PENGANTAR SPESIES OKSIGEN REAKTIF - PENGUKURAN ROS

DALAM SEL

Spesies Oksigen Reaktif (ROS) telah lama dikenal sebagai komponen dari respons

pembunuhan sel-sel kekebalan terhadap invasi mikroba. Bukti terbaru menunjukkan bahwa

ROS memainkan peran kunci sebagai pembawa pesan dalam transduksi sinyal sel normal dan

siklus sel. Molekul reaktif ini dibentuk oleh sejumlah mekanisme yang berbeda dan dapat

dideteksi oleh berbagai teknik.

A. Pendahuluan

Reaktif Oksigen Spesies (ROS) adalah frasa yang digunakan untuk menggambarkan

sejumlah molekul reaktif dan radikal bebas yang berasal dari oksigen molekuler. Produksi

radikal berbasis oksigen adalah larangan bagi semua spesies aerobik. Molekul-molekul ini,

diproduksi sebagai produk sampingan selama transportasi elektron mitokondria dari respirasi

aerobik atau oleh enzim oksidoreductase dan oksidasi katalis logam, berpotensi menyebabkan

sejumlah peristiwa yang perusakan. Awalnya diperkirakan bahwa hanya sel-sel phagocytic

yang bertanggung jawab atas produksi ROS sebagai bagian mereka dalam mekanisme

pertahanan sel inang. Penelitian baru-baru ini menunjukkan bahwa ROS memiliki peran

dalam sinyal sel, termasuk; apoptosis; ekspresi gen; dan aktivasi kaskade sinyal sel [1]. Perlu

dicatat bahwa ROS dapat berfungsi sebagai pembawa pesan intra dan antarseluler.

B. Jenis Spesies Oksigen Reaktif

Sebagian besar spesies oksigen reaktif dihasilkan sebagai produk yang dihasilkan

selama transportasi elektron mitokondria. Selain itu ROS dibentuk sebagai perantara yang

diperlukan dari reaksi oksidasi katalis logam. Oksigen atom memiliki dua elektron yang tidak

bernyarasi di orbit terpisah di cangkang elektron luarnya. Struktur elektron ini membuat
oksigen rentan terhadap pembentukan radikal. Pengurangan oksigen berurutan melalui

penambahan elektron menyebabkan pembentukan sejumlah ROS termasuk: superoksida;

hidrogen peroksida; hidroksil radikal; ion hidroksil; dan oksida nitrat. (Gambar 1).

Gambar 1. Struktur elektron spesies oksigen reaktif umum. Setiap struktur disediakan dengan nama dan
formula kimianya. Merah • menunjuk elektron yang tidak berpasangan.

C. Pertahanan Seluler Melawan ROS

Detoksifikasi spesies oksigen reaktif sangat penting untuk kelangsungan hidup semua

bentuk kehidupan aerobik. Dengan demikian sejumlah mekanisme pertahanan telah

berevolusi untuk memenuhi kebutuhan ini dan memberikan keseimbangan antara produksi

dan penghapusan ROS. Ketidakseimbangan terhadap keadaan pro-oksidatif sering disebut

sebagai "stres oksidatif".

Sel memiliki berbagai mekanisme pertahanan untuk menghilangkan efek berbahaya

dari ROS. Superoksida dismutase (SOD) mengkalisis konversi dua anion superoksida

menjadi molekul hidrogen peroksida (H2O2) dan oksigen (O2) [3] (Eq. 1). Dalam peroksom

sel eukariotik, enzim catalase mengubah H2O2 menjadi air dan oksigen, dan dengan demikian

menyelesaikan detoksifikasi yang diprakarsai oleh SOD (Eq. 2). Glutathione peroxidase
adalah sekelompok enzim yang mengandung selenium, yang juga menganalalisis degradasi

hidrogen peroksida, serta peroksida organik terhadap alkohol.

Ada sejumlah antioksidan molekul kecil non-enzimatik yang berperan dalam

detoksifikasi. Glutathione mungkin pertahanan intra-seluler yang paling penting terhadap

efek menghapus spesies oksigen reaktif. Tripeptide ini (glutamyl-cysteinyl-glycine)

menyediakan kelompok sulphhydryl terbuka, yang berfungsi sebagai target serangan yang

melimpah. Reaksi dengan molekul ROS mengoksidasi glutathione, tetapi bentuk yang

dikurangi diregenerasi dalam redoks oleh reduktase yang bergantung pada NADPH. Vitamin

C atau asam askorbat adalah molekul larut dalam air yang mampu mengurangi ROS,

sedangkan vitamin E (α-tocopherol) adalah molekul larut lipid yang telah disarankan sebagai

memainkan peran yang sama dalam membran.

Rasio bentuk oksidasi glutathione (GSSG) dan bentuk berkurang (GSH) adalah

indikator dinamis dari stres oksidatif suatu organisme [2].

D. Reaksi terhadap Stres Oksidatif

Efek spesies oksigen reaktif pada proses seluler adalah fungsi kekuatan dan durasi

paparan, serta konteks paparan. Respon seluler yang khas terhadap stres adalah meninggalkan

siklus sel dan masuk ke G0. Dengan terus terpapar dan/atau tingkat tinggi ROS, mekanisme

apoptosis dipicu. Dalam sel bersepeda, p21 diaktifkan sebagai respons terhadap stres, seperti

oksidan atau stres oksidatif dan memblokir perkembangan siklus sel [4]. Demikian juga

produksi P27 menyebabkan G1 penangkapan sel. Dalam sel bersepeda, p53 dan p21
merespons oksidan dengan menginduksi defosforilasi retinoblastoma (RB). Paparan oksidan

seperti H2O2 atau oksida nitrat juga mengakibatkan defosforilasi RB yang independen dari

p53 atau p21. Dalam kedua kasus sel ditangkap dalam fase S. Ekspresi p27 dikendalikan

sebagian oleh faktor transkripsi Foxo, yang dikenal untuk mengontrol ekspresi gen yang

terlibat dalam perkembangan siklus sel, metabolisme dan respons stres oksidatif [5].

Misalnya, stimulasi mitogenik oleh jalur PI3K / Akt mempertahankan Foxo3a di sitoplasma,

tetapi dengan tidak adanya stimulasi Foxo3a memasuki inti dan up- mengatur gen untuk

metabolisme oksidan dan penangkapan siklus sel, seperti p27 [5]. Dalam beberapa kondisi

Foxo3a dapat langsung mengaktifkan ekspresi gen bim dan mempromosikan apoptosis. [6].

Dengan demikian, Foxo3a mempromosikan kelangsungan hidup sel bersepeda di bawah

tekanan oksidatif dengan memungkinkan respons stres, tetapi menginduksi kematian sel

ketika kondisi menjamin. Sel-sel noncycling, seperti neuron, juga memiliki mekanisme

mengatasi stres oksidatif yang melibatkan Foxo3a. Foxo3a menginduksi ekspresi bentuk

mangan SOD sebagai respons terhadap stres oksidatif [7].

E. Regulasi Produksi ROS

Sel Phagocytic

Produksi yang dirangsang dari spesies oksigen reaktif oleh sel-sel phagocytic awalnya

disebut "semburan pernapasan" karena peningkatan konsumsi oksigen oleh sel-sel ini [8].

Proses ini dikatalisasi oleh aksi NADPH oxidase, kompleks enzim terikat membran

multikomponen, dan diperlukan untuk tindakan bakterisida phagocytes [8].

Sementara beberapa enzim diakui mampu menghasilkan moieties ROS, NADPH

oxidase adalah yang paling signifikan [9]. Aktivitas oksidasi NADPH dikendalikan oleh

sistem regulasi kompleks yang melibatkan G-protein Rac [10] (Gambar 2).
 Dalam sel istirahat, membran tertanam heterodimer dari dua polipeptida (p22-phox

dan gp91-phox), yang juga mengandung dua kelompok heme serta kelompok FAD,

memungkinkan transfer elektron dari NADPH sitoksolik di seluruh membran ke oksigen

molekuler tanpa aktivitas oksidase NADPH [9].

Diyakini bahwa kompensasi biaya terjadi ketika gp91-phox polipeptide juga bertindak

sebagai saluran H + ion. Setelah stimulasi, sejumlah polipeptida (p47-phox, p67-phox dan

p40phox) ditranslokasikan ke wajah bagian dalam membran plasma untuk membentuk

kompleks enzim yang sepenuhnya aktif yang memiliki aktivitas oksidase NADPH. Proses

serupa diyakini terjadi di sel-sel non-phagocytic juga [11].

Gambar 2. Ilustrasi skematik aktivasi NADPH Oxidase.

Transduksi Sinyal

Spesies oksigen reaktif memiliki peran dalam sejumlah proses seluler. Tingkat ROS

yang tinggi, yang dapat menyebabkan kerusakan sel, stres oksidatif dan kerusakan DNA,

dapat menimbulkan mekanisme kelangsungan hidup sel atau apoptosis tergantung pada

tingkat keparahan dan durasi paparan. Oksida nitrat (•TIDAK) telah terbukti berfungsi

sebagai utusan sel ke sel, bertanggung jawab atas efek seperti mengurangi tekanan darah

[12]. Secara intra-cellularly, spesies ROS, bersama dengan enzim antioksidan, diyakini

berperan dalam menghidupkan dan mematikan enzim dengan sinyal redoks dengan cara yang

mirip dengan sistem messenger kedua cAMP [12]. Contohnya termasuk anion superoksida,

hidrogen peroksida. Tingkat keadaan stabil •O2 - diperkirakan sangat rendah, namun

aktivitasnya terbatas secara spasial. Hidrogen peroksida (H 2O2)biasanya tidakreaktif dengan

thiols tanpa adanya agen catalyzing (misalnya enzim," logam multivalenen dll), itu bereaksi

dengan thiolate anion (S-), untuk membentuk asam sulfenik, yang pada gilirannya

mengionisasi untuk membentuk sulfat (SO-). Perantara ini dapat dibalik oleh aksi glutathione

[13].

Sinyal mitogenik dimulai di permukaan sel dengan aktivasi kinases sel yang

bergantung pada ligan, yang mengaktifkan kaskade kinase MAP penting yang diperlukan

untuk proliferasi. Kaskade ini mengarah pada generasi H2O2 dari beberapa katalis enzim,

termasuk oksidas NADPH [14]. Diperkirakan bahwa produksi H 2O2 pada tingkat nanomolar

diperlukan untuk proliferasi dalam menanggapi faktor pertumbuhan [15]. Hidrogen peroksida

berinteraksi dengan jalur SOS-Ras-Raf-ERK dan PI3K/Akt melalui beberapa mekanisme dan

dengan cara yang tidak tergantung (Gambar 3). Telah disarankan bahwa peningkatan kecil

H2O2, sebagai akibat dari ekspresiNox1 mengakibatkan peningkatan masuk kembali ke

dalam siklus sel, sementara tingkat tinggi berkelanjutan H2O 2menyebabkan penangkapan sel

dan akhirnya apoptosis setelah penangkapan berkepanjangan.

 Peroxidoxins berfungsi sebagai regulator penting H2O2 dan sinyal mitogenik.

Peroxidases yang bergantung pada thiol ini diaktifkan dan direkrut ke reseptor sebagai bagian

dari stimulasi mitogenik dan berfungsi untuk membatasi efek stimulasi terkait ROS pada

target hilir dari kaskade mitogen [16]. (Gambar 3).

Kontrol Siklus Sel: Sinyal Redox

Ketika sel berkembang biak, mereka bergerak melalui proses pertumbuhan sel yang

terkoordinasi, duplikasi DNA dan mitosis yang disebut sebagai siklus sel. Siklus sel adalah

proses yang diatur dengan ketat dengan beberapa pos pemeriksaan. Masing-masing pos

pemeriksaan ini diatur oleh protein dan kompleks protein yang dipengaruhi oleh keadaan

oksidatif sel. Hubungan antara keadaan Redox dan kontrol siklus sel dijelaskan dengan

sangat rinci dalam ulasan oleh Heintz dan Burhans [5].

Pada hewan multi-seluler sebagian besar sel tidak mereplikasi dan telah menarik diri

dari siklus sel baik sementara atau permanen melalui diferensiasi terminal. Keluarnya G 0 dan

masuk ke G1 sebagai respons terhadap faktor pertumbuhan ekstraseluler dikendalikan oleh

oksidan. Jalur sinyal tergantung redoks mempromosikan ekspresi Cyclin D1 [17], protein

kunci untuk masuk kembali ke dalam siklus sel. Dengan demikian, ekspresi cyclin D1 telah

dilaporkan menjadi penanda keberhasilan stimulasi mitogenik [15]. Titik pengatur utama di

G1 adalah titik pembatasan (atau titik R), di mana sel menjadi berkomitmen untuk masuk ke

fase S. Pada titik R, protein retinoblastoma (pRB) menjadi fosforil oleh kompleks Cyclin

D/CDK. Studi yang cukup menarik telah menunjukkan bahwa ada potensi redoks sekitar -207

mV untuk fosforilasi pRB, di atas sel-sel pRB yang dephosphorylated dan sel-sel berhenti

bersepeda [18]. Telah diberitahu bahwa dalam sel yang disinkronkan produksi ROS

meningkat selama siklus sel, dengan tingkat puncak terjadi pada fase G2 / M [19].

Spesies oksigen reaktif memainkan peran dalam apoptosis. NF-kB, yang merupakan

istilah kolektif untuk menggambarkan keluarga Rel dari faktor transkripsi, menghambat
apoptosis dengan mengatur beberapa gen antiapoptotik [17]. Sebaliknya, c-Jun N-terminal

kinase (JNK) mempromosikan apoptosis ketika diaktifkan untuk jangka waktu yang lama

[20]. Aktivasi berkepanjangan telah terbukti disebabkan oleh paparan ROS secara langsung

serta dengan menonaktifkan inhibitor JNK seperti MAP Kinase phosphatases [20].

Penindasan akumulasi ROS α diinduksi TNF tampaknya menjadi mekanisme di mana NF-kB

menurunkan aktivasi JNK.

Gambar 3. Ilustrasi Skematik Interaksi Yang Dilaporkan ROS dan Mitogenik Cascades.
F. Mengukur Spesies Oksigen Reaktif

Pengukuran spesies oksigen reaktif tergantung pada target analitik bersama dengan

spesies oksigen reaktif yang dimaksud. Pada tingkat sel, ROS tertentu dapat dinilai secara

individual dari kultur jaringan, sedangkan pada tingkat hewan biasanya efek stres oksidatif

diukur dari produk darah (misalnya serum atau plasma) atau dari sampel urin.

Stres Oksidatif

Glutathione adalah mekanisme pertahanan oksidan non enzimatik yang paling

signifikan. Itu ada dalam jumlah yang relatif besar (kadar mM) dan berfungsi untuk

mendetoksifikasi peroksida dan meregenerasi sejumlah antioksidan penting (misalnya α-

tocopherol dan asam askorbat) [21].

Berkurangnya glutathione (GSH) diregenerasi dari bentuk teroksidasinya (GSSG) oleh aksi

reduktase tergantung NADPH (Eq. 3).

Eq. 3. GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+

Karena sifat cepat dari pengurangan GSSG relatif terhadap sintesis atau sekresinya,

rasio GSH ke GSSG adalah indikator yang baik dari stres oksidatif dalam sel. Tingkat GSH

dan GSSG dapat ditentukan oleh HPLC [22], elektroforesis kapiler [23], atau biokimia dalam

mikroplates [24].

Beberapa alat tes yang berbeda telah dirancang untuk mengukur glutathione dalam

sampel. Dengan menggunakan turunan luciferin bersama dengan enzim glutathione S-

transferase jumlah GSH akan proporsional dengan sinyal bercahaya yang dihasilkan ketika

luciferase ditambahkan dalam langkah berikutnya [25]. Glutathione total dapat ditentukan

secara koloris dengan bereaksi GSH dengan DTNB (reagen Ellman) di hadapan reduktase

glutathione. Glutathione reductase mengurangi GSSG ke GSH, yang kemudian bereaksi

dengan DTNB untuk menghasilkan asam 5-thio-2-nitrobenzoic (TNB) berwarna kuning,

yang menyerap pada 412 nm.

Deteksi subseluler dan lokalisasi GSH penting dalam memahami modulasi status

redoks seluler, efek obat, dan mekanisme detoksifikasi. Selain itu, perbedaan tingkat GSH

dalam menanggapi stres oksidatif dalam subpopulasi sel telah dilaporkan, menggarisbawahi

pentingnya metode deteksi yang dapat diterima untuk mengalirkan sitotometri dan deteksi

fluoresensi otomatis.

Senyawa bimane monobromobimane dan monoklorobimane, yang pada dasarnya

nonfluorescent sampai dikonjugasikan, mudah bereaksi dengan thiol berat molekul rendah,

termasuk glutathione untuk membentuk adducts fluorescent dengan panjang gelombang

eksitasi 394 nm dan emisi pada 490 nm [26] (Gambar 4). Reagen ini berguna untuk

mendeteksi distribusi thiol protein dalam sel sebelum dan sesudah pengurangan kimia dari

disufide. Monochlorobimane, yang lebih selektif thiol daripada monobromobimane, telah

lama menjadi probe thiol-reaktif pilihan untuk mengukur kadar glutathione dalam sel dan

untuk mengukur aktivitas GST [27]. Karena adduct glutathione biru-fluorescent

monoklorobimane akhirnya terakumulasi dalam inti, itu bukan indikator yang dapat

diandalkan dari distribusi nuklir dan sitoplasma glutathione seluler [28].

 Gambar 4. Struktur Bimane dan reaksi dengan thiols. Monobromobimane dan monochlorobimane
memiliki atom Br atau Cl yang masing-masing terletak di kelompok metil 3-postion dan nonfluorescent.
Kelompok reaktif ini berinteraksi dengan thiol berat molekul rendah untuk membentuk adducts
fluorescent, dengan maxima eksitasi 394 nm dan panjang gelombang emisi 490 nm.

ThiolTracker™ Violet (Life Technologies) bereaksi dengan berkurangnya thiol dalam

sel utuh untuk digunakan dalam analisis seluler menggunakan flow cytometry dan

fluorescence microscopy. ThiolTracker™ reagen Violet dapat melintasi membran sel hidup,

menjadi selukuler setelah bereaksi dengan thiol seluler. Eksitasi 404 nm dan panjang

gelombang emisi 526 nm cocok untuk pencitraan dengan set filter DAPI. Dilaporkan 10 kali

lebih terang dari senyawa bimane oleh produsennya.

Peroksidasi lipid adalah salah satu indikator pembentukan radikal bebas yang paling

banyak digunakan, indikator utama stres oksidatif. Asam lemak tak jenuh seperti yang ada

dalam membran sel adalah target umum untuk radikal bebas. Reaksi biasanya terjadi sebagai

reaksi berantai di mana radikal bebas akan menangkap moiety hidrogen dari karbon tak jenuh

untuk membentuk air. Ini meninggalkan elektron yang tidak bernyawa pada asam lemak yang

kemudian mampu menangkap oksigen, membentuk radikal peroksy (Gambar 5). Lipid

peroksida tidak stabil dan membusuk untuk membentuk serangkaian senyawa kompleks,

yang mencakup senyawa karbonil reaktif, seperti malondialdehyde (MDA).

 Gambar 5. Ilustrasi peroksidasi lipid.

Pengukuran peroksidasi lipid secara historis mengandalkan deteksi senyawa reaktif

asam thiobarbituric (TBA) seperti malondialdehyde yang dihasilkan dari dekomposisi produk

peroksidasi lipid [25]. Meskipun metode ini kontroversial karena cukup sensitif, tetapi tidak

selalu spesifik untuk MDA, itu tetap menjadi cara yang paling banyak digunakan untuk

menentukan peroksidasi lipid. Reaksi ini, yang berlangsung dalam kondisi asam pada 90-100

ºC, menghasilkan adduct yang dapat diukur secara kolorimetris pada 532 nm atau dengan

fluoresensi menggunakan panjang gelombang eksitasi 530 nm dan panjang gelombang emisi

550 nm [29] (Gambar 6). Sejumlah kit alat tes komersial tersedia untuk alat tes ini

menggunakan teknologi deteksi penyerapan atau fluoresensi.

 Gambar 6. Formasi adduct MDA-TBA.

Pembentukan turunan prostanoid seperti F2 dari asam arachidonic, yang disebut F2-

isoprostanes (IsoP) telah terbukti spesifik untuk peroksidasi lipid [30]. Tidak seperti alat tes
TBA, pengukuran IsoP tampaknya spesifik untuk lipid peroksida, mereka stabil dan tidak

diproduksi oleh jalur enzimatik membuat interpretasi lebih mudah.

Ada sejumlah kit ELISA komersial yang dikembangkan untuk IsoP, tetapi agen yang

mengganggu dalam sampel membutuhkan pemurnian sebagian sampel sebelum menjalankan

alat tes. Satu-satunya cara yang dapat diandalkan untuk deteksi adalah melalui penggunaan

GC / MS, yang membuatnya mahal dan membatasi throughput [31].

Peroksidasi lipid dalam sel hidup dapat divisualisasikan menggunakan turunan neon

yang melembabkan membran. Misalnya, oksidasi poli tak jenuh butadienyl porsi BODIPY®

581⁄591 asam undecanoic fluorophore menghasilkan pergeseran emisi fluoresensi dari 590

nm ke 510 nm [32, 33] (Gambar 7). Reagen ini tersedia secara komersial sebagai Image-iT®

Lipid Peroxidation Kit (Life Technologies) menyediakan metode ratiometric sederhana untuk

mendeteksi degradasi oksidatif lipid seluler dalam sel hidup [34]. Rasio fluoresensi merah

terhadap fluoresensi hijau memberikan ukuran peroksidasi lipid yang independen dari faktor-

faktor seperti kepadatan lipid yang dapat mempengaruhi pengukuran dengan probe

singleemission. Karena reagen ini kompatibel dengan sel hidup, pengukuran dapat

berlangsung secara real time tanpa fiksasi dan pewarnaan. Reagen ini juga telah digunakan

untuk menunjukkan kapasitas antioksidan plasma [35] dan vesikel lipid [36].
 Gambar 7. Struktur C11-BODIPY (581/591).

Peroksidasi lipid memperoleh modifikasi protein dalam sel tetap dapat dideteksi

menggunakan linoleamide alkyne (LAA) bersama dengan Click-iT® kimia (Life

Technologies). Asam linoleat adalah asam lemak tak jenuh ganda yang paling berlimpah

yang ditemukan pada mamalia dan produk peroksidasi lipidnya kemungkinan menyumbang

sebagian besar karbonil protein yang berasal dari lipid [37]. Ketika diinkubasi dengan sel

hidup, LAA dimasukkan ke dalam membran sel. Setelah peroksidasi lipid, LAA yang terikat

membran dioksidasi dan menghasilkan asam 9 dan 13-hidroperoxy-octadecadienoic

(HPODE). Hidroperoksida ini terurai α.β tak jenuh yang mudah memodifikasi protein di

sekitarnya. Setelah sel diperbaiki, protein yang mengandung alkyne yang dihasilkan dapat

dideteksi dengan bereaksi dengan Alexa Fluor® 488 azide (Gambar 8).
 Gambar 8. Mechansim aksi Click-iT® LAA.

Superoksida

Deteksi superoksida didasarkan pada interaksi superoksida dengan beberapa senyawa

lain untuk menciptakan hasil yang terukur. Pengurangan ferricytochrome c ke

ferrocytochrome c telah digunakan dalam sejumlah situasi untuk menilai tingkat

pembentukan superoksida [38]. (Eq 4)

Meskipun tidak sepenuhnya spesifik untuk superoksida reaksi ini dapat dipantau

secara koloris pada 550 nm. Penambahan inhibitor enzim seperti CN- atau pemulung spesies

reaktif seperti catalase dapat meminimalkan reoksidasi. Aconitase mengadalisis konversi

citrate menjadi isokitrat. Superoksida menonaktifkan enzim ini dengan mengoksidasi moiety

Fe (II) dari kluster {4Fe-4S} kuba. Dengan demikian konsentrasi superoksida dapat

diperkirakan oleh tingkat inaktivasi enzim. Aktivitas enzim dapat dipantau dengan mengikuti

konversi 20 mM yang berinokrat untuk cicaconitate menggunakan penyerapan pada 240 nm.

Alat tes yang digabungkan di mana produk akonitas, isokitrat kemudian dikonversi menjadi

α-ketoglutarate oleh NADP + dependen isocitrate dehydrogenase juga dapat digunakan.

Dalam reaksi ini produksi NADPH dapat dipantau secara koloris pada 340 nm [21].

Reaksi chemiluminescent telah digunakan untuk potensi peningkatan sensitivitas atas

metode deteksi berbasis penyerapan. Substrat chemiluminescent yang paling banyak

digunakan adalah Lucigenin, tetapi senyawa ini memiliki kecenderungan untuk bersepeda

redoks, yang telah menimbulkan keraguan tentang penggunaannya dalam menentukan tingkat

kuantitatif produksi superoksida [39]. Penggunaan konsentrasi rendah senyawa ini telah

disarankan sebagai sarana untuk meminimalkan masalah ini. Coelenterazine juga telah

digunakan sebagai substrat chemiluminescent. Senyawa lypophilic ini tidak siklus redoks dan

lebih cerah daripada Lucigenin. Namun tidak sepenuhnya spesifik terhadap superoksida,

karena kehadiran peroxynitrite akan menghasilkan chemiluminescence [40].

 Pewarna hidrosianin adalah sensor fluorogenik untuk superoksida dan radikal

hidroksil. Pewarna ini disintesis dengan mengurangi kation iminium pewarna sianin (Cy)

dengan natrium borohydride. Sementara fluorescent lemah, setelah oksidasi intensitas

fluoresensi mereka meningkat 100 kali lipat. Selain neon, oksidasi juga mengubah molekul

dari membran permeabel menjadi moiety kedap ionik [41]. Yang paling berkarakter dari

probe ini adalah Hydro- Cy3 dan Hydro-Cy5.

Produksi seluler superoksida dapat divisualisasikan oleh dihidium, juga disebut

sebagai hidroetilium. Senyawa ini menunjukkan fluoresensi biru dalam cytosol sampai

teroksidasi terutama oleh superoksida dan ke tingkat yang jauh lebih rendah oksigen reaktif

lainnya atau spesies nitrogen reaktif. Oksidasi dihidrium menghasilkan hidroksilasi pada

posisi 2 membentuk 2-hidroksiethidium (Gambar 9). Dengan oksidasi senyawa yang

disingkat dengan DNA seluler, menodai inti merah neon terang dengan eksitasi yang

dilaporkan dan panjang gelombang emisi masing-masing 535 nm dan 635 nm [42].

Gambar 9. Oksidasi Dihidium ke 2-Hydroxyethidium oleh Superoxide.

Superoksida khusus untuk mitokondria dapat divisualisasikan menggunakan

mikroskopi fluoresensi dengan MitoSOX™ Reagen Merah (Life Technologies). MitoSOX™

Red reagen adalah turunan kationik dihydroethidium yang meresap sel hidup di mana ia

secara selektif menargetkan mitokondria. Substituen triphenylphosphonium kationik dari

Indikator Merah MitoSOX bertanggung jawab atas penyerapan probe yang didorong secara

elektroforetik dalam mitokondria yang aktif membenci (Gambar 10). Seperti halnya

dihidroethidium, senyawa ini berhubungan dengan DNA mitokondria yang mengakibatkan

fluoresensi merah. Sementara pengukuran fluoresensi dapat dilakukan menggunakan panjang

gelombang eksitasi puncak 510 nm dengan deteksi emisi pada 590 nm, telah dilaporkan

bahwa puncak eksitasi yang lebih rendah pada ~ 400 nm yang tidak ada dalam spektrum

eksitasi produk oksidasi ethidium yang dihasilkan oleh spesies oksigen reaktif selain

superoksidasi dapat memberikan diskriminasi yang lebih baik dari superoksida [4].
 Gambar10. Struktur MitoSox teroksidasi™ indikator superoksida mitokondria merah.

Generasi spesies oksigen reaktif mitokondria dapat diamati dengan pencitraan

MitoSOX™ bernoda. Sebagai contoh, obat anti-inflamasi non-steroid Diclofenac telah

dikaitkan dengan hepatotoksisitas melalui induksi spesies oksigen reaktif [43]. Stres oksidatif

mitokondria dikonfirmasi menggunakan alat tes MitoSOX; setelah tiga titrasi log diklofenak

dari mikrotissue hati selama tiga hari, sinyal yang meningkat secara signifikan dari probe

fluorescent merah hanya terlihat di do tertinggi (300 μM), menunjukkan bahwa begitu

ambang batas tercapai kadar superoksida yang meningkat tidak dapat lagi dinetralisir
(Gambar 11).

Gambar 11. Mitokondria Penilaian Stres Oksidatif Setelah Tiga Hari Diklofeenac Dosing. Gambar
overlaid microtissues hati 3D, diwarnai dengan Hoechst 33342 (biru) dan MitoSOX™ Red (merah);
ditangkap menggunakan saluran pencitraan DAPI atau RFP Cytation 3. Fokus otomatis dilakukan pada
sel bernoda DAPI [44].

Reagen cellrox® adalah serangkaian reagen berpenyaksi dari Life Technologies.

Pewarna sel-permean ini lemah neon sementara dalam keadaan berkurang dan menunjukkan

fluoresensi fototable pada oksidasi oleh spesies oksigen reaktif (ROS). CellROX® hijau

hanya menjadi neon dengan pengikatan berikutnya ke DNA, membatasi kehadirannya pada

inti atau mitokondria. Senyawa ini memiliki panjang gelombang eksitasi 485 nm dan panjang

gelombang emisi 520 nm, membuatnya dapat diandalkan untuk pencitraan menggunakan set

filter GFP Hijau. Reagen ini dapat diperbaiki secara formaldehida dan sinyalnya bertahan

dari perawatan deterjen, memungkinkannya multipleks dengan pewarna dan antibodi lain

yang kompatibel. CellROX® Orange dan CellROX® Deep Red tidak memerlukan
pengikatan DNA untuk fluoresensi dan terlokalisasi dalam sitoplasma. CellROX® oranye

memiliki panjang gelombang eksitasi 545 dan emisi 565 dan dapat dicitrakan dengan kubus

filter RFP, sementara CellROX® Deep Red memiliki puncak eksitasi 640 nm dan puncak

emisi 665 nm dan dapat dicitrakan dengan kubus CY5.

Hidrogen peroksida

Hidrogen peroksida (H2O2) adalah ROS yang paling penting dalam hal stimulasi

mitogenik atau pengaturan siklus sel. Ada sejumlah substrat fluorogenik, yang berfungsi

sebagai donor hidrogen yang telah digunakan bersama dengan enzim peroxidase (HRP) lobak

untuk menghasilkan produk fluorescent yang intens [21]. Meskipun daftarnya cukup luas,

substrat yang lebih umum digunakan termasuk diacetyldichloro-fluorescein [45], asam

homovanillic [46], dan Amplex® Red [47]. Dalam contoh ini, peningkatan jumlah bentuk

H2O2 meningkatkan jumlah produk fluorescent. Misalnya, Amplex Red dioksidasi oleh

hidrogen peroksida di hadapan HRP dan dengan melakukannya dikonversi ke resorufin [47].

Tidak seperti Amplex Red, resorufin adalah senyawa berwarna tinggi yang dapat dideteksi

secara koloris pada 570 nm atau dengan fluoresensi menggunakan eksitasi 570 nm dan emisi

585 nm [48] (Gambar 12).

 Gambar12. Konversi Amplex Red ke resorufin oleh HRP menggunakan H2O2.

Asam homovanilik mengalami dimerisasi ketika dioksidasi oleh hidrogen peroksida

melalui katalisis peroksidase lobak. Seperti halnya Amplex red, monomer asam homovanillic

non-fluorescent, tetapi sebagai dimmer, ia memiliki panjang gelombang eksitasi puncak 315

nm, dengan panjang gelombang emisi 425 nm (Gambar 13). Perawatan harus dilakukan

ketika menggunakan senyawa ini untuk menilai produksi hidrogen peroksida. Sifat dekat UV
dari eksitasi dan panjang gelombang emisi untuk pengukuran fluoresensi membuat senyawa

ini rentan terhadap sinyal latar belakang yang tidak biasa, terutama ketika mikroplates

polystyrene digunakan. Beberapa metalloporphoryns mirip peroxidase telah terbukti kataltik

untuk reaksi selain HRP [49].

 Gambar13. Dimerisasi asam homovanillic dengan aksi HRP dan hidrogen peroksida.

Sejumlah substrat kolorimetris seperti tetramethylbenzidine (TMB) dan phenol red

juga telah digunakan bersama dengan HRP untuk mengukur konsentrasi hidrogen peroksida.

Secara umum cara kolorimetrik kurang sensitif daripada metode deteksi fluorescent, tetapi

biaya instrumentasi secara signifikan lebih rendah daripada yang diperlukan untuk

pengukuran berbasis fluoresensi saat menggunakan metodologi deteksi berbasis tabung atau

mikroplate.

Ada sejumlah masalah yang harus diperhatikan ketika menggunakan substrat yang dikatalkan

HRP untuk mengukur hidrogen peroksida. Senyawa seluler seperti thiol dapat berfungsi

sebagai substrat untuk HRP. Aktivitas katealase endogen dapat secara artifisual mengurangi

jumlah H2O2 yang ada. Komponen seluler dapat mempengaruhi sinyal fluorescent tergantung
pada eksitasi dan panjang gelombang emisi, seperti halnya dimer homovanillic, sementara

panjang gelombang lainnya mungkin menderita antrian sinyal.

Tarpley et. al. merangkum utilitas alat tes yang terkait dengan HRP cukup ringkas

dengan menyatakan bahwa metode ini cukup berguna untuk kuantifikasi H 2O2- tingkat"... sel-

sel berbutur, budaya organ dan penyangga terisolasi persiapan jaringan tahu. Namun metode

ini tidak cocok untuk penentuan H2O2dalam plasma, atau serum karena banyak agen pengurang

hadir dalam cairan ekstraseluler ..."[21].

Oksidasi dichlorofluorescin (H2DCF) 2'-7' hingga 2'-7'dichlorofluorescein (DCF)

telah digunakan cukup luas untuk kuantitasi H2O2. Bentuk diacetate, H2DCFDA dan

acetomethyl ester H2DCFDA-AM diambil oleh sel-sel di mana esterases seluler non spesifik

bertindak di atasnya untuk membelah kelompok lipofilik, mengakibatkan senyawa bermuatan

yang diyakini terperangkap di dalam sel. Oksidasi H2DCF oleh ROS mengubah molekul

menjadi 2', 7' dichlorodihydrofluorescein (DCF), yang sangat neon (Gambar 14). Panjang

gelombang yang dilaporkan untuk pengukuran fluoresensi DCF adalah 498 nm untuk eksitasi

dan 522 nm untuk emisi.

 Gambar 14. Pembentukan Fluorescent Compound DCF oleh ROS.

Awalnya, DCF dianggap spesifik untuk hidrogen peroksida, tetapi bukti terbaru telah

menunjukkan bahwa ROS lain seperti nitrat dan asam hipoklorus dapat mengoksidasi

H2DCF [18]. Yang paling penting adalah fakta bahwa H 2O2 -oksidasi tergantung H2DCF

membutuhkan besi besi [50]. Selain itu, karena H2DCF tidak lagi ionik itu tidak dikecualikan

dari migrasi keluar dari sel dan menumpuk di media, di mana bebas berinteraksi dengan

oksidan. Selain pengukuran fluoresensi berbasis PMT, fluoresensi DCF teroksidasi dapat di

image menggunakan set filter FITC atau GFP. Misalnya, quinoline sitotoksik alkaloid

camptothecin, yang menghambat DNA topoisomerase I, menyebabkan stres oksidatif dengan

hepatosit primer berbumbu [51]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 15, konsentrasi

mikromolar camptothecin biasanya menginduksi produksi ROS di sekitar 10-20% sel di

bidang pandang.
 Gambar 15. Fluoresensi DCF teroksidasi dalam hepatosit. Gambar hepatosit berbubu yang ditangkap
setelah perawatan 0 dan 30 menit dengan camptothecin 800 nM. Inti sel diwarnai dengan Hoechst 33342
(biru), mitokondria diwarnai dengan MitoTracker® Red (Merah); dan reagen DCF teroksidasi
divisualisasikan dalam warna hijau [68]. Gambar ditangkap menggunakan Cytation™ 3 Imaging
multimode microplate reader (BioTek Instruments) menggunakan tujuan 20x.

Untuk mengatasi kelemahan fluoresensi DCF beberapa probe fluorescent baru telah

dikembangkan. Dua probe tersebut adalah Peroxy Green 1 (PG1) dan Peroxy Crimson 1

(PC1). Probe H2O2 berbasisboronat ini telah dilaporkan memiliki selektivitas tinggi,

permeabilitas membran, bersama dengan eksitasi panjang gelombang terlihat dan panjang

gelombang emisi [50]. Bereaksi dengan hidrogen peroksida, menghasilkan peningkatan

fluoresensi 10 kali lipat dan 40 kali lipat untuk PG1 dan PC1. PG1 menampilkan panjang

gelombang eksitasi 460 nm dengan maxima emisi pada 510 nm (Gambar 16). PC1

menunjukkan peningkatan karakteristik eksitasi bergeser merah dan pergeseran stokes yang

lebih besar yang mengurangi autofluoresensi (eksitasi: 480 nm; emisi: 584 nm) [52].
 Gambar 16. Struktur Peroxy Green 1 dan Peroxy Crimson 1.

Molekul-molekul ini menunjukkan reaksi langsung dengan hidrogen peroksida tidak

diamati dengan H2DCF. Selain itu molekul-molekul ini tidak reaktif terhadap spesies logam-

oxo berdasi tinggi yang berasal dari heme-protein dan H2O2. DCFH biasanya menunjukkan

respons yang lebih besar terhadap kombinasi ini daripada terhadap H2O2.

Calcein-acetoxymethylester (Calcein-AM) juga telah dilaporkan sebagai detektor

aktivitas oksidatif intraseluler [53]. Calcein-AM adalah senyawa permeabel sel fluorogenik
yang dikonversi oleh esterases intraseluler ke dalam kalsin anion impermean sel, yang

berfembagrum (Gambar 17). Secara historis produksi kalsin intraseluler telah digunakan

dalam mikroskopi dan fluorometer sebagai indikator sel yang layak. Sehubungan dengan

deteksi ROS, kinetik reaksi ROS menguntungkan relatif terhadap konversi esterease ke

calcein.

Produk beroksidasi ROS dari Calcein AM telah terbukti berbeda secara kimia dari

Calcein-AM melalui kromatografi lapisan tipis [53], tetapi masih mempertahankan

kemampuan untuk melintasi membran sel dan memiliki sifat spektral yang sama dengan

kalsin fluorescent. Dengan demikian penting untuk menjaga senyawa di media daripada

mencucinya setelah pemuatan sel, yang biasanya dilakukan ketika menggunakan senyawa

untuk kelangsungan hidup sel. Penghapusan pewarna menghasilkan pergerakan senyawa

yang bereaksi kembali keluar dari sel pada gradien konsentrasi. Sifat fisik Calcein AM juga

berbeda dari Calcein-AM atau Calcein karena pewarna cenderung agregat dan membentuk

lokalisasi yang sangat neon di dalam sel. Meskipun pewarna ini memiliki kemungkinan

dengan mikroskopi konfokal di mana lokalisasi seluler dimungkinkan, ketidakmampuan

untuk membedakan spektral antara ROS bereaksi kalsin-AM dan produk bereaksi esterase

membuat penggunaan pewarna ini dalam mikroplates bermasalah.

Gambar17. Struktur Calcein-AM.

Oksida Nitrat
 Oksida nitrat radikal bebas (•NO) diproduksi oleh sejumlah jenis sel yang berbeda

dengan berbagai fungsi biologis. Oksida nitrat adalah produk dari oksidasi L-arginin ke L-

citrulline dalam proses dua langkah yang dikategisikan oleh enzim nitric oxide synthase

(NOS). Dua isoform utama sintase oksida nitrat telah diidentifikasi. Isoform konstitutif yang

ditemukan dalam neuron dan sel endotel, menghasilkan jumlah oksida nitrat yang sangat

rendah dalam mode tergantung kalsium dan calmodulin. • NO mengaktifkan siklonik

guanlyate larut dalam sel target, menghasilkan peningkatan kadar cGMP, yang pada

gilirannya memfasilitasi transmisi neuronal dan relaksasi pembuluh darah, dan menghambat

agregasi trombosit [54].

Isoform yang tidak dapat diotomatisasi, ditemukan dalam makrofag, fibroblas, dan

hepatosit, menghasilkan • TIDAK dalam jumlah yang relatif besar dalam menanggapi

rangsangan inflamasi atau mitogenik dan bertindak dalam peran defensif inang melalui

toksisitas oksidatifnya [55]. Terlepas dari sumber atau perannya, radikal bebas •NO memiliki

umur paruh yang sangat pendek (t1/2 = 4 detik), bereaksi dengan beberapa molekul berbeda

yang biasanya ada untuk membentuk nitrat (NO3 -) atau nitrit (NO2 -)

Metode yang umum digunakan untuk penentuan tidak langsung dari •NO adalah penentuan

produk komposisi nitrat dan nitritnya secara koloris. Reaksi ini mengharuskan nitrat

(NO3)pertama-tama dikurangi menjadi nitrit (NO2), biasanya oleh aksireduktase nitrat

(Gambar 18).
 Gambar 18. Konversi nitrat menjadi nitrit oleh aksi Nitrat Reductase.

Penentuan nitrit berikutnya dengan proses dua langkah (Gambar 19) memberikan

informasi tentang "total" nitrat dan nitrit. Di hadapan ion hidrogen nitrit membentuk asam

nitrous, yang bereaksi dengan sulfanilamida untuk menghasilkan ion diazonium. Ini

kemudian ditambah dengan Etilendiamine N-(1-napthyl) untuk membentuk kromosfer yang

menyerap pada 543 nm [56].

Penentuan nitrit hanya dapat dibuat dalam tes paralel di mana sampel tidak berkurang

sebelum alat tes kolorimetris. Tingkat nitrat aktual kemudian dihitung dengan pengurangan

kadar nitrit dari total. Alat tes ini relatif murah dan mudah dilakukan. Reagen mudah

diperoleh dan ada banyak kit komersial yang tersedia untuk alat tes ini.
Gambar 19. Reaksi Greiss untuk penentuan nitrat.
 Untuk meningkatkan sensitivitas tes reagen Griess untuk • TIDAK ada sejumlah alat

tes fluorometrik telah dikembangkan. Seperti reaksi Griess mereka tergantung pada

dinitrogen trioksida atau asam nitrous (N2O3), yang terbentuk secara spontan oleh

pengasaman nitrit (NO2 -). Metode yang paling umum digunakan menggunakan 2, 3-

diaminonaphthalene (DAN), yang relatif nonfluorescent, untuk bereaksi dengan asam nitro

untuk membentuk 2, 3 naphthotriazole (NAT), yang sangat neon dengan panjang gelombang

eksitasi 375 nm dan panjang gelombang emisi 415 nm (Gambar 20).

Gambar. 20. Deteksi fluorometrik nitrit menggunakan 2, 3-diaminonaphthalene (DAN).

Sensor Yang Dikodekan Secara Genetik

Biosensor berbasis protein fluorescent telah dikembangkan untuk penyelidikan ROS

di situ secara real time. Generasi baru sensor fluorescent sel hidup ini menghasilkan

perubahan fluoresensi dalam menanggapi perubahan dalam keadaan redoks atau dengan

fluktuasi dalam analit target tertentu. Sensor ini dikodekan secara genetik, berdasarkan
protein fluorescent tunggal dan tidak memerlukan penambahan reagen atau lisis sel lainnya,

membuatnya sangat layak untuk multipleks.

Protein fluorescent hijau sensitif reduksi -oksidasi (roGFP) adalah contoh biosensor

sensitif redoks. Dua sistein dimasukkan ke dalam permukaan yang terpapar residu struktur β

barel dalam posisi yang tepat untuk membentuk ikatan disufeksi protein GFP dari Aequorea

victoria. Keadaan oksidasi thiol yang direkayasa menentukan sifat fluoresensi sensor [57].

Awalnya, versi roGFP yang berbeda disajikan untuk memungkinkan pencitraan in vivo

mengurangi kompartemen seperti cytosol (roGFP2) pada tanaman [58], dengan sistein yang

diperkenalkan pada posisi asam amino 147 dan 204 ditemukan untuk menghasilkan

perubahan terbesar [59]. Kekhususan roGFP2 untuk glutathione semakin meningkat dengan

menghubungkannya dengan glutaredoxin manusia 1 (Grx1) [60]. Glutaredoxins adalah enzim

kecil yang teroksidasi oleh substrat dan dikurangi secara non-enzimatis oleh glutathione.

Dengan mengekspresikan sensor fusi Grx1-roGFP dalam organisme yang menarik dan / atau

menargetkan protein ke kompartemen seluler, adalah mungkin untuk mengukur potensi

redoks glutathione dalam kompartemen seluler tertentu secara real-time, yang merupakan

keuntungan signifikan daripada metode statis invasif. Perhatikan bahwa probe ini tidak secara

langsung mengukur senyawa ROS. Namun mendeteksi pergeseran keseimbangan glutathione

teroksidasi / berkurang (GSH / GSSG). Dalam hal deteksi, roGFP memiliki dua eksitasi

fluoresensi maxima sekitar 400 dan 490 nm dengan emisi 515 umum yang menampilkan

perubahan rasiometris yang cepat dan dapat dibalik dalam fluoresensi dalam menanggapi

perubahan potensi redoks secara in vitro dan in vivo. Pembentukan disulfid menghasilkan

protonasi GFP dengan peningkatan sinyal eksitasi 405 dengan mengorbankan sinyal eksitasi

488 nm ketika output emisi pada 510 nm ditentukan. Dengan demikian rasio fluoresensi dari

eksitasi pada 405 dan 488 nm menunjukkan tingkat oksidasi. Karena pengukuran ini adalah

ratiometric, variasi dalam tingkat biosensor atau sensitivitas optik yang diinduksi matriks
diperbaiki untuk.

Gambar 21. Prinsip GFP sensitif redoks ratiometric. Intensitas fluoresensi relatif dari dua maxima eksitasi
pergeseran roGFPs tergantung pada keadaan redoks: pengurangan menyebabkan penurunan eksitasi pada 400
nm dan peningkatan eksitasi pada 480 nm (panah). Dari [61].
Untuk secara langsung merasakan H2O2 konstruksi roGFP telah dikaitkan dengan

peroxidase Orp1, protein ragi yang membentuk disulim pada reaksi dengan H 2O2,

yangditransfer ke roGFP melalui mekanisme pertukaran thiol-disufide [62]. Reaksi dapat

dibalik melalui aksi thioredoxin seluler (Trx) atau sistem GRx/GSH. Probe ini juga tersedia

sebagai konstruksi BacMam 2.0 di bawah moniker Premo™ (Life Technologies) untuk

memungkinkan transfeksi yang mudah.

Metode lain untuk merasakan H2O2 secara langsung adalah untuk mengkonjugasikan

protein fluorescent yang diselingi secara melingkar dengan domain protein redoks-reaktif,

sehingga perubahan konformasi yang dibawa oleh aktivitas redoks diterjemahkan ke protein

fluorescent. Salah satu chimera tersebut, yang disebut HyPer, dirancang di laboratorium

Sergey A. Lukyanov [63]. HyPer terdiri dari protein fluorescent kuning melingkar (cpYFP)

yang dimasukkan ke dalam domain peraturan prokaryotik H2O2- proteinpenginderaan, OksiR

[64, 65]. HyPer2, versi probe yang ditingkatkan, dihasilkan oleh mutasi satu titik A406V dari

HyPer yang sesuai dengan A233V dalam jenis liar OxyR [64]. Tidak seperti chimera roGFP-

Orp1, tidak ada transfer thiol-disulfide transfer, melainkan dua sistein OxyR membentuk
ikatan disulufida yang dapat dibalik yang menginduksi perubahan konformasi yang ditransfer

ke moiety cpYFP [65]. HyPer menunjukkan afinitas submikromolar terhadap hidrogen

peroksida dan telah terbukti tidak sensitif terhadap oksidan lain, seperti superoksida,

glutathione teroksidasi, oksida nitrat, dan peroksinitrite.

Sensor yang dikodekan secara genetik dapat ditargetkan ke kompartemen seluler

tertentu dengan menggunakan urutan perdagangan seluler sebagai bagian dari molekul

chimeric. Misalnya peptida dapat ditargetkan ke inti dengan memasukkan pengulangan sinyal

lokalisasi nuklir (NLS), yang terdiri dari urutan pendek lysines dan arginin bermuatan positif

yang terpapar pada permukaan protein. Urutan ini diakui oleh protein seluler (importin α dan

importin β), yang memediasi transportasinya ke dalam nuklease. Urutan serupa dapat

digunakan untuk mengarahkan sensor ROS ke mitokondria, peroksom atau sitoplasma.

G. Diskusi

Minat pada spesies oksigen reaktif awalnya berputar di sekitar patologi yang terkait

dengan efek menghapus respirasi aerobik: kejahatan yang diperlukan yang disebabkan oleh

kebocoran dari rantai transportasi elektron di mitokondria. Dalam konteks ini, penelitian

melibatkan peran yang dimainkan agen-agen ini dalam penuaan, penyakit kronis dan kanker.

Perbatasan baru lahir dengan penemuan bahwa "ledakan oksidatif" oleh sel-sel

phagocytic sebenarnya adalah hasil dari produksi spesies oksigen reaktif yang disengaja. Ini

dianggap sebagai aplikasi yang sangat spesifik di mana sel-sel tertentu menghasilkan apa

yang hanya dapat digambarkan sebagai agen beracun untuk membunuh mikroorganisme yang

menyerang. Pekerjaan terbaru lebih lanjut telah menunjukkan bahwa ROS diproduksi di

semua jenis sel dan berfungsi sebagai utusan seluler penting untuk komunikasi intra dan

antar-seluler. Sekarang jelas bahwa sistem regulasi intra-seluler yang sangat kompleks yang

melibatkan ROS ada dalam sel. Sel menanggapi moieties ROS dengan cara yang berbeda
tergantung pada intensitas, durasi, dan konteks sinyal. Dalam hal sinyal intraseluler

tampaknya hidrogen peroksida (H2O2) adalah kandidat yang paling menarik, sementara

oksida nitrat (•TIDAK) terlibat terutama dengan sinyal interseluler.

Kimia yang digunakan pada awalnya untuk deteksi ROS terutama berbasis

pengukuran penyerapan. Penelitian umumnya melibatkan pengukuran kadar glutathione

untuk menilai stres oksidatif pada jaringan atau seluruh tingkat tubuh. Dengan tingkat

millimolar pengukuran berbasis penyerapan analyte di mana lebih dari cukup menjadi

informatif dan kuantitatif. Dengan penemuan bahwa ROS digunakan sebagai utusan dan

regulator intraseluler, kimia baru dikembangkan dengan urus persyaratan deteksi mikromolar

dalam pikiran. Agen-agen ini terutama berbasis fluoresensi, tetapi baru-baru ini deteksi

berbasis bercaham telah diperkenalkan.

Munculnya analisis berbasis gambar menggunakan sensor fluorescent molekul kecil

atau sensor yang dikodekan secara genetik telah memberikan wawasan baru dalam hal

penelitian ROS. Analisis gambar tidak hanya dapat memberikan informasi kuantitasi, tetapi

juga lokalisasi seluler. Ini dapat dicapai melalui desain reporter atau analisis gambar.

Reporter ROS kimia atau sensor ROS yang dikodekan secara genetik telah dirancang dengan

struktur kimia atau urutan peptida, masing-masing, yang mengakibatkan lokalisasi detektor

ke organel seluler tertentu (misalnya inti, mitokondria, lysosome, dll.). Oleh karena itu setiap

perubahan citra dapat secara langsung dikaitkan dengan lokasi seluler tertentu. Atau,

lokalisasi perubahan ROS dengan reporter yang tidak spesifik organelle dapat dicapai

kolokalisasi dengan noda terkait non ROS yang spesifik lokasinya. Dengan melapisi gambar

warna terpisah lokasi seluler dapat diidentifikasi.

Kesulitan terbesar yang dilaporkan dengan banyak penelitian ROS seluler telah

dengan kurangnya agen reporter khusus untuk molekul diskrit. Ros moieties oleh sifat

mereka reaktif dengan sejumlah molekul yang berbeda; seperti merancang agen reporter telah
sulit. Dengan kimia yang lebih spesifik, terutama untuk hidrogen peroksida, mekanisme

khusus untuk regulasi akan disucikan.

References

1. Hancock, J.T., R. Desikan, S.J. Neill, (2001) Role of Reactive Oxygen Species in Cell
Signaling Pathways. Biochemical
and Biomedical Aspects of Oxidative Modification, 29(2):345-350.
2. Jones, D.P. (200) Redox Potential of GSH/GSSG Couple: Assay and Biological
Significance. Methods of Enzymology, 348:93-112.
3. McCord, J.M. and I. Fridovich (1968) The Reduction of Cytochrome C by Milk
Xanthinse Oxidase. J. Biol. Chem. 243:5733-5760.
4. Gartel, A.L. ans S.K. Radhakrishnan (2005) Lost in Transcription: p21 repression,
mechanisms and consequences. Cancer Research 65:3980-3985.
5. Burhans, W. and N. Heintz (2009) The Cell Cycle is a Redox Cycle: Linking phase-
specific targets to cell fate. Free Radical Biology and Medicine. 47:1282-1294.
6. Gilley, J. , P.J. Coffer and J. Ham (2003) FOXO Transcription Factors Directly Activate
bim Gene Expression and Promote Apoptosis in Sympathetic Neurons. J. Cell Biol.
162:613-622.
7. Kops, G.J., T.B. Dansen, P.E. Polderman, I. Saarloos, K. Wirtz, P.J. Coffer, T.T. Huang,
J.L. Bos, R.H. Medema, and B.M. Burgering. (2002) Forkhead Transcription Factor
FOXO3a Protects Quiescent Cells from Oxidative Stress. Nature 419:316-321.
8. Babior, B.M., R.S. Kipnes, and J.T. Curnutte (1973) The Productions by leukocytes of
superoxide; a Potential Bactericidal Agent. J. Clin. Invest. 52:741.
9. Hancock, J.T., R. Desikan, S.J. Neill, (2001) Role of Reactive Oxygen Species in Cell
Signaling Pathways. Biochemical and Biomedical Aspects of Oxidative Modification,
29(2):345-350.
10. Bokoch, G.m. and B.D. Diebold (2002) Current Molecular Models for NADPH Oxidase
Regulation by Rac GTPase. Blood. 100:2692-2696.
11. Lambeth, J., G. Cheng, R. Arnold, and W. Edens (2000) Novel Homologs of gp91phox.
TIBS 25:459-461.
12. Hou Y.C., Janczuk A. and Wang P.G. (1999) Current trends in the development of nitric
oxide donors. Curr. Pharm. Des. June, 5 (6): 417–471.
13. Forman, H.J. and M. Torres (2002) Reactive Oxygen Species and Cell Signaling,
Respiratory Burst in Macrophage Signaling, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166:s4-s8.
14. Park, H.S., D. Park, and Y.S. Bae (2006) Molecular Interaction of NADPH Oxidase 1
with betaPix and Nox Organizer 1. Biochemical and Biophysical Research
Communications 339:985-990.
15. Burch, P.M. and H.H. Heintz (2005) Redox Regulation of Cell-cycle Re-entry: Cyclin D1
as a Primary Target for the Mitogenic Effects of Reactive Oxygen and Nitrogen Species.
Antioxidants & redox Signaling 7:741-751.
16. Choi, M.H., I. K. Lee, G.W. Kim, B.U. Kim, Y.H. Han, D.Y. Yu, H.S. Park, K.Y. Kim,
J.S. Lee, C. Choi, Y.S. Bae, B.I. Lee, S.G. Rhee, and S.W. Kang, (2005) Regulation of
PDGF Signalling and Vascular Remodelling by Peroxiredoxin II. Nature, 435:347-353.
17. Latella, L.; A. Sacco., D. Pajalunga, M. Tianen, D. Macera, M. D’Angelo, A. Felici, A.
Sacchi, and M. Crescenzi. (2001) Reconstitution of Cyclin D1-associated Kinase Activity
Drives Terminally Differentiated Cells into the Cell Cycle. Molecular and Cellular
Biology 21:5631-5643.
18. Hoffman, A, L.M. Spetner, and M. Burke (2008) Ramifications of a Redox Switch within
a Normal Cell; its Absence in a Cancer cell. Free Radical Biology and Medicine 45:265-
268.
19. Havens, C.G., A. Ho, N. Yoshioka, and S.F. Dowdy (2006) Regulation of Late G 1/S
Phase Transition and APCCdh1 by Reactive Oxygen Species. Molecular and Cellular
Biology, 26:4701-4711.
20. Nakano, H. A. Nakajima, S. Sakon-Komazawa, J-H. Piao, X. Xue, and K. Okumura
(2006) Reactive Oxygen Species Mediate Crosstalk between NF-kB and JNK. Cell Death
and Diff. 13:730-737.
21. Tarpley, M.M., D.A. Wink, and M.B. Grisham (2004) Methods for detection of reactive
Metabolites of Oxygen and Nitrogen: in vitro and in vivo considerations. Am . J. Physiol
Regul Integr Comp Physiol. 286:R431-R444.
22. Jones, D.P. (2002) Redox potential of GSH/GSSH couple: assay and biological
significance. Methods Enzymology. 348:93-112.
23. E. Camera and M. Picardo (2002) Analytical methods to investigate glutathione and
related compounds in biological and pathological processes. J. of Chromatography B.
781:181-206.
24. Baker, MA, G.J. Cerniglia, and A. Zaman. (1990) Microtiter plate Assay for the
measurement of glutathione and glutathione disulfide in large numbers of Biological
Samples. Anal. Biochem., 190:360-365.
25. Promega GSH-Glo Glutathione Assay Technical Bulletin, TB369, Promega Corporation,
Madison, WI.
26. Radkowsky, A.E. and E.M. Kosower (1986) Bimanes 17. (Haloalkyl)-1,5-
diazabicyclo[3.3.O]octadienediones (halo-9,10- dioxabimanes): reactivity toward the
tripeptide thiol, glutathione, J. Am. Chem. Soc 108:4527-4531.
27. Hedley, D.W. (1993) Flow Cytometric Assays of Anticancer Drug Resistance, Ann. New
Yark Academy of Science 677:341-353.
28. Briviba, K., G. Fraser, H. Sies, and B. Ketterer (1993) Distribution of the
monochlorobimamne-glutathione conjugate between nucleus and cytosol in isolated
hepatocytes, Biochem. J. 294:631-633.
29. Pryor, W.A., J.P. Stanley, and E. Blair. (1976) Autoxidation of polyunsaturated fatty
acids: II. A Suggested mechanism for the Formation of TBA-reactive materials from
prostaglandin-like Endoperoxides. Lipids, 11:370-379.
30. Morrow J.D. K.E. Hill, R.F. Burk, T.M. Nammour, B.K. Badr, and L.J. Roberts. (1990) A
Series of Prostaglandin F2-like Compounds are produced in vivo in humans by a non-
cyclooxygenase, free radical-catalyzed mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9383-
9387.
31. Roberts, L.J. and J.D. Morrow (2000) Measurment of F(2)-isoprostanes as an index of
oxidative stress in vivo. Free Radic Biol. Med. 28:170-180.
32. Pap, E.H., G.P. Drummen, J.A. Post, P.J. Rijken, and K.W. Wirtz (2000) Fluorescent
Fatty Acid Monitor Oxygen in Single cells,, Methods Enzymol 319: 603-612.
33. Drummen, G.P, B.M. Gadella, J.A.Post, and J.F. Brouwers (2004) Mass Spectometric
Characterization of the Oxidation of the Fluorescent Peroxidation Reporter Molecule
C11-BODIPY(581/591), Free Radical Biol. Med. 36(12): 1635-164.
34. Pap, E.H., G.P. Drummen, V.J. Winter, T.W. Kooji, P. Rijken, K.W. Wirtz, J.A. Op den
Kamp, W.J. Hage, and J.A. Post, Ratio-fluorescence Microscopy of Lipid Oxidation in
Living Cells using C11-BODIPY(581/591), FEBS Lett 453(3): 278-282.
35. Beretta, G., G. Aldini, R.M. Facino, R.M. Russell, N.I. Krinsky, and K.J. Yeum (2006)
Total Antioxidant Performance: a Validated Fluorescence Assay for the Measurment of
Plasma Oxidizability, Anal. Biochem, 354(2): 290-298.
36. Zhu, M., Z.J. Qin, H.D. Hu, L.A. Munishkina, and A.L. Fink (2006) Alpha-Synucelin can
function as an Antioxidant Preventing Oxidation of Unsaturated Lipid in Vesicles,
Biochemistry 45(26): 8135-8142.
37. Slade, P.G., M.V. Williams, V. Brahmbhatt, A. Dash, J.S. Wishnok, and S.R.
Tannenbaum (2010), Chem Res Toxicol 23(3):557-567.
38. McCord, J.M. and I. Fidovich (1968) The Reduction of Cytochrome C by Milk Xanthine
Oxidase. J. Biol. Chem. 243:5733-5760.
39. Tarpley, M.M. and I. Fridovich (2001) Methods of Detection of Vascular Reactive
Species. Circulation Research 89:224- 236.
40. Tarpley, M.M., C.R. White, E. Suarez, G. Richardson, R. Radi, and B.A. Freeman. (1999)
Chemiluminescence detection of oxidants in vascular tissue: Lucigenin but not
coelenterazine enhances superoxide formation. Circulation Research 84:1203-1211.
41. Kundu, K. S.F. Knight, N. Willet, S. Lee, R. Taylor, and N. Murthy (2009)
Hydrocyanines: A class of fluorescent sensors that can image reactive oxygen species in
cell culture, tissue, and in vivo. Angew. Chem. Int. Ed. 48:299-303.
42. Zielonk, J, J. Vasquez-Vivar, and B. Kalyanaraman (2008) Detection of 2-
hydroxyethidium in Cellular Systems: a Unique Marker Product of Superoxide and
Hydroethidine, Nature Protocols, 3(1):8-21.
43. Pourahmad, J.; Mortada, Y.; Eskandari, M.R.; Shahraki, J. (2011) Involvement of
Lysosomal Labilisation and Lysosomal/mitochondrial Cross-Talk in Diclofenac Induced
Hepatotoxicity. Iran J Pharm Res. 10(4), 877-887.
44. Larson, B., P. Banks, S. Hunt, T. Moeller, and D. Long. (2014) The Impact of a 3-
Dimensional Human Liver Microtissue Model on Long-term Hepatoxicity Studies,
 BioTek Application note, http://www.biotek.com/assets/tech_resources/
InSphero_App_Note_FINAL.pdf.
45. Hinkle, P.C., R.A. Butow, E. Racker, and B. Chance (1967) Partial Resolution of the
Enzymes Catalyzing Oxidative Phosphorylation. Xv Reverse Electron Transfer in the
Flavin-cytochrome beta region of the respiratory chain of beef heart. J. Biol. Chem.
242:5169-5173.
46. Ruch, W., P.H. Cooper, and M. Baggiollini (1983) Assay of H2O2 production by
macrophages and neutrophils with Homovanillic acid and horseradish peroxidase. J.
Immunol Methods 63:347-357.
47. Zhou, M., Z.Diwu, Panchuk-Voloshina, N. and R.P. Haughland (1997), A Stable
nonfluorescent derivative of resorufin for the fluorometric determination of trace
hydrogen peroxide: application in detecting the activity of phagocyte NADPH oxidase
and other oxidases. Anal. Biochem 253:162-168.
48. Reszka, K.J., B.A. Wagner, C.P. Burns, and B.E. Britigan (2005) Effects of peroxidase
substrates on the Amplex red/ peroxidase assay: Antioxidant properties of anthracyclines.
Anal. Biochem. 342:327-337.
49. Ci, Yun-Xiang and F. Wang (1991) Catalytic effects of peroxidase-like metaloporphoryns
on the fluorescence reaction of homovanillic acid with hydrogen peroxide. Fre