisahan enantiomer

secara tidak langsung, melibatkan penggabungan enantiomer dengan reagen kiral tambahan
untuk mengubah molekul tersebut menjadi diastereomer.
Senyawa diastereomer tersebut kemudian dipisahkan dengan beberapa teknik pemisahan
akiral (2). Metode analisis yang sering digunakan pada pemisahan komponen senyawa kiral yaitu
HPLC, GC, TLC, dan Kapilari elektroforesis(3).
Golongan Fluorokuinolon adalah antibiotik yang sangat aktif, memiliki spectrum luas
dan banyak digunakan baik pada manusia maupun hewan(4). Fluorokuinolon memiliki kelebihan
karena dapat melawan berbagai jenis pathogen multiresisten disebabkan cara kerjanya yang
melalui target target yang berbeda dari golongan antimikroba lain. Mekanisme resistensi
fluorokuinolon juga tidak seperti kebanyakan mekanisme resistensi dari antibiotik lain, yaitu
tidak melalui plasmid atau integron(5).

Fluoroquinolones

adalah

satu-satunya

kelas

antibiotik

yang

secara

langsung

menghentikan sintesis DNA bakteri. Karena dapat diserap dengan sangat baik oleh tubuh,
fluoroquinolones dapat diberikan secara oral. Antibiotik ini dianggap relatif aman dan banyak
digunakan untuk mengobati infeksi saluran kemih dan saluran pernapasan. Namun,
fluoroquinolones diduga mempengaruhi pertumbuhan tulang. Itu sebab, obat ini tidak
direkomendasikan untuk wanita hamil atau anak-anak.. Efek samping yang sering timbul
meliputi mual, muntah, diare, dll(4).
Fluoroquinolone digunakan untuk berbagai indikasi seperti infeksi saluran kemih,
sinusitis, infeksi tulang dan sendi, infeksi saluran napas. Beberapa fluoroquinolone memiliki
aktivitas anti-pseudomonal (contohnya ciprofloxacin dan levofloxacin dosis tinggi) sementara
beberapa fluoroquinolone memiliki aktivitas terhadap S. pneumoniae (seperti levofloxacin,
moxifloxacin, dan gemifloxacin). Levofloxacin, moxifloxacin, dan gemifloxacin termasuk dalam
respiratory fluoroquinolone. Respiratory fluoroquinolone direkomendasikan oleh beberapa
guideline/panduan di US, Kanada, dan Eropa untuk terapi CAP (community acquired
pneumonia). Sebelum fluoroquinolone digunakan secara luas, cephalosporin generasi ketiga
merupakan terapi yang predominan untuk CAP. Baik fluoroquinolone maupun cephalosporin
generasi ketiga aktif terhadap S. pneumoniae, patogen yang sering menyebabkan CAP(4).
II.

LATAR BELAKANG PENELITIAN

Untuk mengidentifikasi agen spektrum antibakteri baru , mengidentifikasi fluorokuinolon

yang poten ,WCK 919 yang terdiri dari 2 enantiomer yaitu WCK 1152 dan WCK 1153, untuk
membedakan aktivitas dan toksisitas dari kedua isomer bakteri, disintesis dengan menggunakan
metode resolusi kiral(1).
Ditemukan bakteri Pneumococci, Viridans, Streptococcus dan Staphylococcus yang
resisten terhadap fluorokinolon. Penelitian ini dilakukan karena WCK 1152 menunjukkan
keuntungan lebih dari WCK 1153 dalam studi toksisitas pra-klinis. Karena toksisitas terkait
dengan WCK 1153, maka perlu untuk mengontrol dan memonitor toksisitas di WCK 1152.
Penelitian ini menjelaskan pengembangan dan validasi metode analisis baru, yang dapat
mendeteksi dan mengukur tingkat ketoksikan WCK 1153 di WCK 1152. Metode tersebut yaitu
derivatisasi diastereomers dengan penggunaan fase gerak kiral untuk menentukan kemurnian
2

enantiomer. Dalam metode derivatisasi , enantiomer direaksikan dengan reagen kiral untuk
membentuk sepasang diastereomer. Diastereomer tersebut memiliki sifat fisik yang berbeda ,
maka dapat dipisahkan dengan kromatografi normal phase atau reverse phase. Dalam penelitian
ini digunakan reversed phase chromatography yang menggunakan kolom C-18 dengan
derivatisasi golongan amine primer pada rantai samping WCK 1152 dan WCK 1153(1).
III.

TUJUAN
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode yang tepat dan akurat

untuk menentukan kemurnian enansiomerik dari WCK 1152 tanpa menggunakan fase diam kiral
yang mahal.
IV.

MATERIAL DAN METODE

WCK 1152 dan WCK 1153 disintesis oleh Medicinal Chemistry group, Drug Discovery,

Wockhardt Research Center. WCK 1152 dan

WCK 1153 diidentifikasi karakteristik dan

kemurniannya. Enantiomeri dari Prima facie dimonitoring dengan polarimeter dan dimurnikan.
Pada penelitian digunakan HPLC dengan golongan acetonitrile and methanol (Ranbaxy Fine
Chemicals Limited, India), golongan trifluoroacetic acid spectroscopy (E. Merck, Germany) dan
digunakan air terdestilasi ganda melalui Purelab classic (US Filters) (1).
A. Derivatisasi ( persiapan diastereomers)
Disiapkan WCK 1152 dan WCK 1153. Direaksikan dengan N-boc-L-proline pada Nethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ) dan triethylamine (TEA). Dilarutkan
dengan dichloromethane (DCM). Dilakukan pada suhu ruangan selama satu jam. Dianalisis
dengan HPLC(1).
B. Penyiapan larutan

Dilarutkan N-boc-L-proline-WCK 1152 dan N-boc-L-proline-WCK 1153 dengan

menggunakan metanol. Diambil 1 mg/ml untuk kuantifikasi(1).

C. Kondisi Kromatografi
Kromatografi kolom yang digunakan 2504.6mm ID YMC Pack ODS AM (YMC Co.
Ltd., Japan) dengan ukuran partikel 5 m. Fase gerak terdiri dari campuran buffer dan
acetonitrile dalam jumlah 55 ml : 45 ml. Buffer solution dibuat dengan cara melarutkan 0.5 ml
trifluoroacetic acid dalam 1000 ml aquades (pH buffer 2.1) Laju alir dari fase gerak adalah 1.25
ml/min . Suhu kolom dijaga pada 30C dan eluen kolom dideteksi pada 290 nm. Volume injeksi
sebesar 10 l(1).
V.

Validasi Metode

A. Kesesuaian Sistem
Disuntikkan campuran resolusi (1 mg / ml N-Boc-prolin turunan dari WCK 1152 dan 0,1
mg / ml N-Boc-prolin WCK derivatif 1153) sebanyak 6 kali. Kriteria kinerja metode resolusi
antara 2 puncak diastereomer harus tidak kurang dari 3,0. Faktor tailling tidak lebih dari 1,5
presisi (% RSD) dari waktu retensi dan luas area puncak dari 6 pengulangan masing-masing
harus kurang dari 0,1 dan 2,0%(1).
B. Linearitas
Respon Linearitas untuk turunan N-Boc-prolin WCK 1152 dan turunan N-Boc-prolin.
WCK 1153 ditentukan dalam kisaran 0,1 sampai 1,5 mg / ml (10 sampai 150% dari tes
konsentrasi larutan yaitu 1 mg / ml) dan 0,01-0,150 mg / ml (10 sampai 150% dari batas yang
ditentukan masing-masing yaitu 1% dari WCK 1153 di WCK 1152) (1).
C. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ)
LOD dan LOQ dari turunan N-Boc-prolin WCK 1152 dan turunan N-Boc-prolin WCK
1153 ditentukan dengan metode kurva kalibrasi. Solusi dari kedua diastereomer disusun dalam
kisaran 0005-0,05 mg / ml dan disuntikkan dalam rangkap tiga. Rata-rata luas area puncak dari
tiga analisis adalah diplot terhadap konsentrasi. LOD dan LOQ dihitung dengan menggunakan
persamaan, LOD = (Cq * SYX) / b , di mana, Cd / Cq = koefisien untuk LOD / LOQ, SYX =
varians residual dari regresi dan b= slope atau kemiringan. LOD dan LOQ dari turunan N-Bocprolin WCK 1152 dan turunan N-Boc-prolin WCK 1153 ditentukan dengan metode kurva
4

kalibrasi. Solusi dari kedua diastereomer disusun dalam kisaran 0005-0,05 mg / ml dan
disuntikkan dalam rangkap tiga. Rata-rata luas area puncak dari tiga analisis adalah diplot
terhadap konsentrasi. LOD dan LOQ dihitung dengan menggunakan persamaan, LOD = (Cq *
SYX) / b , di mana, Cd / Cq = koefisien untuk LOD / LOQ, SYX = varians residual dari regresi
dan b= slope atau kemiringan(1).
D. Presisi dan akurasi dan Ruggedness
Metode presisi ditentukan dengan preparasi perbedaan 6 penyuntikan dan menentukan %
RSD dari nilai-nilai murni. Metode akurasi ditentukan oleh % recovery. Turunan N-Boc-prolin
dari WCK 1153 dalam pra-analisis sampel turunan N-Boc-prolin WCK 1152 dan persen recovery
telah ditentukan. Metode Rugedness ditentukan dengan melakukan kuantifikasi turunan N-Bocprolin WCK 1153 pada dua sistem HPLC yang berbeda dan kolom dengan dua analisis. Metode
presisi ditentukan dengan preparasi perbedaan 6 penyuntikan dan menentukan % RSD dari nilainilai murni. Metode akurasi ditentukan oleh % recovery. Turunan N-Boc-prolin dari WCK 1153
dalam pra-analisis sampel turunan N-Boc-prolin WCK 1152 dan persen recovery telah
ditentukan. Metode Rugedness ditentukan dengan melakukan kuantifikasi turunan N-Boc-prolin
WCK 1153 pada dua sistem HPLC yang berbeda dan kolom dengan dua analisis(1).
VI.

Hasil

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode yang tepat dan akurat
untuk menentukan kemurnian enansiomerik dari WCK 1152. Fase gerak kiral yang digunakan
adalah Lphenylalanine, beta-siklodekstrin dan L-triptofan. Resolusi yang sangat baik (Rs = 4.08)
antara dua puncak dengan faktor tailing untuk N-Boc-prolin turunan dari WCK 1152 dan N-Bocprolin turunan dari WCK 1153 masing-masing adalah 1,04 dan 1,17. Persen recovery yang
didapat adalah 94.4%. RSD dari pengulangan injeksi yaitu 1,46% dan 1,51% untuk masingmasing diasteromers. Koefisien korelasi NBoc- turunan prolin WCK 1152 = 0,9971 turunan NBoc-prolin WCK 1153 = 0,9986 untuk N-Bocproline turunan dari WCK 1152 LOD = 0,0006
mg / ml LOQ = 0,0018 mg / ml. Untuk turunan N-Boc-prolin WCK 1153 LOD = 0,0007 mg /
ml LOQ = 0,0021 mg / ml. Dari metode ini didapat SD = 0,003 RSD = 1,64%(1).
Metode HPLC reverse phase yang sederhana, tepat, akurat dan rigid berdasarkan
derivatisasi dari enantiomer telah dikembangkan dan divalidasi untuk penentuan kuantitatif
enansiomer yang tidak diinginkan WCK 1153 dalam substansi obat baru WCK 1152. Metode ini
digunakan untuk memantau kemurnian enansiomer dari uji klinis batch WCK 1152, menentukan
setiap racemization dari WCK 1152 untuk WCK 1153 di uji klinis sampel pada serum dan urin
dengan langkah tambahan ekstraksi analit dari matriks biologis menggunakan ekstraksi fase
padat(1).
VII. KESIMPULAN
Metode ini digunakan untuk menentukan kemurnian enantiomer dalam uji klinis batch
dari WCK 1152. Didapatkan resolusi yang sangat baik (Rs = 4.08) antara dua puncak dengan
faktor tailing untuk N-Boc-prolin turunan dari WCK 1152 dan N-Boc-prolin turunan dari WCK
1153 masing-masing adalah 1,04 dan 1,17. Persen recovery yang didapat adalah 94.4%. RSD
dari pengulangan injeksi yaitu 1,46% dan 1,51% untuk masing-masing diasteromers. Koefisien
korelasi NBoc- turunan prolin WCK 1152 = 0,9971 turunan N-Boc-prolin WCK 1153 = 0,9986
untuk N-Bocproline turunan dari WCK 1152 LOD = 0,0006 mg / ml LOQ = 0,0018 mg / ml.
Untuk turunan N-Boc-prolin WCK 1153 LOD = 0,0007 mg / ml LOQ = 0,0021 mg / ml. Dari
metode ini didapat SD = 0,003 RSD = 1,64%

VIII. DAFTAR PUSTAKA

1. R. D. Yeole, R.D., Lawand, S. V., Bhavsar, S. B., Deshpande, P.K., 2008, HPLC Method
for Determination of Enantiomeric Purity of a Novel Respiratory Fluoroquinolone: WCK
1152, Indian J Pharm Sci, 70(3): 357361.
2. Davankov V.A., Analytical Chiral Seoaration Methods (IUPAC Recommendation 1997),
Nesmeyanov- Institute of Organo- Element Compounds, Russian Academy of Sciences
Moscow, Rusia, 1 [178] 13.
3. Fanali S., An Introduction Chiral Analysis by Capillary Electrophoresis, Instituto di
Cromatografia del Cansiglio Nazionale delle Recerche, Area delle Recerch di Roma.
4. Piddock, LJV, 1998, Fluoroquinolone Resistance, BMJ, 317: 1029-1030.
5. Soebandrio, A., Setiabudi, R., Widodo, D., Prodjosudjadi, W., Oloan,Tumbeleka, A.R.,
Fachruddin, D., Z., Priyanti, Abdurrachman, H., Gardjito,W., Aryani, V., Utji,
Prahasto, I.D., 2005, PenggunaanSiprofloksasin di Indonesia, HTI, 1.

R.,