LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM ANALISIS INSTRUMEN

“HPLC”

Dosen pembimbing :

Arief Budiono,MSCH

Oleh :

Awwalun Nur Anfia

1B-D3 / 04

PROGRAM STUDI D3 TEKNIK KIMIA

JURUSAN TEKNIK KIMIA

POLITEKNIK NEGERI MALANG

2020
A. Alat dan Bahan yang digunakan:

Alat Bahan

 Reservoir (wadah
pelarut / cairan)  Air
 Pompa  Methanol
 System injeksi  Fenol
 Sampel  Eugenol
 Kolom  Toluene
 Detector  Nitrobenzene
 Computer
 Printer

B. Prosedur Kerja
- Persiapan
1. Mengisi botol penampung (A) dengan pelarut campuran Methanol : Air (15 : 85)
dan penampung (B) campuran Methanol : Air (85 : 95) sebagai fasa pembawa (gerak).
2. Menghidupkan alat dengan menekan ke bawah tombol on/off pada bagian belakang
sebelah kanan.
3. Hidupkan detektor UVIS 200 dengan menekan tombol on/off pada bagian belakang
sebelah kanan dan atur pada panjang gelombang 254 nm, RANGE (AUFS) pada
0,0005 dan RISE TIME pada 0,1 detik.
4. Hidupkan personal komputer dengan program Windows 3.1, kemudian pilih menu
Chromatography, lalu click HPLC , click OK, ketik “lab” pada User Name, ketik “1”
pada password, lalu click OK, click HPLC.
- Analisis

1. Melakukan “purging” untuk mengeluarkan gas dari saluran, dengan membuka tutup
depan HPLC, putar ke kiri (membuka) kran purging, tekan tombol “PURGE” “D”.

2. Tunggu sampai gelembung dan fasa pembawa lain keluar, lalu tekan
“PUMP/STOP”.Tutup kembali kran purging.
 3. Mengatur laju alir fasa pembawa pada 3 ml/menit dengan menekan “FLOW” “A”
“100” “ENTER”. Tekan kembali “FLOW” “1” “ENTER”

4. Menyuntikkan sampel Rutin (min. 20 mikro) pada posisi tuas “INJECT”.

5. Atur menu mulai merekam pada monitor, menggerakkan tuas dari INJECT ke
LOAD, menekan PUMP dan ENTER (pada PC) secara serentak. Lihat petunjuk
program HPLC

6. Mengamati sinyal yang tergambar pada monitor.

7. Lakukan kembali dengan menyuntikkan sampel Quercetin dan campuran

seperti pada langkah B.4 - B.6.

8. Menentukan jenis dan kadar sampel setelah proses analisis selesai.

C. Data Pengamatan
Kecepatan air : 300 µm/menit
Kolom : Non polar, c18
Fase gerak : Metanol, air
Banyak fase diam yang diambil : 5µl

No Metanol : H2O Banyaknya Kromatogram

.
1. 75:25 4
2. 45:55 5
3. 40:60 8

D. Pembahasan

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan cempuran berdasarkan perbedaan kecepatan

perambatan komponen dalam medium tertentu. Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya
distribusi komponen-komponen dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan perbedaan sifat
fisik komponen yang dipisahkan. Contoh kromatogrfi yang sering digunakan untuk analisa di
laboratorium adalah HPLC. Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit
berdasarkan tingkat kepolarannya. Semakin tinggi tingkat kepolaran maka komponen
tersebutlah yang akan keluar terlebih dahulu. Setiap campuran yang keluar akan terdeteksi
dengan detektor dan direkam dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan
jumlah komponen, sedangkan luas atau jarak peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran

Berikut merupakan tabel urutan tingkat kepolaran dari masing-masing analit yang akan
digunakan dalam praktikum berdasarkan literature.

No. Analit Kelarutan dalam air

1. Fenol (C6H5OH) 8.3 g/100 ml H2O
2. Nitrobenzene (C6H5NO2) 0.19 g/100 ml H2O
3. Toluene (C7H8) 0.047
4. Eugenol (C10H12O2) Tidak larut
Dari praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil data pemisahan komponen
analit (fenol, eugenol, nitrobenzene dan toluene) membentuk sebuah kromatogram. Dengan
fase gerak yang digunakan adalah methanol dan H2O dengan perbandingan komposisi yang
berbeda-beda, metanol digunakan karena untuk HPLC fase terbalik, larutan yang biasa
digunakan adalah asetonitril,tetrahidrofuran atau metanol.

Sedangkan fase diamnya adalah kolom C18 yang bersifat non polar. Kolom ini
merupakan kolom yang sering digunakan dalam HPLC fase terbalik. Kolom C18 atau
oktadesil silika (ODS) merupakan hidrokarbon alkil non polar yang terikat pada silika.
Pemisahan terjadi karena komponen sampel yang bersifat non polar akan melewati kolom
lebih lama dibandingkan komponen sampel yang bersifat lebih polar. Serta kecepatan alir
yang digunakan sebesar 300µL/min.

Berikut merupakan hasil kromatogram dengan berbagai perbandingan komposisi :

 1) Perbandingan komposisi 75:25 (metanol: H2O)

Sampel diatas dapat terpisah pada menit ke 5 . Pada kromatogram diatas tersaji hasil
sebanyak 4 peak, namun kromatogram diatas menunjukkan hasil yang tidak sesuai dengan
literatur karena seharusnya kromatogram tersaji dalam garis lurus dan hanya naik saat bahan-
bahan terpisah. Hal ini dikarenakan, pada percobaan sebelumnya, prosedur yang dilakukan
salah. Dan untuk peak yang pertama kali keluar, yaitu fenol. Dikarenakan, fenol memiliki
polaritas yang tinggi, sedangkan kolom yang digunakan merupakan non polar, sehingga
bahan yang bersifat polar akan dikeluarkan terlebih dahulu. ,Sedangkan peak kedua adalah
nitrobenzene, ketiga adalah toluene sedangkan yang terakhir adalah eugenol.

2) Perbandingan komposisi 40:60 (metanol: H2O)

 Dari kromatogram tersebut dapat dilihat bahwa terdapat 8 peak dari pemisahan
komponen analit pada perbandingan 40 : 60. Peak tersebut menunjukkan bahwa telah
terjadinya pemisahan dari campuran analit dalam waktu hampir 10 menit. Peak yang pertama
menunjukkan bahwa dialah yang merupakan analit paling polar dari analit lainnya. Karena
pada prinsip kromatografi senyawa yang semakin mirip tingkat kepolarannya dengan fase
diam (non polar) maka senyawa akan semakin dipertahankan. Sehingga akan keluar paling
akhir. Berdasarkan literarur senyawa yang memliki tingkat kepolaran paling tinggi adalah
fenol,. Namun, banyaknya peak yang tersaji menunjukkan bahwa terdapat kesalahan saat
percobaan, yaitu dengan ikut terbawanya larutan pada percobaan sebelumnya. Hal ini terjadi
karena waktu untuk percobaan yang seharusnya 10 menit, sudah dihentikan sebelum
itu,sehingga tidak semua larutan keluar semua dari kolom. Untuk peak yang banyak ini,
bisajadi fenol, nitrobenzene, toluene, eugenol muncul dua kali akibat kesalahan tadi. Dengan
perbandingan komposisi H2O yang lebih besar, maka jarak antar peak menjadi lebih jauh.
Hal ini dikarekan dengan besarnya perbandingan H2O pada fase garak maka dapat mejadikan
tingkat kepolarannya lebih tinggi, sehingga analit yang memilik sifat kepolaran yang mirip
dengan fase geraknya maka akan cenderung terbawa, sehingga jarak yang dihasilkan dari tiap
peak menjadi lebih jauh.

3) Perbandingan komposisi 45:55 (methanol: H2O)

 Berdasarkan percobaan dengan perbandingan komposisis 45:55 ini terlihat, ada 5
kromatogram yang terbentuk dalam waktu 4 menit. Hal ini tidak sesuai dengan literatur.
Karena kromatogram yang terbentuk dimulai dari negatif 0,0002 dan terus turun hingga
negatif 0,036 volt . Selain itu, akibat kesalahan diawal akan berimbas terus dengan hasil-hasil
selanjutnya, hingga terbentuk 5 kromatogram. Diasumsikan yang mencul pertama dan
terakhir merupakan yaitu eugenol. Eugenol dapat muncul pertama dikarenakan sisa dalam
kolom yang belum tuntas. Untuk peak kedua merupakan fenol, ketiga nitrobenzene, dan yang
keempat merupakan toluena.

Berdasarkan percobaan diatas didapatkan bahwa perbandingan komposisi dari fase

geraknya mempengaruhi proses pemisahan dari analit. Semakin besar kadar H2O dalam
komposisi pembandingnya maka semakin polar sehingga semakin mudah analit tersebut
dapat dipisahkan. Kemudian untuk mengetahui dan mengidentifikasi sifat mamsing- masing
dari analit melalui komatrografi adalah dilihat dari siapa yang keluar terlebih dahulu. Jika
suatu analit yang keluar terlebih dahulu dengan fase diamnya adalah bersifat non polar, maka
analit tersebut memiliki tingkat kepolaran yang lebih tinggi dibandingkan dengan analit
lainnya. Dan sebaliknya, jika analit tersebut keluar paling terakhir maka dipastikan sifatnya
yang lebih non polar dibandingkan dengan analit lainnya. Hal tersebut dikarenakan analit
yang memiliki sifat kepolaran yang sesuai dengan kepolaran fase geraknya maka ia akan ikut
terbawa oleh fase gerak tersebut sedangkan semakin jauh kepolaran fase gerak maka semakin
sedikit analit yang terbawa oleh fase geraknya tersebut (Era, dkk. 2011)
E. Kesimpulan
 Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam
fase diam dan fase gerak berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen yang
dipisahkan.
 Proses pemisahan senyawa dengan menggunakan HPLC dipengaruhi oleh
perbandingan komposisi fase gerak, kecepatan alir, dan waktu.