Metode Seleksi Dan Identifikasi Bakteri
Metode Seleksi Dan Identifikasi Bakteri
BAKTERI
HOTLINA NAINGGOLAN
OUTLINE
Aspergillus E. coli
Streptomyces Penicillium
Bentuk & Susunan Sel
Sel Bakteri
Karakteristik Kultural
Tampilan pertumbuhan pada media padat
(bentuk koloni, tepi koloni, permukaan koloni dll)
PEMELIHARAAN & PENGAWETAN KULTUR MURNI
• Tujuan :
menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam kondisi hidup
(viable), mencegah terjadinya perubahan genetik & tidak
terkontaminasi --> harus mampu melestarikan karakteristik spesies
mikroba selama diawetkan
• Cara :
1. Pemindahan Secara Periodik
Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke media baru/segar,
contoh : media agar miring
Komposisi media & suhu serta interval waktu pemindahan harus
tepat dan disimpan pada suhu dingin (50C)
murah & mudah, tapi tidak cocok untuk penyimpanan jangka
panjang
bakteri 2-3 minggu, fungi 3-4 minggu
2. Pelapisan Kultur dgn Minyak Mineral
• Permukaan agar miring atau media cair dilapisi dengan minyak
mineral steril (parafin) +/- 0,5 inci
• Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba di bawah
permukaan minyak mineral dg jarum Ose, lalu diinokulasi ke
media segar dengan tetap mempertahankan kultur awal
• Lapisan parafin menjadikan kondisi anaerob dan mencegah
pengeringan medium
• mikroba dorman pengawetan dapat beberapa tahun
3. Liofilisasi Pengeringan beku (freeze-drying)
• Sel mikroba dikering-bekukan & aktivitas metabolisme stop (dorman)
efektif untuk bakteri (dapat tetap hidup & tidak berubah selama
bertahun-tahun
• Cara :
• media berisi senyawa pelindung/penstabil : susu, serum, natrium
glutamat dll
• suspensi mikroba (±0,2 ml) ditempatkan dalam ampul (vial) kaca
• Perendalam dalam es kering + alkohol (-780C) beku
• Ampul dihubungkan dengan kondensor & pompa vakum kering
(sublimasi)
• Ampul ditutup dengan melelehkan ampul kaca tsb dlm keadaan vakum
penyimpanan pada suhu 40 C
• Keuntungan : Cocok untuk penyimpanan jangka panjang (tahunan) &
kemungkinan perubahan kecil & Wadah penyimpanan kecil
Freeze drying Chamber
Sampel
Kondensor
Pompa vakum
Foto Alat Freeze Dryer
4. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah (Cryopreservation)
• Menggunakan nitrogen cair (sekitar -156 sampai-1960C) Sel
dibekukan dengan diberi bahan pelindung beku (gliserol
atau dimetil sulfoksida) mencegah pembentukkan kristal
es & meningkatkan ketahanan hidup sel mikroba
• Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen cair
• Cocok untuk kapang
• Kelebihan : hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak
dapat diawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara ini
PEMANTAUAN VIABILITAS DAN KESTABILAN MIKROBA
Prinsip:
Surface of most
bacterial cell
Principle
The presence of mycolic acids in the cell walls of acid
fast organisms in the cytological basis for this
differential stain
Mycolic acid is waxy substance that gives acid fast cells
a higher affinity for the primary stain and resistance to
decolorization by an acid alcohol solution
Method: Beda:
Ziehl-Neelsen (ZN) method ZN menggunakan pemanasan
Kinyoun (K) method K cold stain
ACID FAST STAIN
ZN Method:
Phenolic compound carbolfuchsin (as the primary
stain lipid soluble and penetrates the waxy cell wall)
Staining by carbolfuchsin is further enhanched by steam
heating the preparation to melt the wax and allow the
stain to move into the cell
Decolorizer acid alcohol (decolorize non acid fast
cells)
Counterstain methylene blue
K-Method:
Same with ZN methode, but without the use of heat
Less sensitive than ZN method
Counterstain brilliant green or methylene blue
ACID FAST STAIN
Other Staining
Fluorescent dyes, such as auramine or rhodamine
Actually preferable to traditional carbolfuchsin stains
for examination of direct smears because of their
higher sensitivity
The fluorochrome combines specifically with mycolic
acid
Acid alcohol is used for decolorization
Potassium permanganate is the counterstain
When observed under the microscope with UV
illuminations, acid-fast cells are yellow against a dark
background and nonacid fast cells are not seen
ENDOSPORE STAIN
Purpose:
To detect the presence and location of spores in
bacterial cells (ex: Bacillus & Clostridium)
Principle
Pora resiten terhadap panas dan kimia oleh karena
membrane luar ditutupi protein keratin
proses pemanasan akan membuka lapisan spora dan
memudahkan masuknya zat warna, impermeabilitas dari
spora akan melindungi zat yang mewarnai spora dari
perlakuan pelunturan atau penambahan zat pewarna sel
vegetatif
ENDOSPORE STAIN
Principle
Capsules composed of mucoid polysaccharides or
polypeptides
The capsule stain technique takes advantage of this
phenomenon by staining around the cells
CAPSULE STAIN
An acidic stain such as congo red or nigrosin that stain
the background
Basic stain that colorizes the cell
The capsule remains unstained and appears as a white
halo between the cells and the colored background
CAPSULE STAIN
Metode pengecatan kapsul
• Metode Burry
Cat yg dipakai Safranin / Methylene Blue
• Metode Stitt Hiss
Cat yg dipakai Basic Fuchsin dgn Alkohol
• Metode Welch
Cat yg dipakai Carbol Fuchsin dgn NaCl
• Metode Anthony
Kristal Violet dgn CuSO4
CAPSULE STAIN (metode burry)
FLAGELL STAIN
Purpose:
The flagella stain allows direct observation of flagella
Presense and arrangement of flagella may be useful in
identifying bacterial species
Principle:
mordant akan meningkatkan afinitas flagel untuk
menyerap zat warna. Koloidal garam asam tanat
menyebabkan presipitat pada dinding sel dan flagel,
sehingga tampak lebih besar dan terwarna dengan
karbolfuhksin
FLAGEL STAIN
Pembuatan Preparat Pengecatan
1. Objek glass dibersihkan 1. Preparat digenangi dengan
dan disterilkan dengan larutan Mordant dan
melewatkan di atas api didiamkan selama 10 menit
sebanyak 3x 2. Preparat dicuci dengan air
2. Sebanyak 1 tetes sampel mengalir
bakteri diteteskan di tepi 3. Preparat digenangi dengan
objek glass menggunakan cat Carbol Fuchsin selama 5
pipet tetes steril menit
3. Objek glass dimiringkan 4. Preparat dicuci dengan air
hingga tetesan tadi mengalir
mengalir ke ujung yang lain 5. Periksa dibawah mikroskop
4. Objek glass dikeringkan di dengan perbesaran 1000X
incubator pada suhu 560C dengan imersi oil
FLAGEL STAIN
Fungsi Mordant mengintensifkan pengecatan
dengan memperbesar bentuk dan diameter flagel
• Uji Katalase
• Uji coagulase
• Uji pyrase
• Uji hippurate hidrolisis
• Uji oksidase
• Uji indole
• Uji DNAse
• Uji ONPG (B-galaktosidase)
ANALISIS KIMIA MELALUI JALUR METABOLISME
• Dasar:
• Koagulase adalah enzim yang mengkonversi soluble fibrinogen ke soluble fibrin
• Dua bentuk koagulase
• Koagulase terikat (factor penggumpalan) terdeteksi pada slide uji
koagulase, dimana secara langsung mengkonveri insoluble fibrin dan
menyebabkan staphylococci menggumpal bersama
• Koagulase Babas terdeteksi pada koagulase tube test, bereaksi dengan
factor globulin plasma membentuk factor thrombin staphylothrombin
katalisasi konversi fibrinogen menjadi insoluble fibrin
• Interpretasi:
• Slide koagulase Test
• Positif gumpalan fibrin putin pada plasma
• Negatif suspense halus
• Tube Koagulase Test
• Positif formasi gumpalan fibrin
• Negatif tidak ada gumpalan yang terbentuk
3. UJI PYRASE (PYR)
• Tujuan:
• Untuk menentukan kemampuan organisme menghidrolisis substrat L-pyrrolidonyl-
beta-napthylamide
• Untu mendiffrensiasi spesies Renterococcus dari spesies nonenterococcus.
• Untuk identifikasi stresptococcus pyogenes
• Dasar:
• Interpretasi
• Positive – pink to cherry red
color
• Negative – no color
4. UJI HIPPURATE HIDROLISIS
• Tujuan:
• Untuk menentukan kemampuan organisme
Interpretasi:
untuk memproduksi hippuricase yang
• Positive – deep purple color
menghidrolisis substrat hippurate
• Negative – slightly yellow pink
• Digunakan untuk identifikasi Streptococcus or colorless
agalactiae, Camphylobacter jejuni and
Listeria monocytogenes
• Dasar:
• Produk akhir hidrolisis substrat hippurate oleh
enzim hippuricase termasuk glisin dan asam
benzoat.
• Glycine dideaminasi oleh agen pengoksidasi,
ninhidrin, yang berkurang selama proses.
• Produk akhir oksidasi ninhidrin bereaksi untuk
membentuk produk berwarna ungu
5. UJI OKSIDASE
• Tujuan:
• Untuk mengskrinning koloni yang diduga Enterobacteriaceae e(all negative).
• Identifikasi koloni yang diduga adalah golongan aromonas, pseudomonas,
meisseria, camphylobacter dan pasteurella
• Dasar:
• Uji oksidase sitokrom menggunakan pewarna
reagen tertentu, seperti p-fenilendiamin
dihidroklorida yang menggantikan oksigen
sebagai akseptor elektron buatan
• Tidak berwarna dalam keadaan tereduksi.
• Keberadaan oksidase sitokrom dan oksigen
atmosfer, p-fenilendiamin teroksidasi
membentuk biru indophenol.
• Interpretasi
• Positive – blue/ dark purple/black
color
• Negative – no color development
6. UJI INDOLE
• Tujuan:
• Membedakan Enterobacteriaceae berdasarkan kemampuan memproduksi indole dari
tryptophan
• Untuk mengidentifikasi mikroba yang memfermentasikan laktosa Enterobacteriaceae,
Escherichia coli(indol positive) from Klebsiella pneumoniae(indol negative)
• Untuk menentukan:
• Proteus mirabilis – indole negative
• Proteus vulgaris – indole positive
• Dasar:
• Bakteri yang memiliki enzim tryptophanase mampu menghidrolisis dan deaminasi triptofan
dengan produksi indole, asam piruvat dan amonia.
• Sebuah kompleks merah terbentuk ketika indole bereaksi dengan kelompok aldehyde dari
p-dimethylaminobenzal dehyde, bahan kimia aktif dalam pereaksi (Reagen) Kovac dan
Ehrlich.
• Interpretasi
• Positive – red ring
• Negative – no color development
• Variable results – orange color
• Rapid spot test
• paradimethylaminocinnamaldehyde –
blue green
• paradimethylaminobenzaldehyde –
bright pink color
7. UJI DEOKSIRIBOSE ATAU UJI DNA HIDROLISIS
• Tujuan:
• Untuk mendeteksi aktivitas DNAse pada spesies bakteri aerobic
• Intuk diffrensiasi non-fermenting bakteri gram negatif seperti Staphylococcus aureus dan
Serratia marcescens
• Dasar:
• Metachromatic dyes
• Komleks Toluidine Blue dengan DNA hidrolisis DNA dengan inokulasi mikroorganisme
menyebabkan perubahan struktur dye (pewarna) menghasilka warna merah muda
• Komleks Methyl green dengan DNA jika organisme ditumbuhkan pada medium hidrolisis
DNA warna hijau akan memudar dan koloni dikelilingi zona yang tidak berwarna
• Interpretasi:
Toluidine blue Methyl green
• Dasar:
• Lactosa Permease aktifasi transfer laktosa ke sel
bakteri
• Beta galaktosidase degradasi laktoso menjadi glukosa
dan galaktosa
• Interpretasi:
• Positif – warna kuning diantara 20 menit sampai 24 jam
• Negatif- no color, tidak ada perubahan warna setelah 24
jam
9. UJI UREASE
• Tujuan:
• Menentukan kemmapuan orgamisme memproduksi enzyme urease yang
dihidrolisis urea
• Identifikasi kecepatan produksi urease (Proteus dan Morganella) dan
lambatnya produksi urease (Klebsiella pneumoniae dan species Enterobacter)
• Dasar:
• Urease akan memisahkan molekul urea menjadi ammonia (NH3), CO2 dan air
(H2O)
• Reaksi ammonia pada larutan akan membentuk senyawa alkaline, ammonium
carbonate yang mengahasilkan peningkatan pH pada media dan mengubah
warna dengan indicator merah muda -merah
• Interpretasi:
• Agar
• Positif urease cepat merah
• Positif urease lambat sedikit merah
• Negatif kuning
• Broth urea
• Positif merah
• Negatif tidak ada perubahan warna atau terlihat seperti
kuning pucat yang samar
METODE IDENTIFIKASI MENGGUNAKAN TEHNIK
BIOMOLEKULAR
TEHNIK MOLEKULAR
https://www.abmgood.com/marketing/knowledge_base/polymerase_chain_reaction_introduct
ion.php
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAYS)
https://www.bosterbio.com/protocol-and-troubleshooting/elisa-principle
ANALISIS MIKROBA SECARA MOLEKULAR
• Diperlukan jika identifikasi bakteri harus dilakukan secara cepat
• Untuk bakteri yang susah teridentifikasi dan memerlukan waktu yang lama
• e.g., Mycobacteria
• Untuk organisme berbahaya
• e.g., Histoplasma, Coccidiodes
• Untuk organisme yang belum ada uji yang reliable (belum dapat diandalkan)
• e.g., HIV, HCV
• High-volume test
• e.g., S. pyogenes, N. gonorrhoeae, C. trachomatis
• Deteksi gen organisme yang resisten
• Genotyping
• Klasifikasi
• Penemuan organisme baru
TUGAS
• Dibagi 3 kelompok:
• Buat makalah mekanisme kerja:
• PCR (poli chain reaction)
• Spektrometrik (MS)
• ELISA
untuk identifikasi mikroba