ESTIMASI

KETIDAKPASTIAN
ANALISA HPLC
PENETAPAN KADAR VITAMIN C PADA SIRUP

L A B M A N I A I N D O N E S I A
 PENETAPAN ESTIMASI KETIDAKPASTIAN PENGUJIAN
KADAR VITAMIN C PADA SIRUP SECARA KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI (HPLC)

Pagi hari yang cerah, saat nya Adit mulai berangkat bekerja. Hari ini adalah hari dimana
dia akan mempelajari penetapan estimasi ketidakpastian metode kromatografi oleh Bu Melin.

“Selamat pagi Bu Melin, hari yang cerah ya bu, tapi besok terakhir disini” ujar Adit sambil
menunjukkan wajah sedihnya.

“Hehe iyah Dit, harus semanga dong, kan nanti besok terakhir diawasin saya” ujar Bu
Melin sambil tertawa.

“Loh siapa yang seneng bu, ada juga saya sedih ga diawasin lagi sama Bu Melin, nanti ga
ada yang ngingetin saya lgai kalo saya salah” ujar Adit.

“Bisa aja kamu, yaudah sekarang kita lanjutkan ke metode selanjutnya ya yaitu pengujian
kadar Vitamin C pada sampel sirup dengan menggunakan HPLC. Kamu biasa menggunakan
HPLC bukan Dit?” tanya Bu Melin.

“Iyah bu, memang kami disini melakukan pengujian kadar Vitamin C menggunakan HPLC
menggunakan metode yang ada pada IK kami” ujar Adit.

“Metode nya sudah divalidasi kan ?” tanya Bu Melin.

“Sudah atuh bu, kalo belum divalidasi, mana berani kita pakai untuk pengujian sampel
customer hehe” ujar Adit.

“Oke deh, karena besok saya terakhir disini, jadi sekarang kamu mulai menjelaskan kepada
saya langkah-langkah dalam penetapan estimasi ketidakpastian pengujian kadar Vitamin C ini ya”
ujar Bu Melin.

“Tapi tetep harus diawasin Bu Melin ya bu ?” ujar Adit sambil menatap serius.

“Iya iya, tetep diawasin saya, kan saya masih disini, kecuali saya sudah ga disini lagi, itu
tandanya saya ga ngawasin kamu hehe” canda Bu Melin.

“Hehe ibu bisa saja, yasudah bu kita mulai saja ya pengujiannya. Saya siapkan bahan dan
alatnya dulu” ujar Adit.

Aditpun mulai menyiapkan bahan dan alat yang dibutuhkan saat pengujian. Mula-mula dia
membuat deret standar, kemudian dia lanjutkan dengan preparasi sampel sebanyak 6 kali ulangan.
Lalu dia injeksikan kedalam HPLC yang sudah dia optimasi. Setelah 1 jam melakukan pengujian
dari mulai preparasi sampai mendapatkan hasil, Aditpun menghampiri Bu Melin dan memberikan
data hasil percobaannya.

“Ini bu saya sudah dapatkan data hasil pengujiannya” ujar Adit sambil menyerahkan hasil
pengujiannya kepada Bu Melin.

Pembacaan Deret Standar :

Konsentrasi
Luas Area
(mg/L)
0 0,0000
2 700825
4 1299768
6 1999543
8 2550618
10 3288883

Pembacaan Pengujian Sampel :

Ulangan Luas Area

1 1345671
2 1343782
3 1342683
4 1343841
5 1345691
6 1342523

“Nah, sekarang coba kamu jelaskan kepada saya langkah-langkah penetapan estimasi
ketidakpastiannya ya Dit” ujar Bu Melin.

“Oke bu, berarti sesuai penjelasan ibu diawal pertemuan, langkah pertama yang harus
dilakukan adalah menentukan spesifikasi dengan menggunakan rumus atau formula, ya intinya
cari rumus penentuan kadar Vitamin C menggunakan HPLC” ujar Adit sambil menuliskan rumus
mencari kadar Asesulfam.
𝑚𝑔
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝐴𝑠𝑒𝑠𝑢𝑙𝑓𝑎𝑚 ( ) = 𝐶 × 𝐹𝑝
𝐿
Dimana :

C : KonsentrasiVitamin C (mg/L)
Fp : Faktor pengenceran yang digunakan dalam pengujian

“Nah setelah menuliskan rumus dari pengujian kita, kita lanjutkan ke langkah yang ke-2,
yaitu mengidentifikasi sumber ketidakpastian pengujian kadar Vitamin C dengan menggunakan
diagram fish bone” jelas Adit yang disambung dengan anggukkan Bu Melin.

Aditpun mulai menggambarkan diagram fishbone dari pengujian yang dia lakukan dan
didapatkan diagram fish bone sebagai berikut :

u regresi u presisi metode

Kadar Vitamin C
(mg/L)

u faktor pengenceran

“Langkah selanjutnya setelah mengidentifikasi sumber ketidakpastian adalah menghitung

masing-masing dari sumber ketidakpastian yang sudah diidentifikasi” ujar Adit.

a. Ketidakpastian Asal Kurva Kalibrasi

“Pertama saya akan menghitung terlebih dahulu ketidakpastian asal kurva kalibrasi.
Kenapa saya menghitung ? karena deret standar yang saya buat akan membentuk
sebuah kurva kalibrasi dimana didalamnya terdapat sebuah ketidakpastian yang harus
dihitung” ujar Adit.
“Waduh gakuat bahasamu Dit hahaha” tawa Bu Melin membuat Aditpun ikut
tertawa.
“Hehe kan saya terlalu mendalami karakter ibu” jawab Adit.
“Haha lanjutkan Dit” ujar Bu Melin sambil tertawa.
“Nah dalam menghitung ketidakpastian asal kurva kalibrasi digunakan rumus
sebagai berikut” ujar Adit sambil menulis rumus menghitung ketidakpastian asal kurva
kalibrasi.

𝑅𝑆𝐷 1 (𝑌𝑜 − 𝑌𝑟)2

𝑢 𝑟𝑒𝑔 = √1 + + 2
𝑏 𝑛 𝑏 ∑(𝑋𝑖 − 𝑋𝑟)2

Dan :

∑(𝑌𝑖 − 𝑌𝑐)2
𝑅𝑆𝐷 = √
(𝑛 − 2)
Dimana :
Keterangan :
Xi = Konsentrasi deret standar ke-I
Yi = Absorbansi standar ke – i (hasil pengamatan/pengukuran)
Yc = Absorbansi hasil perhitungan berdasarkan persamaan kurva kalibrasi yang
diperoleh
Xr = Rata-rata konsentrasi deret standar yang dibuat
Yr = Rata-rata dari absorbansi hasil pengukuran deret standar
Yo = Absorbansi rata-rata hasil pengukuran larutan sampel

“Nah dari rumus tersebut kita buatkan tabel untuk mengihitung ketidakpastian asal
kurva kalibrasi sesuai rumus yang ada” ujar Adit sambil membuat tabel di Microsoft
Excel yang dia miliki.

(Xi-
xi Yi yc yi-yc (yi-yc)2 xi-xr
Xr)2
0 0,0 18970 -18970 359860900 -5,0 25,0
2 700825,0 667358 33467 1120040089 -3,0 9,0
4 1299768,0 1315746 -15978 255296484 -1,0 1,0
6 1999543,0 1964134 35409 1253797281 1,0 1,0
8 2550618,0 2612522 -61904 3832105216 3,0 9,0
10 3288883,0 3260910 27973 782488729 5,0 25,0
∑(Yi-Yc)2 7603588699 ∑(Xi-Xr)2 70,0

Sehingga :

7603588699
𝑅𝑆𝐷 = √
4
𝑅𝑆𝐷 = 43599,28

Diketahui rerata absorbansi sampel 6 kali ulangan (Yr) adalah 1344031,83

Sehingga :

𝑅𝑆𝐷 1 (𝑌𝑜 − 𝑌𝑟)2

𝑢 𝑟𝑒𝑔 = √1 + + 2
𝑏 𝑛 𝑏 ∑(𝑋𝑖 − 𝑋𝑟)2

43599,28 1 87561347192,112
𝑢 𝑟𝑒𝑔 = √1 + +
324193,84 6 324193,842 × 70

𝑢 𝑟𝑒𝑔 = 0,1460 𝑚𝑔/𝐿

 “Sudah deh ketidakpastian asal kurva kalibrasi yang didapatkan adalah 0,1490
mg/L. Sekarang kita lanjutkan menghitung sumber ketidakpastian yang lainnya” ujar
Adit.

“Mantap” ujar Bu Melin.

b. Ketidakpastian Asal Faktor Pengenceran

“Nah saat pengujian, saya melakukan pengenceran 20 kali dengan menggunakan
labu takar 100 mL dan pipet volume 5 mL. Sehingga dalam menghitung ketidakpastian
asal faktor pengenceran, kita harus menghitung ketidakpastian asal pipet volume 5 mL
dan labu takar 100 mL, betulkan bu ?” jelas Adit.
“Ya betul sekali, lanjutkan Dit” ujar Bu Melin.
“Oke bu, sekarang coba saya hitung berdasarkan rumus perhitungan ketidakpastian
asal faktor pengenceran” ujar Adit.

Rumus ketidakpastian asal faktor pengenceran :

𝑢 𝐿𝑎𝑏𝑢 𝑇𝑎𝑘𝑎𝑟 2 𝑢 𝑃𝑖𝑝𝑒𝑡 2

𝑢𝐹𝑃 = 𝑓𝑝 × √( ) +( )
𝑉. 𝐿𝑎𝑏𝑢 𝑉. 𝑃𝑖𝑝𝑒𝑡

Rumus Ketidakpastian asal alat gelas :

𝑢 𝐴𝑙𝑎𝑡 𝑔𝑒𝑙𝑎𝑠 = √𝑢𝐾𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑠𝑖 2 + 𝑢𝐸𝑓𝑒𝑘 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟 2

Dimana :

𝑘𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑙𝑎𝑏𝑢 𝑡𝑎𝑘𝑎𝑟 𝑑𝑎𝑟𝑖 𝑠𝑝𝑒𝑘 𝑝𝑎𝑏𝑟𝑖𝑘

µ𝑘𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑠𝑖 =
√3

𝑘𝑜𝑒𝑓. 𝑚𝑢𝑎𝑖 𝑎𝑖𝑟 × 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑙𝑎𝑏𝑢 𝑡𝑎𝑘𝑎𝑟 × 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑢ℎ𝑢

µ𝐸𝑓𝑒𝑘 𝑇 =
√3

Ketidakpastian Asal Labu Takar 100 mL

Diketahui :

Spek pabrik Labu Takar 100 mL = 100 ± 0,05 mL

Suhu saat pengujian = 25°C

Sehingga :

0,05
𝑢𝐾𝑎𝑙 = = 0,0289 𝑚𝐿
√3
Dan :

𝑉 × ∆𝑇 × 𝐾𝑜𝑒𝑓. 𝑀𝑢𝑎𝑖 𝐴𝑖𝑟

𝑢𝐸𝑓𝑒𝑘 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟 =
√3

100 𝑚𝐿 × 5°𝐶 × 0,00021°𝐶 −1

𝑢 𝑒𝑓𝑒𝑘 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟 =
√3

𝑢 𝐸𝑓𝑒𝑘𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟 = 0,0606 𝑚𝐿

Jadi :

𝑢 𝐿𝑎𝑏𝑢 𝑇𝑎𝑘𝑎𝑟 = √𝑢𝐾𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑠𝑖 2 + 𝑢𝐸𝑓𝑒𝑘 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟 2

𝑢 𝐿𝑎𝑏𝑢 𝑇𝑎𝑘𝑎𝑟 = √0,0289 2 + 0,06062

𝑢 𝐿𝑎𝑏𝑢 𝑇𝑎𝑘𝑎𝑟 = 0,0671 𝑚𝐿

Ketidakpastian Asal Pipet Volume 5 mL

Diketahui :

Spek pabrik Pipet Volume 5 mL = 5 ± 0,01 mL

Suhu saat pengujian = 25°C

Sehingga :

0,01
𝑢𝐾𝑎𝑙 = = 0,0058 𝑚𝐿
√3
Dan :
 𝑉 × ∆𝑇 × 𝐾𝑜𝑒𝑓. 𝑀𝑢𝑎𝑖 𝐴𝑖𝑟
𝑢𝐸𝑓𝑒𝑘 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟 =
√3

5 𝑚𝐿 × 5°𝐶 × 0,00021°𝐶 −1
𝑢 𝑒𝑓𝑒𝑘 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟 =
√3

𝑢 𝐸𝑓𝑒𝑘𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟 = 0,0030 𝑚𝐿

Jadi :

𝑢 𝑃𝑖𝑝𝑒𝑡 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = √𝑢𝐾𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑠𝑖 2 + 𝑢𝐸𝑓𝑒𝑘 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟 2

𝑢 𝑃𝑖𝑝𝑒𝑡 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = √0,0058 2 + 0,00302

𝑢 𝑃𝑖𝑝𝑒𝑡 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 0,0065 𝑚𝐿

“Sekarang tinggal menghitung ketidakpastian asal faktor pengencerannya deh”
ujar Adit sambil melanjutkan pekerjaan menghitungnya.
Aditpun menghitung ketidakpastian asal faktor pengenceran sebagai berikut :

𝑢𝐿𝑎𝑏𝑢 𝑇𝑎𝑘𝑎𝑟 2 𝑢 𝑃𝑖𝑝𝑒𝑡 2

𝑢𝐹𝑃 = 𝑓𝑝 × √( ) +( )
𝑉. 𝐿𝑎𝑏𝑢 𝑉. 𝑃𝑖𝑝𝑒𝑡

0,0349 𝑚𝐿 2 0,0119 𝑚𝐿 2
𝑢𝐹𝑃 = 10 × √( ) +( )
50 𝑚𝐿 5 𝑚𝐿

𝑢𝐹𝑃 = 0,0249

“Jadi ketemu deh ketidakpastian asal faktor pengencerannya adalah 0,0249,

sekarang kita lanjut menghitung ketidakpastian asal presisi metode” ujar Adit.

c. Ketidakpastian Asal Presisi Metode

“Nah sekarang tinggal ketidakpastian asal presisi metode. Ketidakpastian asal
presisi metode ini dapat di hitung menggunakan evaluasi ketidakpastian tipe A.
Sehingga ketidakpastian asal presisi metode sama dengan nilai standar deviasinya,
betulkan bu ?” ujar Adit.
“Iya betul pak guru hehe” jawab Bu Melin.
“Sekarang saya akan hitung nilai standar deviasinya menggunakan Microsoft
Excel” ujar Adit sambil membuka Microsoft Excelnya. Dan didapatkan hasil sebagai
berikut :
 Kadar Vitamin C
Ulangan Luas Area dalam sampel
(mg/L)
1 1345671 81,8461
2 1343782 81,7296
3 1342683 81,6618
4 1343841 81,7332
5 1345691 81,8474
6 1342523 81,6519
Rerata 1344031,833 81,7450
SD 0,0856
%RSD 0,10

“Dan akhirnya ketidakpastian asal presisi metode adalah nilai standar deviasinya
yakni 0,0856 mg/L, selesai deh, sekarang langsung lanjutin ke langkah paling akhir
yaitu menghitung ketidakastian gabungan dan ketidakpastian diperluas” ujar Adit
disambung dengan anggukkan bu Melin.

d. Ketidakpastian gabungan dan ketidakpastian diperluas

“Nah sekarang kita masuk ke langkah terakhir yaitu menghitung ketidakpastian
gabungan. Karena menggunakan satuan yang berbeda maka digunakan rumus
pembagian dengan nilai masing-masing sumber ketidakpastiannya” jelas Adit.
“Sekarang kita tinggal hitung ketidakpastian gabungannya dengan menggunakan
tabel didalam Microsoft Excel yang sudah saya siapkan” tambah Adit.
“Mantap euy, lanjutkan Dit hehe” tambah Bu Melin sambil tertawa.
Aditpun mulai menghitung ketidakpastian gabungan dan ketidakpastian diperluas
dengan menggunakan Microsoft Excel yang sudah dia siapkan. Dan didapatkan hasil
perhitungan Adit adalah sebagai berikut :

Sumber Nilai
Simbol Satuan µ µ/x (µ/x)²
Ketidakpastian (x)
Kurva kalibrasi µreg 8,1745 mg/L 0,1445 0,017682843 0,00031268
Presisi Metode µPM 81,7450 mg/L 0,0856 0,001047593 0,00000110
Faktor
Pengenceran µFp 20 0,0187 0,000935971 0,00000088
Kadar Vitamin
C dalam sampel µCSx 81,7450 mg/L 0 0
Jumlah 0,0003

Sehingga :
 𝑢 𝐺𝑎𝑏𝑢𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑢 𝑟𝑒𝑔 2 𝑢 𝑃𝑟𝑒𝑠𝑖𝑠𝑖 2 𝑢𝐹𝑝 2
= √( ) +( ) +( )
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝐴𝑠𝑒𝑠𝑢𝑙𝑓𝑎𝑚 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝐶𝑂𝐷 𝐹𝑝

𝑢 𝐺𝑎𝑏𝑢𝑛𝑔𝑎𝑛
𝑚𝑔 = √0,0003
81,7450
𝐿

𝑚𝑔
𝑢 𝐺𝑎𝑏𝑢𝑛𝑔𝑎𝑛 = 81,7450 × 0,01774
𝐿

𝑚𝑔
𝑢 𝐺𝑎𝑏𝑢𝑛𝑔𝑎𝑛 = 1,45
𝐿

Sedangkan untuk ketidakpastian diperluas dihitung berdasarkan selang kepercayaan

95% sehingga faktor cakupan k=2 :

𝑚𝑔
𝑈 = 1,45 ×2
𝐿

𝑈 = 2,9001 𝑚𝑔/𝐿

“Jadi pelaporan hasil pengujian kadar Vitamin C menggunakan HPLC adalah

(81,7450 ± 3) mg/L kan bu ? karena pelaporan hanya melibatkan satu angka penting”
ujar Adit.
“Hebat kamu Dit, saya salut, besok kan pertemuan terakhir kita jadi kamu jelaskan
juga kepada saya kaya gini, anggaplah sebagai ujian lisan dari saya hehe” ujar Bu Melin
mengapresiasi Adit yang sudah mampu menetapkan estimasi ketidakpastian sendiri.