LAPORAN RESMI

HPLC

(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

TANGGAL : 13 MARET 2019

Oleh :

KELOMPOK 2 DAN 4 (1A/D4)

AMILDHA AMALIA FURQON ISLAMY (04)

ASTRIA NUR AFIFAH (05)

CHANDRA MAULANA (06)

JAMILATUS SA’DIYAH (13)

MASITA RACHMAWATI (14)

MOCH.ICHSAN ARDIANSYAH (15)

 POLITEKNIK NEGERI MALANG

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang :

Analisis adalah suatu kegiatan yang dilakukan untuk memeriksa,mengidentifikasi, menentukan

suatu zat dalam suatu cuplikan. Dalam menganalisa terdapat 3 aspek komprehensif yaitu
pengumpulan data, proses pengolahan data (interpretasi), dan pengambilan keputusan atau
kesimpulan.Dalam melakukan analisis, terbagi menjadi 2 metode, yaitu metode klasik dan
metode instrumental. Dan yang akan dibahas dalam tulisan ini adalah metode instrumental.

Analsis Instrumen adalah ilmu yang mempelajari tentang komponen-komponen instrumen

dan identifikasi suatu sampel baik secara kualitatif maupun kuantitatif (Jamaluddin, 2012).
Dalam hal ini instrument yang akan dibahas yaitu HPLC (High Performance Liquid
Chromatography). Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat
atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal
istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair,
maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography).

1.2 Tujuan Percobaan :

- Mempelajari cara kerja alat HPLC
- Menganalisa sampel secara kualitatif dan kuantitatif dengan alat HPLC
 BAB II

Tinjauan Pustaka

Kromatografi (Chromatography) berasal dari bahasa Yunani. Chroma

berarti warna dan graphein berarti menggambar. Hal ini pertama kali
diperkenalkan oleh seorang ahli botani Rusia Mikhail Tswett. Pada saat itu
sekitar permulaan abad 20, Tswett memisahkan campuran berbentuk cair
melalui kolom. Kolom yang digunakan memiliki spesifikasi sebagai berikut.

- Diameter kolom antara 1 hingga 5

cm. - - Panjang kolom antara 50
hingga 500 cm.

- Laju alir cairan sekitar 0,1 ml

permenit.

Ukuran butiran padatan pengisi (packing) antara 150-200 mikro.

Gambar 1. Sistem kerja HPLC

Melalui kolom tersebut, campuran yang dipisahkan mengalami elusi

(elution)

yaitu proses pelarutan dan pemisahan zat terlarut (sampel) dengan

penambahan pelarut segar (fresh solvent). Dengan terjadinya hal tersebut,
maka komponen penyusun campuran akan terpisah satu persatu tergantung
gaya interaksinya dengan pelarut segar dan permukaan butiran padatan
pengisi. Komponen yang mudah larut dalam pelarut segar dan memiliki
kepolaran yang sangat berbeda dengan permukaan butiran padatan pengisi
akan terpisah terlebih dahulu. Sebaliknya, komponen yang sukar larut dalam
pelarut segar dan memiliki kepolaran yang sama dengan permukaan butiran
padatan pengisi akan terpisah paling akhir.

Klasifikasi kromatografi dapat dilakukan berdasarkan beberapa kriteria.

Jika berdasarkan pada bentuk tempat butiran padat, kromatografi
diklasifikasikan menjadi dua, yaitu Kromatografi kolom dan Kromatografi
planar

Jika diklasifikasikan berdasarkan bentuk pembawanya, kromatografi juga

dibagi dua, yaitu :Kromatografi cair (liquid chromatography) dan Kromatografi
gas (gaschromatography)

Dari dua cara klasifikasi tersebut, secara umum terdapat dua hal pokok
yang selalu ada pada kromatografi yaitu adanya fasa diam (stationery fase)
dalam hal ini diwujudkan pada butiran padatan atau packing, dan fasa
bergerak (mobile fase) baik berupa cairan maupun gas pembawa.

Selanjutnya, kromatografi kolom yang menggunakan fase gerak cair

dapat diklasifikasikan lagi berdasarkan cara pemisahannya menjadi empat,
yaitu : Kromatografi Partisi, Kromatografi Adsorpsi, Kromatografi Pertukaran
ion, Kromatografi Eksklusi
 Jika kembali pada cara dan alat yang digunakan oleh Tswett, maka proses
pemisahan tersebut memerlukan waktu yang sangat lama, mulai beberapa jam
hingga beberapa hari. Untuk mempercepat pemisahan, pernah dilakukan
dengan menambah tekanan dan penghisapan menggunakan pompa vakum.
Tetapi cara tersebut dianggap kurang berhasil karena menyebabkan
penurunan mutu data yang diperoleh.

Pada awal tahun 1960, muncul pemikiran baru untuk melakukan

pemisahan dengan menggunakan spesifikasi alat yang relatif lebih kecil, yaitu :

Diameter kolom antara 1 hingga 5

mm. Panjang kolom antara 30
hingga 50 cm.

Laju alir cairan dapat mencapai 10 ml per

menit. Ukuran packing hanya 6 mikron.

Dengan alat dan cara tersebut diperoleh efisiensi pemisahan yang jauh lebih
baik. Waktu yang diperlukan hanya dalam ukuran menit, cairan pembawa yang
digunakan jauh lebih sedikit dan mutu data yang diperoleh jauh lebih baik.
Oleh karena itu, alat dan cara ini disebut High Performance Liquid
Chromatography (HPLC).

Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari variabel
yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan
untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di
atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.Menghilangkan gas (gelembung
udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC yang menggunakan pompa bolak
balik(reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai
100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di
dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless).
Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitif
terhadap udara (contoh :kolom berikatan dengan NH2). (Effendy De Lux Putra, 2004: 7-8)
Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:
 Reservoir (wadahpelarut / cairan)
 Pompa
 Sisteminjeksisampel
 Kolom, terdiridari
1. KolomAnalitik / KolomUtama
2. Kolom Guard
3. Termostat
 Detektor
 Komputer (Pengolah data)
 Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan dalam
pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-masing reservoir dihubungkan kepada
katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur cairan-cairan yang masuk /
dipompa kedalam kolom.
Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa. Pelarut
dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom. Pompa yang digunkan
dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut:
1) Harusmemilikialiranterkontrol yang ‘reproducible’
2) Harusmenghasilkanaliran yang ‘pulse-free’ (bebaspulsa, tidakmenghasilkangelembung)
3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil
(R.P. Budhiraja, 2004: 172)
Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel dapat
diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu, sampel
dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan tersedia pada volume 0,5
mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop terisolasi dari fasa gerak dan
terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan kapasitas beberapa kali dari loop sampling
digunakan untuk menempatkan sampel kedalam loop.
Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel dengan
diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30 mm sampai
300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel silika berpori yang
dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai tempat pemisahan
berlangsung.
 Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa hidupnya.
Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel menurunkan performa kolom
karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang. Kedua, material partikulat yang diinjeksikan
bersama sampel dapat menyumbat kolom analitik. Maka dari itu, kolom guard ditempatkan
sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi masalah-masalah tersebut. Kolom guard biasanya
berisi material partikulat packing dan fasa diam yang sama dengan kolom analitik, namun jauh
lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5 mm dan harganya satu persepuluh dari kolom analitik.
Hal ini dikarenakan kolom guard digunakan sebagai “tumbal” dan diganti secara berkala.
Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor ini
berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektor-
detektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:
 DetektorSpektroskopi (adsorpsisinar UV)
 Detektorelektrokimia
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index refraksi dari
fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponen-komponen fasa gerak
memiliki index refraksi yang mirip.(Harvey David, 2000: 578-585)

Keuntungan KCKT/HPLC
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal
kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya.
Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat
dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan
utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan
peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada
KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang
umumnya digunakan.KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi
cair klasik, antara lain:
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan
sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisis kurang dari
5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-
detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram(10-12 gram).
Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga
digunakan dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom
yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang
digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat – zat yang tidak bisa dianalisis
dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisi spsesies ionik.
KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat –zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan
destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.Solvennya dapat
dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukarion memerlukan prosedur
khusus. (Effendy De Lux Putra, 2004: 8)
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC
didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan
luas/area standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila
hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka pembandingaan dilakukan dengan
menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam satu tablet obat
yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan
senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik senyawa ini memungkinkan analisis dengan
teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-28 dan fasagerak polar campuran
beberapa pelarut.

(Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 2015: 1)

BAB III

Metode Percobaan

1. Alat dan Bahan

1.1.Alat
 HPLC  Printer
 UV-VIS Detektor  Alat suntik
 Personal Komputer
1.2.Bahan
 Methanol
 Eugenol
 Air
 Toluena
 Nitrobenzena
 Fenol
2. Cara Kerja
A. Persiapan
A.1. Mengisi botol penampung (A) dengan pelarut campuran Methanol : Air (85 : 15)
dan penampung (B) campuran Methanol : Air (85 : 95) sebagai fasap embawa (gerak).
A.2. Menghidupkan alat dengan menekan kebawah tombol on/off pada bagian belakang
sebelah kanan.
A.3. Hidupkan detektor UVIS 200 dengan menekan tombol on/off pada bagian belakang
sebelah kanan dan atur pada panjang gelombang 254 nm, RANGE (AUFS) pada 0,0005
dan RISE TIME pada 0,1 detik.
A.4. Hidupkan personal computer dengan program Windows 3.1, kemudian pilih menu
Chromatography, lalu click HPLC , click OK, ketik “lab” pada User Name, ketik “1”
pada password, lalu click OK, click HPLC

B. Analisis
B.1. Melakukan “purging” untuk mengeluarkan gas dari saluran, dengan membuka tutup
depan HPLC, putar ke kiri (membuka) kran purging, tekan tombol “PURGE” “D”.
B.2. Tunggu sampai gelembung dan fasa pembawa lain keluar, lalu tekan
“PUMP/STOP”. Tutup kembali kran purging.
B.3. Mengatur laju alir fasa pembawa pada 3 ml/menit dengan menekan “FLOW” “A”
“100” “ENTER”. Tekan kembali “FLOW” “1” “ENTER”
B.4. Menyuntikkan sampel Rutin (min. 20 mikro) pada posisi tuas “INJECT”.
B.5. Atur menu mulai merekam pada monitor, menggerakkan tuas dari INJECT ke
LOAD, menekan PUMP dan ENTER (pada PC) secara serentak. Lihat petunjuk program
HPLC
B.6. Mengamati sinyal yang tergambar pada monitor.
B.7. Lakukan kembali dengan menyuntikkan sampel Quercetin dan campuran seperti
pada langkah B.4 - B.6.
B.8. Menentukan jenis dan kadar sampel setelah proses analisis selesai.
 BAB IV

Pembahasan

PEMBAHSAN OLEH AMILDHA AMALIA (06)

Pada percobaan ini, kolom yang digunakan adalah non polar (reverse phase). Fresh
solvent atau fase gerak yang digunakan adalah larutan campuran methanol dan air dengan
komposisi tertentu. Kepolaran fase gerak diatur melalui pengaturan komposisi fresh solvent-
nya. Methanol dan air, keduanya merupakan pelarut polar. Akan tetapi, air memiliki kepolaran
yang lebih tinggi dari pada methanol. Sehingga untuk menambah kepolaran larutan fase gerak,
maka pada komposisi fresh solvent yang digunakan komposisi airnya ditambahkan, yang pada
awalnya hanya 85 methanol : 15 air, ditambahkan air hingga komposisinya menjadi 75
methanol : 25 air. Sehingga kepolarannya bertambah pula. Pada HPLC menggunkan beberapa
zat yaitu fenol, eugenol, toluene, nitrobenzene. Empat senyawa diantaranya adalah turunan
dari benzene yaitu fenol, toluene, eugenol dan nitrobenzene. Fenol mempunyai rumus molekul
C6H5OH yang bersifat non polar. Kedua adalah toluene yaitu senyawa turunan benzene yang
salah satu atom hidrogennya tersubstitusi oleh gugus metil dengan rumus molekul C6H5CH3.
Toluene biasanya digunakan untuk pelarut. Senyawa ketiga yaitu nitrobenzene dengan rumus
senyawa C6H5 NO2 yang bersifat nonpolar. Sedangkan eugenol merupakan senyawa yang
terkandung dalam minyak cengkeh yang memberikan aroma yang khas pada minyak cengkeh
dengan nama IUPAC adalah 2-metoksi-4-(2-propenil)fenol dengan rumus molekul (C10H12O2).
Senyawa ini tidak larut dalam air tapi larut sempurna dalam pelarut organic. Sehingga eugenol
ini merupakan senyawa yang bersifat non polar. Struktur benzena Struktur nitrobenzene
Struktur eugenol Struktur fenol. Didapatkan data tingkat kepolaran komponen-komponen
tersebut dari literature bahwasanya kepolaran tertinggi Fenol> Nitro benzene > Benzena >
Eugenol.

Adapun indeks kepolaran masing-masing senyawa, diantaranya :

 Metanol : 6,6
 Fenol: 5,2
 Nitrobenzena : 4,5
 Toulena : 2,4
 Eugenol : - (dikarenakan sifatnya yang nonpolar)
Pada awalnya sampel diinjeksikan kedalam injector. Kemudian terdapat fase gerak yang
membawa sampel menuju kolom yang berisi fase diam. Karena fase geraknya bersifat polar dan
fase diamnya bersifat non polar, maka komponen yang lolos terlebih dahulu merupakan
komponen yang mudah larut dalam fase gerak (hidrofilik), dan memiliki kepolaran yang sangat
berbeda dengan fase diamnya. Dengan kata lain, komponen yang terdeteksi oleh detector
terlebih dahulu adalah komponen yang memiliki tingkat kepolaran yang paling tinggi diantara
komponen lainnya. Komponen-komponen tersebut tergambar dalam bentuk peakpeak

pada kromatogram. Pada percobaan 1 dengan komposisi pelarut segar Methanol : Air = 85 : 15
merupakan pelarut segar yang tidak begitu polar memberikan hasil peak yang masih belum
terpisah secara sempurna menjadi 4 peak. Melainkan hanya muncul 2 peak pada kromatogram
dengan salah satu peaknya lebih besar dibanding peak lainnya. Hal tersebut terjadi karena
tingkat kepolaran pelarut segarnya yang masih belum mampu memisahkan komponen yang
terdapat dalam sampel berdasarkan kepolaran masing-masing komponen.

Pada percobaan 2 dengan komposisi pelarut segar Methanol : Air = 75 : 25. Pada pelarut
segar ini, komposisi air sudah ditambahkan menjadi 25. Sehingga pelarut segar ini
memilikikepolaran yang lebih tinggi dibanding pelarut segar pada percobaan 1. Pada hasil
percobaan ini, terlihat 3 peak yang saling berdekatan. Sehingga, percobaan 2 dikatakan masih
belum berhasil memisahkan komponen-komponen sampel.

Pada percobaan 3 dengan komposisi pelarut segar Methanol : Air = 65 : 35. Pada pelarut segar
ini, komposisi air sudah ditambahkan menjadi 35. Sehingga pelarut segar ini memiliki kepolaran
yang lebih tinggi dibanding pelarut segar pada percobaan 1 dan 2. Pada hasil percobaan ini,
terlihat 4 peak yang saling berdekatan. Sehingga, percobaan 3 dikatakan masih belum berhasil
memisahkan komponen-komponen sampel.

Pada percobaan 4 dengan komposisi pelarut segar Methanol : Air = 55 : 45. Pada pelarut segar
ini, komposisi air sudah ditambahkan menjadi 45. Sehingga pelarut segar ini memiliki kepolaran
yang lebih tinggi dibanding pelarut segar pada percobaan 1,2, dan 3. Pada hasil percobaan ini,
terlihat 4 peak yang tidak saling berdekatan. Sehingga, percobaann 4 dikatakan berhasil
memisahkan komponen-komponen sampel. Sehingga kepolaran pelarut segar yang cocok
digunakan untuk memisahkan komponen-komponen pada larutan sampel adalah pelarut
dengan komposisi Methanol : Air = 55 : 45 . Peak yang pertama kali muncul merupakan fenol
karena fenol memiliki tingkat kepolaran yang paling tinggi dibanding komponen lainnya.
Kemudian yan kedua adalah nitro benzene, kemudian benzene, dan yang terakhir adalah
eugenol yang memiliki tingkat kepolaran paling rendah dibanding komponen lainnya
 NAMA : ASTRIA NUR AFIFAH

NIM : 1841420041

Pada praktikum HPLC ini menggunakan sampel yang tersusun oleh fenol, eugenol, toluene,
nitrobenzene. Empat senyawa tersebut adalah turunan dari benzene yaitu fenol, toluene,
eugenol dan nitrobenzene. Fenol mempunyai rumus molekul ( C6H5OH ) yang bersifat non
polar. Kedua adalah Toluene yaitu senyawa turunan benzene yang salah satu atom hidrogennya
tersubstitusi oleh gugus metil dengan rumus molekul (C6H5CH3 ). Toluene biasanya digunakan
untuk pelarut. Senyawa ketiga yaitu Nitrobenzene dengan rumus senyawa ( C6H5 NO2 ) yang
bersifat nonpolar. Sedangkan Eugenol merupakan senyawa yang terkandung dalam minyak
cengkeh yang memberikan aroma yang khas pada minyak cengkeh dengan nama IUPAC adalah
2-metoksi-4-(2-propenil)fenol dengan rumus molekul (C10H12O2). Senyawa ini tidak larut
dalam air tetapi larut sempurna dalam pelarut organik, sehingga euganol ini merupakan
senyawa yang bersifat nonpolar.

Komposisi yang digunakan yaitu pertama dengan komposisi perbandingan sampel 80 : 20

(Metanol : Air). Peak yang muncul masih dalam keadaan yang belum terpisah. Yang terdeteksi
hanya dua komponen yang dalam satu peak dalam kromatograf terdapat dua senyawa yang
bergabung. Pada percobaan ini terjadi overlap pada peak dikarenakan retention time yang
terlalu berdekatan hal ini terjadi karena kepolaritasan dari sampel menyerupai fase gerak
sehingga terjadi overlap. Peak pertama adalah data dari fenol yang memiliki tingkat kepolaran
yang paling tinggi sehingga fenol yang keluar pertama dibanding tiga senyawa yang lain. Peak
kedua adalah grafik dari nitrobenzene. Peak ketiga menggambarkan data dari senyawa Toluene,
dan pada peak keempat ini seharusnya eugenol tetapi tidak muncul peak tersebut.

Percobaan kedua yaitu menggunakan komposisi perbandingan sampel 70 : 30 (Metanol :

Air).Dari data dapat kita ketahui terdapat 4 buah peak. Tetapi pada percobaan ini antara peak
satu dengan yang lainnya masih berhimpitan dikarenakan retention time yang terlalu
berdekatan. Dengan urutan keluar yaitu fenol - nitrobenzene – toluene – eugenol. Peak
pertama adalah grafik dari fenol dengan RT 1.208. Peak kedua menggambarkan data dari
senyawa nitrobenzene dengan RT 1.358, peak toluene yang memiliki RT 1.442 .Selanjutnya
peak terakhir yaitu eugenol yang memiliki RT 1.892. Waktu yang digunakan dalam percobaan
kedua ini sama dengan percobaan pertama yaitu 10 menit. Dengan kecepatan 250.

Percobaan ketiga adalah percobaan ketiga dengan komposisi 60 : 40 (Metanol:Air). Dari

data dapat kita ketahui terdapat 5 buah peak. Pada percobaan kali ini hasil/data yang didapat
tidak sesuai dengan teori, karena bahan/komponen yang digunakan hanya 4, tetapi pada
kromatogram menghasilkan 5 peak. Peak pertama memiliki RT 1.033. Peak kedua dengan RT
1.217, peak ketiga memiliki RT 1.325. peak keempat yaitu memiliki RT 2.058 Selanjutnya peak
terakhir yaitu memiliki RT 2.808. Waktu yang digunakan dalam percobaan ketiga ini adalah
sebesar 10 menit. Dengan kecepatan 250.

Percobaan selanjutnya adalah percobaan keempat dengan komposisi 50 : 50 yaitu

terdapat 4 peak dari hasil kromatogram yang terlihat sangat jelas dan tidak berhimpitan peak
fenol muncul pada retention time 1.533. Peak nitrobenzene muncul pada retention time 2.183.
Toluene mulcul pada retention time 3.567. Dan eugenol muncul pada retention time 4.867.
selama 10 menit dengan kecepatan 250.

Berdasarkan hasil percobaan tersebut didapatkan bahwa pembanding air terhadap

sampel tidak efisien karena padamaka hasil chromatogram akan semakin terpisah hal ini
dikarenakan percobaan (60:40) mendapatkan hasil yang tidak sesuai dengan teori karena peak
yang dihasilkan berjumlah 5 sedangkan komponennya sebanyak 4. Pada literature yang
didapatkan sebuah teori bahwa semakin tinggi jumlah pembanding air terhadap sampel maka
hasil chromatogram akan semakin terpisah hal ini dikarenakan tingkat kepolarannya yang tinggi
sehingga mudah untuk dipisahkan.Sementara apabila jumlah pembanding air terhadap sampel
semakin sedikit maka hasil chromatogram semakin berdekatan, hal ini dikarenakan tingkat
kepolaran menurun sehingga cenderung bersifat non polar dan sulit untuk dipisahkan. Pada
proses kromatografi, kepolaran fase diam umumnya tidak berubah, maka variasi kepolaran
hanya bisa dibuat pada fase gerak. Analit yang memiliki sifat kepolaran yang sesuai dengan
kepolaran fase gerak akan cenderung terbawa oleh fase gerak tersebut sedangkan semakin
jauh kepolaran analit dengan kepolaran fase gerak maka semakin sedikit analit yang terbawa
oleh fase gerak tersebut
PEMBAHASAN OLEH CHANDRA MAULANA (1841420048)

Analsis kuantitatif HPLC didasarkan pada pengukuran luas atau area puncak dalam
kromatogram. Pada percobaan penentuan senyawa toluena, eugenol, nitro benzena dan fenol.
Terdapat pada injektor ke d:28. Metode yang digunakan pada pengujian ini adalah metode fasa
terbalik dimana fasa gerak yang digunakan ini bersifat relatif lebih polar daripada fasa
diamnya.

Pada fase gerak digunakan metanol dengan H2O karena kedua larutan tersebut memiliki
tingkat kepolaran yang berbeda, dimana tingkat kepolaran air atau H2O lebih besar dari pada
metanol. Fasa gerak yang digunakan adalah air dan metanol dengan perbandingan yang
berbeda” 85:15, 75:25, 65:35 dan55:45. Sedangkan fasa diamnya adalah kolom C-28 yang
bersifat non polar

Pada kromatograf pertama dimana perbandingan antara metanol dengan air adalah 85:15
dapat dilihat pik yang terbentuk tidak rapi dan belum terpisah, dimana rentang waktu pada zat
tersebut hampir tidak bisa dibedakan. Hal tersebut karena sifat kepolaran dari fase gerak yang
mendapatkan perbandingan yang sedikit, sehingga menyebabkan semua zat non polar mapun
polar tidak dapat dibedakan satu sama lain.

Pada percobaan kedua yang dibedakan pada perbandingan fase geraknya yaitu 75 :25.
Hampir sama dengan percobaan sebelumnya masih belum terlihat perbedaan rentang waktunya
pada setiap zat yang keluar. Pada kromatograf ini sudah terdapat empat pik tetapi hanya satu pik
yang terpisah dengan sempurna dan pik yang lainnya masih tergabung antara satu dengan yang
lainnya. Sehingga banyaknya larutan yang terkandung dalam suatu zat masih tidak bisa
dihitung. Hal ini dikarenakan kepolaran yang digunakan dalam fase gerak lebih besar daripada
percobaan pertama.

Pada percobaan ketiga digunkaan perbandingan fase gerak 65 : 35. Dimana pada
kromatograf ini sudah terlihat 4 pik yang tergambarkan. Tetapi masih terdapat himpitan pada
dasar pik antara pik satu dengan pik lain.
 Pada percobaan yang terakhir yaitu perbandingan fase geraknya yaitu 55 : 45 sudah di
dapatkan 4 pik yang sudah terpisah antara satu dengan yang lain. Hal ini karena air dalam fase
gerak kali ini sangat banyak sehingga zat yang tingkat kepolarannya rendah akan segera sampai
ke detector dan di rekam oleh kromatograf. Rentang waktu antara satu dnegan yang lainnya pun
sudah terpisah jauh
PEMBAHASAN OLEH JAMILATUS SA’DIYAH (1841420006)

Pada praktikum HPLC kali ini, menggunakan 4 sampel larutan yaitu toluene, eugenol,
nitrobenzena dan fenol. Nitrobenzena, fenol, dan toluena merupakan 3 senyawa turunan benzene
yang memiliki gugus fungsi NO2, OH, dan CH3. Sedangkan Eugenol merupakan senyawa yang
terkandung dalam minyak cengkeh. Perbandingan methanol dan air yang dipakai adalah adalah
85:15, 75:25, 65:35. 55:45.

Fase gerak yang digunakan berupa campuran larutan dalam sampel. Sedangkan fase diam
yang digunakan adalah kolom C-30 yang bersifat non polar. Oleh karena itu percobaan kali ini
menggunakan metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak yang digunakan bersifat polar
sedangkan fase diamnya bersifat non polar, dengan sistem elusi isokratik, artinya selama analisis
digunakan fase gerak dengan perbandingan pelarut berubah.Komposisi yang digunakan yaitu
pertama dengan komposisi perbandingan sampel 85 : 15 (Metanol : Air). Dari data dapat kita
ketahui terdapat 3 peak yang seharusnya 4 buah peak.Pada percobaan ini terjadi overlap pada
peak dikarenakan retention time yang terlalu berdekatan hal ini terjadi karena kepolaritasan dari
sampel menyerupai fase gerak sehingga terjadi overlap. Peak pertama adalah data dari fenol yang
memiliki tingkat kepolaran yang paling tinggi sehingga fenol yang keluar pertama dibanding tiga
senyawa yang lain. Peak pertama memiliki RT sebesar 1.142 dengan area 654690 dan persen
area 19.390%. Peak kedua adalah grafik dari nitrobenzene dengan RT 1.317 dengan area
1603833, persen area 47.501%. Peak ketiga menggambarkan data dari senyawa Toluene dengan
RT 1.517 area 1007380 persen area 29.836 %, dan pada peak keempat ini seharusnya eugenol
tetapi tidak muncul peak tersebut, hanya muncul seperti buku pada RT 1.706.Waktu yang
digunakan dalam percobaan pertama ini adalah 10 menit. Dengan kecepatan 250.

Percobaan kedua yaitu menggunakan komposisi perbandingan sampel 75 : 25 (Metanol :

Air).Dari data dapat kita ketahui terdapat 4 buah peak. Dengan urutan keluar yaitu fenol -
nitrobenzene – toluene – eugenol. Senyawa fenol memiliki RT 1.208 dengan area 1053186,
persen area 23.836%, nitrobenzene memiliki RT 1.358 area 324648 persen area 18.650% , dan
toluene memiliki RT 1.442 dengan area 1128709 persen area 25.545%.Senyawa eugenol
memiliki RT 1,892 dengan luas area 1061672,dan persen area 24.028%.Waktu yang digunakan
dalam percobaan kedua ini sama dengan percobaan pertama yaitu 10 menit. Dengan kecepatan
250.

Percobaan selanjutnya adalah percobaan ketiga dengan komposisi 60 : 40 (Metanol:Air).

Dari data dapat kita ketahui terdapat 4 buah peak. Peak pertama adalah grafik dari fenol dengan
RT 1.217 dengan area 176472, persen area 29.516 %. Peak kedua menggambarkan data dari
senyawa nitrobenzene dengan RT 1.408 area 160474 persen area 26.840%, peak toluene yang
memiliki RT 1.642 dengan area 137284 persen area 22.961 % .Selanjutnya peak terakhir yaitu
eugenol yang memiliki RT 2.492 dengan luas area 123667,luas area yaitu 20.684 %. Waktu yang
digunakan dalam percobaan ketiga ini adalah sebesar 10 menit. Dengan kecepatan 250.

Percobaan selanjutnya adalah percobaan keempat dengan komposisi 55 : 45 yaitu

(Metanol:Air). Dari data dapat kita ketahui terdapat 4 buah peak. Peak pertama adalah grafik dari
fenol dengan RT 1.533 dengan area 735795, persen area 20.743%. Peak kedua menggambarkan
data dari senyawa nitrobenzene dengan RT 2.183 area 1399993 persen area 39.467%, peak
toluene yang memiliki RT 3,567 dengan area 707219 persen area 19.937 % .Selanjutnya peak
terakhir yaitu eugenol yang memiliki RT 4.867 dengan luas area 704205 ,luas area yaitu 19.852
%. Waktu yang digunakan dalam percobaan ketiga ini adalah sebesar 10 menit. Dengan
kecepatan 250.

Berdasarkan hasil percobaan tersebut didapatkan bahwa semakin tinggi jumlah

pembanding air terhadap sampel maka hasil chromatogram akan semakin terpisah hal ini
dikarenakan tingkat kepolarannya yang tinggi sehingga mudah untuk dipisahkan.Sementara
apabila jumlah pembanding air terhadap sampel semakin sedikit maka hasil chromatogram
semakin berdekatan, hal ini dikarenakan tingkat kepolaran menurun sehingga cenderung bersifat
non polar dan sulit untuk dipisahkan
PEMBAHASAN OLEH MASITA RACHMAWATI (1841420002)

Pada praktikum ini digunakan alat HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
dan dilakukan untuk memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya
diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen yang
terdapat pada sampel (kuantitatif).

Sample yang digunakan merupakan campuran dari empat komponen, yaitu nitrobenzene
(C6H5NO2), eugenol (C10H12O2), toluena (C6H5CH3), dan fenol (C6H5OH). Fase diam yang
digunakan adalah kolom C-14 yang bersifat non-polar sedangkan fase geraknya berupa metanol
yang memiliki sifat polar. Sesuai dengan literatur tingkat kepolaran dari tertinggi ke terendah
adalah fenol, nitrobenzene, toluena, dan eugenol. Oleh karena itu, senyawa dengan tingkat
kepolaran tertinggi akan keluar terlebih dahulu, sesuai dengan prinsip suka-tidak suka.

Percobaan dilakukan selama sepuluh menit untuk setiap variable perbandingan metanol
dan air yang berbeda-beda sebanyak empat kali dengan kecepatan 200. Pada perbandingan
80:20, diperoleh tiga peak, pada 70:30 diperoleh lima peak, sedangkan pada perbandingan 60:40
diperoleh enam peak, hal tersebut menandakan masih ada komponen yang belum terpisah
sempurna. Pada perbandingan 50:50, diperoleh 4 bukit peak yang saling memisah satu sama lain.

Berdasarkan data hasil kromatogram, dapat diketahui bahwa perbandingan air dengan
metanol yang paling efektif untuk memisahkan komponen-komponen pada sampel tersebut
adalah 50:50. Sesuai dengan literatur luas area peak menunjukkan jumlah komponen pada
sampel, pada peak pertama komponen berupa fenol sebesar 20,743%. Pada peak kedua,
nitrobenzene sebesar 39,467%. Pada peak ketiga, toluena sebesar 19,937%. Pada peak keempat,
eugenol sebesar 19,852%. Dengan demikian, nitobenzene pada sampel memiliki konsentrasi dua
kali lipat dari komponen lainnya. waktu yang dibutuhkan untuk memisahkan keempat komponen
tersebut hanya 4,867 menit.
PEMBAHASAN OLEH Mochammad Ichsan ArdiansyaH (15)

HPLC merupakan suatu metoda pemisahan zat-zat yang terkandung dalam sampel berdasarkan
perbedaan polaritasnya. Analsisi HPLC amat bergantung pada interaksi pelarut (fase gerak)
dengan fase diam dan analitnya.

Pada praktikum kali ini fase gerak menggunakan campuran methanol dan H2O yang memiliki
tingkat kepolaran tinggi, analit adalah sampel yang mengandung senyawa toluene, eugenol,
nitrobenzene, dan fenol, fase diam adalah tipe reversed phase yaitu kolom yang bersifat non
polar. Output kriptogram akan menunjukkan senyawa terpolar (yang keluar dahulu dalam grafik)
menuju senyawa paling tidak polar di belakangnya.

Berdasarkan literatur, dapat diketahui bahwa kepolaran fenol>nitrobenzene>toluene>eugenol.

Percobaan dilakukan selama 4 kali dengan variable volume fase gerak dengan analit yang
berbeda, yaitu 85:15 ; 75:25 ; 65:35 ; dan 55:45. Masing-masing percobaan membutuhkan waktu
kurang lebih 10 menit untuk mencapai kromatogram yang benar.

Percobaan pertama dengan perbandingan volume 85:15 menunjukkan hasil kromatogram yang
masih menumpuk (terbentuk 2 peak yang berujung tumpul dan tajam) sehingga komposisi analit
belum dapat ditentukan. Waktu retensi peak yang terbaca berturut-turut (dari yang terjauh)
adalah 1.708 ; 1.517 ; 1.317 ; dan 1.142, dengan % area berturut-turut 3.272 ; 29.836 ; 47.501 ;
dan 19.390. Waktu retensi yang sangat singkat antar komposisi membuat peak menumpuk dan
menyatu.

Percobaan kedua dengan perbandingan volume 75:25 menunjukkan hasil yang lebih baik dengan
4 peak tajam yang terbentuk. Namun, ada 3 peak yang masih menumpuk dan 1 peak yang sudah
terpisah dengan baik. Waktu retensi peak berturut-turut 1.892 ; 1.442 ; 1.358 ; dan 1.208, dengan
% area berturut-turut 24.028 ; 25.545 ; 26.591 ; 23.836. Waktu retensi ketiga peak sangat singkat
hingga kurva menumpuk sehingga komposisi analit belum dapat ditentukan.

Percobaan ketiga denngan perbandingan volume 65:35 menunjukkan 5 hasil yang berbeda, yaitu
1 peak pendek, 2 hasil yang bergabung dalam 1 peak, dan 3 peak yang terpisah. Waktu retensi
hasil berturut-turut 2.808 ; 2.058 ; 1.625 ; 1.325 ; dan 1.033, dengan % area berturut-turut 29.691
; 28.228 ; 8.279 ; 27.787 ; 3.4 ; dan 2.615. Karena pembacaan yang didapat berbeda dengan
jumlah komponen analit yang seharusnya, maka kriptogram ini belum dapat dijadikan penentu
komposisi analit.

Percobaan keempat dengan perbandingan volume 55:45 menunjukkan hasil yang baik dengan 4
peak yang terpisah satu sama lain dengan jarak retensi yang ‘aman’ (tidak bersinggungan
ataupun bertumpukan). Waktu retensi hasil berturut-turut 4.867 ; 3.567 ; 2.183 ; dan 1.533,
dengan % area berturut-turut 19.852 ; 19.937; 39.467 ; dan 20.743. % area tersebut
menggambarkan bahwa dalam analit yang dianalisis mengandung 19.937% fenol, 39.467%
nitrobenzene, 39.467% toluene, dan 20.743% eugenol.

. pada pik pertama sudah terlihat jelas terpisah dari pik yang lain, hampir sama dengan gambar
sebelumnya, tetapi pada gambar ini terdapat waktu pada pik tertama yaitu 3,8 menit.

Pada percobaan yang terakhir yaitu perbandingan fase geraknya yaitu 55 : 45 sudah di
dapatkan 4 pik yang sudah terpisah antara satu dengan yang lain. Hal ini karena air dalam fase
gerak kali ini sangat banyak sehingga zat yang tingkat kepolarannya rendah akan segera sampai
ke detector dan di rekam oleh kromatograf. Rentang waktu antara satu dnegan yang lainnya pun
sudah terpisah jauh.

KESIMPULAN:

-High performance liquid chromatography, HPLC merupakan salah satu teknik kromatografi
Untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada
umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya
terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat
padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan
beberapa senyawa sekaligus karana setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase
diam tertentu dan fase gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan
mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu
senyawa.

Untuk mengidentifikasi suatu analit yang ingin diperiksa keberadaannya ataupun jumlahnya
dalam sampel, maka diperlukan beberapa standar dengan berbagai konsentrasi untuk
menentukan RT dari suatu analit tertentu. RT atau Retention Time adalah waktu ketika injeksi
sampel memasuki kolom hingga terdeteksi.

Hasil kromatografi HPLC disebut kromatogram. Sumbu X mewakili waktu retensi atau Retention
Time(RT) sedangkan sumbu Y untuk absorbansi unit. Dari kromatogram akan terlihat grafik
parabola dengan satu atau beberapa puncak atau peak yang menunjukkan adanya suatu analit
yang terdeteksi. Untuk menghitung konsentrasi dapat digunakan luas area di bawah puncak
peak atau ketinggian peak. Dengan membandingkan luas area absorbansi tiap standart
terhadap konsentrasinya, maka dapat ditentukan korelasi dan persamaannya sehingga dapat
dihitung konsentrasi analit yang sama dalam suatu suatu larutan dengan memasukkan dalam
persamaan tersebut.

Berdasarkan hasil kromatogram yang didapatkan dari percobaan ini, didapati bahwasanya
komposisi pelarut yang mampu memisahkan komponenkomponen dalam sampel dengan baik
adalah pelarut dengan perbandingan methanol: air sebesar 55:45, dengan tingkat kepolaran
larutan yang lebih besar dibanding pelarut dengan komposisi lain pada percobaan ini. Kolom
yang digunakan pada percobaan ini adalah kolom non polar. Sehingga, komponen yang
pertama kali di detect oleh detector adalah komponen yang memiliki tingkat kepolaran tinggi.
Kepolaran komponen sampel dimulai dari yang tertinggi yaitu Fenol > Nitro benzene > Benzena
> Eugenol. Sehingga peak yang pertama kali terlihat adalah fenol, kemudian nitro benzena,
benzene, dan eugenol.

-Senyawa yang keluar terlebih dahulu memiliki tingkat kepolaran yang lebih tinggi menuju ke
rendah.
-Semakin tinggi jumlah pembanding air terhadap sampel maka hasil chromatogram akan
semakin terpisah
-Semakin polar fase gerak yang digunakan maka komponen akan semakin memisah karena
kolom yang bersifat non polar akan lebih suka ke yang bersifat paling polar.
-Komponen pada sampel dengan tingkat kepolaran tinggi ke rendah adalah fenol, nitrobenzene,
toluena, dan eugenol.
-Konsentrasi nitrobenzene dua kali lipat dari komponen lain dengan area sebesar 39,467
-Percobaan pertama dengan perbandingan pelarut vs analit sebesar 85:35 memberikan
kriptogram dengan peak yang bertumpukan, begitupun dengan perbandingan 75:25 dan 65:35.
-Pada perbandingan pelarut vs analit sebesar 55:45 memberikan kriptogram yang baik dengan
peak yang terpisah seluruhnya

DAFTAR PUSTAKA:
1. Adnan, M.1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Penerbit Andi

Offset. Yogyakarta

2 .Ardianingsih, Retno.2009. Penggunaan High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) dalam Proses Analisa Deteksi Ion. Berita Dirgantara

3. Era, S.Y, dkk. 2011. Pengaruh Variasi Kepolaran Fase Gerak terhadap % Distribusi (+)-

Katekin dari Gambir

4.Hendayana, S dkk.1994. Kimia Analitik Instrument . IKIP Semarang Press. Semarang.