LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS INSTRUMEN

“HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY”

DOSEN PENGAMPU :

Andi Nina Asriana, S.Si.M.Si

DISUSUN OLEH :

Kelompok 2 / 1F

• Chinta Paramita Nugrahini (2031410051)

• Dwi Ainur Rohmah (2031410060)

• Dwi Nurul Anggraeni (2031410024)

• Faidlotul Tri Al Habid (2031410094)

• Fitri Hidayatul Chomariyah (2031410101)

• Jihan Nur Salsabila (2031410082)

LABORATORIUM ANALISIS INSTRUMEN

D-III TEKNIK KIMIA

JURUSAN TEKNIK KIMIA

POLITEKNIK NEGERI MALANG

 DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL.................................................................... iii

DAFTAR GAMBAR............................................................... iv

A. Judul…………………………………………………..

B. Tanggal Pelaksanaan …………………………...…….

C. Tujuan Percobaan………………………………………

D. Dasar Teori…………………………………………..

E. Alat dan Bahan………………………………………

F. Prosedur Kerja……………………………………….

G. Data Pengamatan……………………………………..

H. Pembahasan………………………………………….

I. Simpulan……………………………………………..

J. Daftar Pustaka……………………………………….

Lampiran.................................................................................
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
A. JUDUL
High Performance Liquid Cromatography (HPLC)

B. TANGGAL PELAKSANAAN :
RABU, 14 APRIL 2021

C. TUJUAN PERCOBAAN
1. Mempelajari cara kerja HPLC
2. Menganalisa sampel secara kualitatif dan kuantitatif dengan alat HPLC

D. DASAR TEORI
Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh Tswett pada tahun 1903, ia
menggunakannya untuk pemisahan senyawa-senyawa berwarna dan nama
kromatografi diambil dari senyawa-senyawa yang berwarna. Senyawa berwarna yang
digunakan Tswett sebagai sampel adalah pigmen-pigmen daun, karena warnanya
maka cepat terlihat lokasinya dalam kolom. Saat ini kromatografi tidak lagi digunakan
untuk pemisahan senyawa-senyawa berwarna saja. Senyawa-senyawa tidak berwarna
dapat dilihat melalui fluoresensi dalam sinar ultraviolet. Pada dasarnya semua teknik
kromatografi menggunakan dua fasa, yaitu fasa diam (stationary) dan fasa gerak
(mobile); pemisahan-pemisahan tergantung pada gerakan relative dari dua fasa ini.
Perlu diperhatikan bahwa fasa gerak yang digunakan tidak mempunyai efek terhadap
fasa diam atau hanya sangat lemah diserap oleh fasa diam. Salah satu jenis
kromatrografi yang sering digunakan adalah HPLC. HPLC atau High Performance
Liquid Chromatography adalah sebuah instrumen yang menggunakan prinsip
kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang dialirkan
melalui 2 kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor dengan bantuan
pompa. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Di
dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar atas dasar
kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi antara
senyawa terhadap fase diam. Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan
fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat
dengan fase diam akan keluar lebih lama. Senyawa yang keluar dari kolom akan
dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Dari
 kromatogram tersebut akan dapat di identifikasikan waktu retensi (tR) dan luas
area/tinggi puncak. Informasi tR digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan
informasi luas area atau tinggi puncak untuk analisis kuantitatif. HPLC terdiri dari
fase gerak, pompa, injektor, kolom, detektor dan pengolah data.

Gambar 1. Skema instrumen HPLC Fase gerak (eluen) berupa zat cair.

E. ALAT & BAHAN

No Alat Bahan
.
1. Air
HPLC
2. Methanol
Personal Computer
3. Rutin
Alat suntik
4. Quercetin
UV-VIS Detector
5.
Printer

TABEL 1. ALAT & BAHAN

F. PROSEDUR KERJA
1. Persiapan
a. Mengisi botol penampung (A) dengan pelarut campuran Methanol : Air (15 :
85) dan penampung (B) campuran Methanol : Air (85 : 95) sebagai fasa
pembawa (gerak).
b. Menghidupkan alat dengan menekan ke bawah tombol on/off pada bagian
belakang sebelah kanan.
 c. Hidupkan detektor UVIS 200 dengan menekan tombol on/off pada bagian
belakang sebelah kanan dan atur pada panjang gelombang 254 nm, RANGE
(AUFS) pada 0,0005 dan RISE TIME pada 0,1 detik.
d. Hidupkan personal komputer dengan program Windows 3.1, kemudian pilih
menu Chromatography, lalu click HPLC , click OK, ketik “lab” pada User
Name, ketik “1” pada password, lalu click OK, click HPLC.
2. Analisis
a. Melakukan “purging” untuk mengeluarkan gas dari saluran, dengan membuka
tutup depan HPLC, putar ke kiri (membuka) kran purging, tekan tombol
“PURGE” “D”.
b. Tunggu sampai gelembung dan fasa pembawa lain keluar, lalu tekan
“PUMP/STOP”. Tutup kembali kran purging.
c. Mengatur laju alir fasa pembawa pada 3 ml/menit dengan menekan “FLOW”
“A” “100” “ENTER”. Tekan kembali “FLOW” “1” “ENTER”
d. Menyuntikkan sampel Rutin (min. 20 mikro) pada posisi tuas “INJECT”.
e. Atur menu mulai merekam pada monitor, menggerakkan tuas dari INJECT ke
LOAD, menekan PUMP dan ENTER (pada PC) secara serentak. Lihat
petunjuk program HPLC
f. Mengamati sinyal yang tergambar pada monitor.
g. Lakukan kembali dengan menyuntikkan sampel Quercetin dan campuran
seperti pada langkah 4 - 6.
h. Menentukan jenis dan kadar sampel setelah proses analisis selesai.
G. Data Pengamatan
 Data pengamatan

 Perhitungan

No Peak Name RT Area % Area Height

1 Klorobenzena 1,358 117868 31,664 0,012

2 Toluen 1,908 112631 30,257 0,011

3 Eugenol 3,742 87220 23,431 0,007

4 Fenol 4,592 54529 14,648 0,003

- Konsentrasi KloroBenzena = %Area x konsentrasi sampel

= 31,664 x 0,1 ppm

= 3,1664
 - Konsentrasi Toluen = %Area x konsentrasi sampel

= 30,257 x 0,1 ppm

= 3,0257

- Konsentrasi Eugenol= %Area x konsentrasi sampel

= 23,431 x 0,1 ppm

= 2,3431

- Konsentrasi Fenol = %Area x konsentrasi sampel

= 14,648 x 0,1 ppm

= 14,648

H. Pembahasan
1. Cara Kerja HPLC
- Suatu kolom yang berisi fasa diam kemudian ada sampel dengan mekanisme
tertentu yang di masukkan pada kolom,sampel di masukkan kemudian di
injeksikan fase geraknya lalu akan terpisah tergantung dari interaksi molekul
tersebut terhadap fasa diam dan fasa geraknya separasi di pisahkan menjadi 3
komponen yaitu,komponen merah kuning biru kalau analisa mengandung
komponen merah kuning biru.
- Kemudian sampel masuk detector biasanya menggunakan UV VISIBLE
detector molekul yang udah di pisahkan di interaksikan dengan cahaya pada
dalam detecktor masing masing molekul akan beda responnya di gunakan
detector itu lebih spesifik kromatogram yang keluar ada data adsorbansi
- Ketika kita menggunakan hplc kita harus memperhatikan pelarutnya karna
yang di cari pelarut harus khusus hplc pelarut tidak boleh mengandung
pengotor apapun,tidak boleh mengandung endapan.sampel yang di injeksikan
harus di Sentrifus terlebih dahulu agar padatan padatan dapat berpisah dengan
 larutan yang akan di injeksikan di karena kapilernya sangat kecil jika ada
padatan yang masuk akan terjadi sumbatan dan akan merusak kolom
2. Kepolaran Senyawa
Kepolaran senyawa adalah perilaku suatu zat yang menyerupai medan
magnet, yaitu terdapat kutub sementara yang disebut dipol. Kepolaran senyawa
terdapat pada senyawa kovalen, dan dibagi menjadi dua, yaitu:
a. Senyawa kovalen polar
Senyawa kovalen yang dibentuk oleh dua unsur berbeda, dimana
keelektronegatifan pasti berbeda, sehingga menghasilkan dipol.
- Ciri-ciri senyawa polar :
1) Dapat larut dalam air dan pelarut polar lain
2) Memiliki kutub( +) dan kutub (-) , akibat tidak meratanya distribusi
electron
3) Memiliki pasangan elektron bebas (bila bentuk molekul diketahui) 
atau memiliki perbedaan keelektronegatifan.
4) Contoh: HCl, HBr, HI, H2O.

a. Senyawa kovalen non-polar

Senyawa kovalen yang dibentuk oleh dua unsur sama, dimana
keelektronegatifan pasti sama.
- Ciri-ciri senyawa non polar :
1) Tidak larut dalam air dan pelarut polar lain.
2) Tidak memiliki kutub (+) dan kutub (-) , akibat meratanya distribusi
elektron.
3) Tidak memiliki pasangan elektron bebas (bila bentuk molekul
diketahui) atau keelektronegatifannya sama
4) Contoh: H2, Cl2, O2, N2, dan senyawa poliatomik lainnya.
3. Tingkat Kepolaran
Tingkat kepolaran senyawa dinyatakan dalam momen dipol dalam satuan
Coulumb meter. Senyawa non-polar memiliki momen dipol nol. Senyawa polar
memiliki perbedaan keelektronegatifan yang besar, perbedaan harga ini mendorong
timbulnya kutub kutub listrik yang permanen (dipol permanent). Jadi antar molekul
polar terjadi gaya tarik dipol permanent.
 Senyawa non polar memiliki perbedaan keelektronegatifan yang kecil bahkan
untuk senyawa biner dwiatom, seperti : O2, H2. Dengan perbedaan
keelektronegatifan = 0. Bila terdapat senyawa non polar terjadi gaya Tarik dipol
sesaat (gaya disperse/gaya London) gaya ini akibat muatan + inti atom salah satu
atom menginduksi electron atom lain sehingga terjadilah kutub-kutub yang sifatnya
sesaat.
Dari oluen yang dipakai dalam praktikum system HPLC ada methanol dan
H2O. Dimana kedua oluen tersebut memiliki tingkat kepolaran yang berbeda.
Dimana dari oluen memiliki sifat kepolaran sebagai pelarut polar. Sehingga dimana
fenol, toluene, eugenol, dan klorobenzena dimana berperan sebagai sampel akan
melewati oluen. Dimana fenol akan tertahan atau paling lama keluar dari oluen
dikarenakan fenol bersifat polar. Sehingga jika diaplikasikan dengan oluen yang
bersifat polar akan mengalami kelarutan. Kemudian pada urutan pertama yang
akan memisah adalah klorobenzena. Klorobenzena merupakan senyawa yang
bersifat non polar, sehingga kelarutannya dengan air kecil. Sedangkan urutan
kedua yaitu toluene, toluene sedikit larut dengan air tetapi bersifat non polar.
Kemudian urutan ketiga, yaitu eugenol. Eugenol bersifat non polar tetapi
kelarutannya dengan air dan methanol besar, sehingga akan mengalami sedikit
keterlambatan dalam pemisahan.
4. Penggunaan Sampel
Sampel yang digunakan dalam percobaan ini, sebagai berikut:
a. Fenol
Fenol atau hydroxybenzene dengan rumus molekul C6H5OH dan memiliki
berat molekul sebesar 94, 11 g/mol merupakan komponen campuran yang
memiliki satu atau lebih gugus hidroksil yang terikat pada cincin aromatik. Pada
suhu ruang fenol memiliki ciri fisik berupa kristal putih dan perlahan berubah
menjadi berwarna merah muda apabila terkena paparan panas atau cahaya.
Fenol juga memiliki bau khas yaitu berbau manis. Dalam kelarutannya, zat ini
sedikit sukar larut dalam air pada suhu 0-65 ℃ dan melarut sempurna pada suhu
diatas 65,3 ℃. Fenol sangat larut dalam alkohol, benzene, klorofom, eter, dan
hampir semua jenis pelarut organik. Fenol juga biasa disebut asam karbolat,
asam fenat, asam fenitilat, fenil hidroksida, fenil hidrokksida, atau
oksibenezena. (Othmer,1962)
 Gambar 1. Fenol

b. Toluen
Toluena memiliki bentuk liquid atau cairan yang tidak berwarna atau
bening. Senyawa ini memiliki aroma yang tajam dan sangat mudah terbakar.
Jika dibandingkan dengan air, toluena memiliki densitas yang lebih rendah
daripada air yakni sebesar 867 kg/m3. Sifat kelarutannya dalam air yakni sedikit
larut dalam air karena senyawa ini termasuk dalam golongan senyawa
hidrokarbon sehingga kepolarannya cenderung rendah. Hal itulah yang membuat
toluena tidak akan bercampur dalam air dan akan membentuk dua lapisan.
Selayaknya minyak yang dicampur dengan air, toluena akan membentuk dua
lapisan jika berada dalam air. Toluena akan
berada di atas air karena memiliki densitas
atau massa jenis yang lebih rendah
dibandingkan dengan air. Sifat toluena
ini sedikit mirip dengan minyak karena
memang berasal dari minyak bumi.

Gambar 2. Toluen
c. Iodineol
Eugenol (C10H12O2), merupakan turunan guaiakol yang mendapat tambahan
rantai alil, dikenal dengan nama IUPAC 2-metoksi-4-(2-propenil)fenol. Ia dapat
 dikelompokkan dalam keluarga alilbenzena dari senyawa-senyawa fenol.
Warnanya bening hingga kuning pucat, kental seperti minyak . Sumber alaminya
dari minyak cengkih. Terdapat pula pada pala, kulit manis, dan salam. Eugenol
sedikit larut dalam air namun mudah larut pada pelarut organik. Aromanya
menyegarkan dan pedas seperti bunga cengkih kering, sehingga sering menjadi
komponen untuk menyegarkan mulut.

Gambar 3. Eugenol
d. Klorobenzena
Klorobenzena adalah senyawa  turunan benzena dengan rumus kimia
C6H5Cl. Senyawa ini memiliki warna bening (colorless) dan mudah terbakar.
Klorobenzena dapat diperoleh dengan cara mereaksikan fenol dan fosfor
pentaklorida. Klorobenzena tidak larut di dalam air serta memiliki titik leleh –45
°C dan titik didih 131 °C. Klorobenzena banyak digunakan dalam pembuatan
pestisida, seperti DDT yang penggunaannya telah dilarang di seluruh dunia.
Senyawa ini juga digunakan dalam pembuatan fenol. Saat ini, klorobenzena
digunakan sebagai produk antara pada pembuatan nitroklorobenzena dan
difeniloksida. Nitroklorobenzena dan difeniloksida merupakan bahan baku
pembuatan herbisida, zat pewarna, dan karet. Klorobenzena juga digunakan
sebagai pelarut dalam kimia organik, di antaranya pelarut untuk cat. 
Gambar 4. Klorobenzena
I. Daftar Pustaka

 Ardiansyah, Retno. (2009) Penggunaan High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) Dalam Proses Analisa Deteksi Ion. Vol 10 no 4
 Murningsih, Tri dkk. (2000). Mengenal HPLC: Perannanya Dalam Analisa Dan
Proses Isolasi Bahan Kimia Alam. Vol 5 no 2