ANALISIS ALKILBENZENA MENGGUNAKAN TEKNIK HIGH PERFORMANCE

LIGUID CHROMATOGRAPHY
P–7
Nama : Aina Jefelina Nuur Hari/ Tanggal : Rabu, 28 April 2021
NIM : 185090200111003 Nama Asisten : Adzkia Qisthi Ismail
Kelompok :4

1. Tujuan Percobaan
Setelah dilakukan percobaan ini diharapkan praktikan dapat memahami cara kerja
instrument HPLC secara kuantitatif, melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta
dapat mengikuti manual pengoperasian HPLC.

2. Tinjauan Pustaka
2.1 Dasar Teori
HPLC pada prinsipnya yaitu diinjeksikannya sejumlah kecil sampel kedalam fase
gerak (fasa cair yang mengalir) yang berada di dekat kolom yang dikemas berada partikel
yang sangat kecil berdiameter 3-5 µm atau disebut sebagai fasa diam. Kemudian, sampel
akan dipindahkan ke bawah kolom oleh fasa gerak. Sampel dipaksa melalui kolom oleh
tekanan tinggi pada kecepatan konstan yang diberikan oleh pompa (Kumar dkk., 2013).
HPLC adalah suatu bentuk kolom tertentu kromatografi yang umumnya digunakan untuk
memisahkan, mengidentifikasi, dan mengukur senyawa aktif. Pada instrumentHPLC
digunakan sebuah kolom yang menampung bahan pengepakan berupa fasa diam, pompa
akan menggerakan fase gerak melalui kolom menuju detektor dengan waktu resensi
tertentu yang sesuai dengan molekul tertentu. Waktu retensi akan berbeda – beda
tergantung pada fase gerak, pelarut yang digunakan, dan molekul yang dianalisis (Bansal
dkk., 2010).

Gambar 1. Sistem HPLC (Ghanjaoui dkk., 2020)

Komponen – komponen penting HPLC diantaranya yaitu reservoir, pump, sampel
injktor, kolom, detektor, output. Bagian pentingnya dapat dilihat pada gambar 1. Reservoir
pelarut adalah wadah yang menahan fasa gerak. Pelarut akan dikirim dari reservoir ke
pompa melalui pipa teflon. Fase gerak juga dapat dipisahkan dan diisolasi dari udara
dengan penggunaan reservoir yang memiliki kompartemen khusus yang dapat menampung
lebih dari satu fasa gerak. Pompa adalah sistem pengiriman aliran secara terus menerus
dari fasa gerak ke kolom HPLC . katup injeksi sampel adalah tempat yang digunakan
untuk memasukan sejumlah sampel yang direproduksi ke dalam aliran eluen HPLC tanpa
adanya perubahan tekanan atau aliran. Injeksi sampel masuk ke dalam sistem dilakukan
pada tekanan atmosfer. Kolom adalah instrument penting dari HPLC. Kolom adalah
ditempatkannya matriks pendukung fasa diam. Matriks yang digunakan diantaranya
polimer, alumina, dan silica. Silika matriks yang paling sering digunakan pada HPLC
karena merupakan senyawa yang stabil untuk sebagian besar pelarut organic dan stabil
pada pH yang rendah. Detektor HPLC untuk mendeteksi waktu retensi. Selain itu, terdapat
detektor absorbansi UV/Vis, fluororesensi, elektrokimia, kondiktivitas, indeks refraksi, dan
spektroskopi massa. Pada output pengumpulan dan luaran data diperoleh serangkaian
puncak yang masing – masing mewakili senyawa dalam campuran yang melewati detektor
dan menyerap sinar UV. Luas dibawah puncak sebanding dengan jumlah zat yang dilewati
detektor, dan dapat dihitung secara otomatis oleh komputer (Ghanjaoui dkk., 2020).
Analisis kualitatif pada HPLC didasarkan pada pengukuran luas puncak analit
dalam kromatogram yang dibandingkan dengan luas area standar. Sedangkan, analisis
kuantitatif digunakan untuk penentuan kadar suatu senyawa yang diperoleh dari
kromatogram dimana terdapat puncak – puncak tertentu dengan luas tertentu pada analit
berbeda dan dibandingkan dengan luas area standar (Wahid, 2020).
Kelebihan yang dimiliki oleh HPLC daripada instrument lainya yaitu mudah
dioperasikan, terdapat kapasitas pemisahan yang tinggi, dan mudah mendeteksi senyawa
organik. Tetapi, HPLC memiliki kekurangan berupa terjadinya kesulitan saat identifikasi
puncak kromatogram dengan tepat, terutama pada senyawa PAH yang puncaknya saling
tumpang tindih (Hirjani dkk., 2018).

2.2 Prinsip Perhitungan

Keterangan:
t: waktu retensi
w: luas puncak
3. Prosedur Kerja
3.1 Alat dan Bahan
Pada percobaan dibutuhkan alat dan bahan yang menunjang praktikum ini.
Peralatan yang diperlukan yaitu HPLC prominence 20 dengan kolom C18 dan
detector spektrofotometri UV-Vis, ultrasonic vibrator, membran PTFE, dan alat gelas.
B a h a n yang dibutuhkan yaitu urasil, toluena, etil benzena, propil benzena, butil
benzena, amil benzena, asetonitril, akuades, dan metanol

3.2 Prosedur Percobaan

 3.2.1 Pembuatan Fasa Gerak (Pelarut)
Asetonitril
→disaring dengan PTFE
→dihilangkan gelembungnya dengan ultrasonic vibrator selama 15 menit
→dicampurkan asetonitril dan air dengan perbandingan 50:50 (2,5 mL : 2,5 mL)
untuk pembuatan fasa gerak 5 mL.
Fasa gerak asetonil
dan air

3.2.2 Pembuatan Larutan Sampel

toluene, etil
benzene, propil
benzene, butil
benzene, amil
benzene, dan urasil
→ masing – masing dipipet sebanyak 20 µL
→ dilarutkan dalam fasa gerak 5 mL
Larutan sampel
mengandung
toluene, etil
benzene, propil
benzene, butil
benzene, amil
benzene, dan urasil

3.2.3 Penyiapan Instrumen HPLC

HPLC
→ seluruh kabel pada instrument HPLC dan komputer disambungkan pada sumber
listrik
→ dinyalakan perangkat komputernya
→ tombol power pada bagian perangkat HPLC yang dibutuhkan dinyalakan
→ ditekan tombol power CBM pada HPLC
→ perangkat komputer disambungkan pada HPLC dengan meng-klik software HPLC
pada komputer lalu dipilih HPLC yang sedang menyala
HPLC siap
digunakan

3.2.4 Proses Analisis

Larutan sampel
mengandung
toluene, etil
benzene, propil
benzene, butil
benzene, amil
benzene, dan urasil
→ Disesuaikan dengan kondisi berikut:
Fase diam : Kolom C18 (non-polar)
Fasa gerak : Asetonitril-air (50:50 v/v)
Ukuran kolom : diamatere 4,5 mm; panjang kolom 250 mm
 Laju alir : 1 mL/menit
Volume injeksi : 2 µL
Temperatur : 25oC
Detektor UV : 214 nm
→ sampel diinjeksiskan pada instrument dan tuas diputar
→ Dianalisis sampelnya hingga selesai
Kromatogram
kandungan bahan
dalam larutan
sampel

4. Hasil dan Pengamatan

4.1 Data Hasil Pengamatan
No Perlakuan Hasil Pengamatan
4.1.1 Pembuatan Fasa Gerak
Asetonitril diambil dan
1 dicampurkan air dengan Terbentuk larutan bening didalam gelas kimia
perbandingan 50:50 (v/v)
4.1.2 Pembuatan Larutan Sampel
Disiapkan larutan yaitu
urasil, toluena, etil
1 benzena, propil benzena, Semua sampel berwarna bening
butil benzena, dan amil
benzena
Larutan diambil masing-
masing
sebanyak 20 µL dan
2 ditambahkan dengan Terbentuk larutan sampel berwarna bening
fasa gerak hingga
volume 5 mL
4.1.3 Pemisahan menggunakan HPLC
HPLC dinyalakan dan Lampu penanda pada HPLC menyala, dan terbuka
1 dihubungan dengan system
jendela pengaturan pada softwere komputer
komputer
HPLC diatur sesuai HPLC siap untuk digunukan untuk menganalisis
2 dengan kondisi
sampel
pengukuran
Sampel diinjeksikan dan
tuas diputar setelah ada
3 Sampel sedang dianalisis oleh HPLC
tanda perintah yang
muncul pada monitor
4 Ditunggu hingga proses Diperoleh kromatogram yang terdiri dari 6 puncak
analisis selesai seperti gambar berikut:
 Diperoleh waktu retensi (tR) dan luas puncak (w) pada
setiap puncak sesuai tabel berikut:
senyawa
urasil 2,5 0,8
1 10,0 1,0
2 12,5 1,2
3 17,5 1,8
4 29,5 2,5
5 47,5 3,5
10,8
5 Perhitungan Resolusi (R)
Kromatografi

6 Perhitungan kapasitas
faktor (k’)

7 Perhitungan kadar
komponen dalam larutan ( )
sampel
 ( )

( )

( )

( )

( )

4.2 Analisa Prosedur

Pada percobaan ini terdapat empat prosedur utama yaitu pembuatan fasa gerak,
pembuatan larutan sampel, pengoperasian instrument HPLC, dan analisis larutan sampel
dengan HPLC. Pertama – tama fasa gerak dibuat dari asetonitril dan air dengan
perbandingan 50:50 karena fase gerak akan mengeluen urasil terlebih dahulu pada kondisi
tersebut. Asetonitril disaring dengan PTFE terlebih dahulu untuk menghilangkan
kandungan senyawa hidrofobik karena PTFE merupakan filter yang bersifat hidrofobik
sehingga tahan terhadap senyawa organik dan asetonitril yang digunaka terhindar dari
partikel – partikel pengganggu. Kemudian, gelembung asetonitril dihilangkan dengan
vibrator ultrasonik sehingga asetonitril terbebas dari gelembung udara. Gangguan pada
analisis dapat disebabkan oleh gelembung udara karena dapat meningkatkan tekanan udara
dan kinerja detektor dapat terganggu. Asetonitril yang telah disiapkan dan air masing –
masing diambil sebanyak 2,5 mL lalu dicampurkan sehingga terbentuk larutan yang
digunakan dalam fasa gerak sebanyak 5 mL.
Toluene, etil benzene, propil benzene, butil benzene, amil benzene, dan urasil
masing – masing dipipet sebanyak 20 µL kemudian dilarutkan dalam fasa gerak 5 mL
sehingga terbentuk larutan campuran dengan mengandung bahan – bahan tersebut. Urasil
dapat digunakan untuk menguji kolom HPLC fase terbalik karena kolom atau fase diam
bersifat non-polar, sehingga urasil tidak bisa ditahan oleh fase diam dan digunakan untuk
penentuan waktu diam karena urasil akan terelusi pertama kali dari larutan sampel yang
akan diuji. Toluene, etil benzene, propil benzene, butil benzene, dan amil benzene adalah
komponen yang akan dianalisis dengan HPLC.
Kemudian dilakukan pengoperasian HPLC. Pertama, seluruh kabel pada
instrument HPLC dan komputer disambungkan pada sumber listrik untuk menyalakan
HPLC dan komputer. Setelah terhubung listrik, komputer dinyalakan dan tombol power
pada bagian perangkat HPLC yang dinyalakan dengan ditekan tombol power CBM pada
HPLC agar HPLC bisa digunakan. Kemudian, perangkat komputer disambungkan pada
HPLC dengan meng-klik software HPLC pada komputer lalu dipilih HPLC yang sedang
menyala sehingga HPLC dapat terhubung dengan komputer dan data yang diperoleh dapat
dibaca dan disimpan oleh komputer. HPLC ditunggu hingga satu jam agar kondisinya siap
untuk digunakan.
Analis dengan HPLC diatur dengan kondisi fase diam yaitu kolom C18 (non-polar),
fase gerak berupa Asetonitril-air (50:50 v/v), ukuran kolom yang digunakan dengan
diamatere 4,5 mm dan panjang kolom 250 mm, laju alir sebesar 1 mL/menit, volume
injeksi sebanyak 2 µL, pada temperatur 25oC, dan detektor UV pada panjang gelombang
214 nm. Larutan sampel yang telah dibuat diambil dengan injector sebanyak 2 µL.
Kemudian, diinjeksiskan pada instrument setelah seluruh sampel diinjeksikan dan terdapat
perintah di layar komputer tuas diputar sehingga terjadi analisis pada sampel. Sampel yang
dianalisis ditunggu hingga satu jam untuk mengetahui waktu retensi pada setiap sampel
yang terkandung secara optimal.

4.3 Analisa Hasil

Pada praktikum ini diperoleh beberapa hasil yaitu kromatogram dengan 6 puncak
yang menunjukan komponen pada larutan sampel yaitu urasil, sampel 1-5 yang belum
teridentifikasi, waktu retensi setiap komponen, dan luas puncak tiap komponen. Pada
kromatogram puncak pertama yang muncul adalah urasil. Urasil adalah komponen polar
yang tidak bisa ditahan oleh fasa diam yang bersifat non-polar sehingga akan terelusi
pertama kali. Sampel 1-5 yang merupakan toluene, etil benzene, propil benzene, butil
benzene, dan amil benzene senyawa bersifat netral dan pemisahannya tergantung pada
perbedaan hidrofobisitas dengan fasa diam (Štulík dkk., 2006). Menurut Štulík dkk
(2006) toluene memiliki waktu retensi lebih dari 10 menit dan diikuti oleh etil benzene.
Maka, dapat disimpulkan secara berurutan bahwa puncak 1, 2, 3, 4, dan 5 yaitu urasil,
toluene, etil benzene, propul benzene, butyl benzene, dan amil benzene. Dengan demikian
semakin besar perbedaan hidrofobisitas dengan fasa diam maka akan semakin cepat
terelusi karena fasa diam tidak dapat menahan senyawa dengan perbedaan hidrofobisitas
yang tinggi atau kepolarannya tinggi. Jadi semakin besar perbedaan nilai hidrofobisitas
dengan fasa diam menandakan senyawa komponen dalam sampel semakin polar. Urasil
menjadi senyawa paling polar, diikuti oleh toluene dan yang kepolarannya paling rendah
yaitu amil benzene. Pada struktur senyawanya semakin, panjang rantai hidrokarbon pada
benzene akan memiliki sifat non-polar yang makin besar pula dan dielusi paling akhir.
Resolusi retensi yang diperoleh pada setiap puncak terhadap puncak berikutnya
mulai dari 2,3 hingga 8,3. Resolusi yang ideal tercapai saat nilai R 1,5. Pada resolusi
tersebut dua puncak akan terpisah secara sempurna. Hal ini sesuai dengan kromatogram
yang diperoleh dimana semua puncak terpisah satu dengan yang lainnya, tidak ada yang
tumpang tindih. Sehingga analisis yang dilakukan pada kondisi yang sesuai dimana
menggunakan panjang kolom yang sesuai. Menurut Susanti & Dachriyanus (2017)
gambaran puncak – puncak komponen terelusi secara relative terhadap waktu geraknya
dapat ditunjukan oleh faktor kapasitas. Harga faktor kapasitas yang baik ditunjukan pada
nilai 2-10. Apabila harganya rendah maka analit akan ditahan oleh kolom dan terelusi
dekat dengan fasa gerak sehingga dihasilkan pemisahan yang tidak baik. Nilai faktor
kapasitas yang besar akan diperoleh pemisahan yang baik tapi dibutuhkan waktu analisis
yang terlalu lama. Pada harga faktor kapasitas sebesar 2,3 – 18,0. Berarti telah terjadi
pemisahan yang baik dan sesuai dengan perhitungan resolusi yang diperoleh, tetapi
dibutuhkan waktu elusi sedikit lebih lama untuk elusi amil benzene.
Kadar suatu komponen ditunjukan oleh luas puncaknya (w). Diperolah kadar
komponen toluene 9,3%; etil benzene 11,1%; propil benzene 16,7%; butyl benzene
23,1%; dan amil benzene 32,4 %.
5. Kesimpulan
Pada percobaan analisis alkilbenzena dengan teknik HPLC dapat disimpulkan
bahwa instrument HPLC dioperasikan dengan jenis fasa terbalik dimana fasa diam bersifat
non polar dan fasa gerak sifatnya polar. Kadar komponen dalam larutan sampel yaitu
toluene 9,3%; etil benzene 11,1%; propil benzene 16,7%; butyl benzene 23,1%; dan amil
benzene 32,4 %. Komponen pada larutan sampel dianalisis dengan dilarutkan pada fasa
gerak berupa asetonitril dan air (v/v 50:50) dan fasa diam kolom C-18. Dimana puncak
analit ditipsahkan secara sempurna dengan resolusi lebih dari 1,5 dan faktor kapasitas 2,3-
18. Semakin singkat waktu retensi maka dielusi lebih dulu dan senyawanya makin polar.
Pada struktur senyawa alkil benzena semakin, panjang rantai hidrokarbon pada benzene
akan memiliki sifat non-polar yang makin besar pula dan dielusi paling akhir.

6. Daftar Pustaka
Bansal, M. R., O.P, P., & P.K, S. (2010). HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY: A SHORT REVIEW. 2(5), 6.
Ghanjaoui, M. E., Mandil, A., Mou, A. A. S., & Slimani, R. (2020). High performance
liquid chromatography quality control. International Journal of Advanced
Chemistry, 8(1), 11.
Hirjani, Pranowo, H. D., & Mudasir. (2018). Prediction of High Performance Liquid
Chromatography Retention Time for Some Organic Compounds Based on Ab intio
QSPR Study. Act. Chim. Asiana, 1(1), 24–29. https://doi.org/10.29303/aca.v1i1.6
Kumar, A., Jawla, S., & Yadav, G. (2013). Recent Analytical Method Developed by
RPHPLC.10.
Štulík, Karel., Pacakova, Vera., Suchankova, Jana., & Coufal, Pavel. (2006). Monolithic
organic polymeric columns for capillary liquid chromatography and
electrochromatography. Journal Of Chormatography B. 841, 79-87.
Susanti, Mari & Dachriyanus. (2017). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Padang: LPTIK
Universitas Andalas. ISBN 978-602-5539-02-2.
Wahid, R. A. (2020). Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Tanin Ekstrak Kulit Buah Delima
(Punica Granatum L.) Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT). 3(2), 11.

7. Lampiran