REVIEW JURNAL: CRISPR-Cas system for genome editing, regulation

and targeting

Pendahuluan
Langkah penting pertama untuk menunjukkan target pengeditan genom adalah
penciptaan DNA double stranded istirahat (DSB) pada lokus genomik untuk dimodifikasi.
Ketika target induksi DSBs nuklease digunakan, frekuensi perubahan ini biasanya lebih
tinggi dari 1% dan dalam beberapa kasus dapat mencapai 50% atau lebih tinggi; modifikasi
pada tingkat ini memungkinkan identifikasi dari mutasi yang diinginkan dengan skrining
sederhana, tanpa perlu pemilihan penanda resistensi obat.
Metode awal untuk menargetkan induksi DSB nucleases ke situs genom tertentu
bergantung pada sistem berbasis protein dengan kekhususan pengikatan DNA yang
disesuaikan seperti meganucleases, nucleases zinc finger (ZFNs) dan aktivator transkripsi
seperti nucleases efektor (Talens).
Hal yang akan dibahas dalam review jurnal ini adalah bagaimana sistem RNA yang
terpandu ini bekerja dan bagaimana hal tersebut telah diterapkan untuk melakukan editing
genom di berbagai macam jenis sel dan organisme secara keseluruhan, kelebihan dan
keterbatasan dari sistem ini, termasuk penilaian efek target dan strategi baru untuk
meningkatkan spesifisitas, dan bagaimana hal itu dapat bertujuan kembali untuk aplikasi lain
seperti regulasi ekspresi gen serta pelabelan selektif genom yang akhirnya
mempertimbangkan tantangan berikutnya yang perlu diatasi untuk ini platform pengeditan
genom yang muncul.

Dari sistem kekebalan CRISPR-Cas bakteri hingga rekayasa RNA-guided nucleases

Sistem CRISPR adalah mekanisme kekebalan yang mudah disesuaikan yang
digunakan oleh banyak bakteri untuk melindungi diri dari asam nukleat asing, seperti virus
atau plasmid. Sistem CRISPR tipe II menggabungkan sekuens dari DNA yang menyerang
antara urutan ulang CRISPR yang dikodekan sebagai susunan dalam genom inang.
Pengulangan CRISPR setiap crRNA hibridisasi dengan RNA CRISPR kedua yang
mentransaktivasi (tracrRNA) dan kedua kompleks RNA ini dengan nomenlease Cas9. Bagian
protospacer yang dikodekan dari crRNA mengarahkan Cas9 untuk membentuk urutan DNA
target komplementer, jika keduanya bersebelahan dengan sekuens pendek yang dikenal
sebagai "motif protospacer yang berdekatan" (PAMs). Urutan Protospacer dimasukkan ke
lokus CRISPR tidak dibelah karena tidak hadir di samping urutan PAM. Sistem CRISPR tipe
II dari Streptococcus pyogenes telah disesuaikan untuk menginduksi urutan spesifik DSB dan
penyuntingan genom yang ditargetkan. Dalam bentuknya yang paling sederhana dan paling
banyak digunakan, dua komponen harus diperkenalkan dan/atau diekspresikan dalam sel atau
organisme untuk melakukan pengeditan genom.
Kemudian aktivitas nuklease Cas9 dapat diarahkan ke urutan DNA apapun dari
bentuk N20-NGG hanya dengan mengubah 20 nts pertama dari gRNA agar sesuai dengan
urutan DNA target. Sistem CRISPR Tipe II dari spesies bakteri lain yang mengenali urutan
PAM alternatif dan yang menggunakan rangkaian crRNA dan tracrRNA berbeda juga telah
digunakan untuk melakukan pengarsipan genom target10-12. Namun, karena sistem yang
paling umum digunakan dan dianalisis secara luas sampai saat ini didasarkan pada sistem S.
pyogenes, sisa tinjauan ini berfokus pada platform khusus ini dan komponennya kecuali jika
dinyatakan lain.
Disebutkan bahwa Cas9 tidak hanya dapat memotong berbagai situs DNA secara in
vitro, Cas9 juga dapat ditargetkan pada gen endogen pada bakteri, jalur sel kanker manusia
yang ditransformasikan manusia, sel induk pluripoten manusia dan juga di seluruh organisme
seperti ikan zebra. Selanjutnya, Cas9 telah digunakan untuk mengubah gen dalam ragi,
tembakau, padi, gandum, sorghum, tikus, kelinci, katak, lalat buah, ulat sutra, dan cacing
gelang. DSBs yang diinduksi IF9 telah digunakan untuk mengenalkan mutasi indel yang
dimediasi NHEJ dan juga untuk merangsang HDR dengan DNA plasmid untai ganda dan
template donor oligonukleotida beruntai tunggal. Kemampuan untuk mengenalkan DSBs di
beberapa situs secara paralel dengan menggunakan sistem Cas9 adalah keuntungan unik dari
platform ini yang berkaitan dengan meganuklease, ZFN, atau TALEN.
Kesederhanaan penargetan Cas9 juga mengilhami generasi perpustakaan gRNA
menggunakan sintesis oligonukleotida berbasis array. Perpustakaan ini dapat direkayasa
untuk mencakup beberapa gRNA untuk setiap gen target dalam organisme inang, sehingga
sangat memudahkan layar dan pilihan genetik ke depan. Berbeda dengan perpustakaan RNA
hairpin pendek, yang hanya memediasi gen knockdown, perpustakaan gRNA ini telah
digunakan dengan Cas9 nuclease untuk menghasilkan mutasi KO. Perpustakaan terdiri dari
antara ~ 64.000 dan ~ 87.000 gRNA yang berbeda telah digunakan untuk menunjukkan
kapasitas layar fenotipe genetik negatif positif dan negatif pada sel manusia dan tikus38-40.
Casing varian Cas9 yang memotong satu untai, bukan untaian kedua, dari lokasi DNA
target juga terbukti bermanfaat untuk pengarsipan genom. Pengenalan mutasi D10A atau
H840A ke dalam domain nuklein RuvC1 atau HNH yang ada di Cas9 (Gambar 3a) 41, 42
menghasilkan pembangkitan nickases yang memotong untaian target DNA komplementer
atau non-pelengkap, masing-masing, pada Vitro7, 12, 43 (Gambar 3b dan 3c). Konsisten
dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan dengan nickase ZFN yang diturunkan44-46,
Cas9 nickases dapat, di beberapa tempat, menginduksi HDR dengan tingkat penurunan
induktor NHEJ yang dimediasi bersamaan13, 14. Namun, walaupun di beberapa situs, Cas9
nickase dapat menyebabkan HDR dengan efisiensi yang serupa dengan Apa yang diamati
dengan nukleida Cas9 dari mana diturunkan, 14, tingkat ini juga dapat dikurangi secara
signifikan di tempat lain47, 48. Yang penting, frekuensi mutasi indel yang diperkenalkan
dengan noice juga dilaporkan tinggi di lokasi tertentu13, 47 -49. Meskipun jalur perbaikan
DNA yang tepat dimana berbagai perubahan ini diinduksi tetap belum terdefinisi, satu
mekanisme potensial yang telah dipostulasikan adalah bahwa perjalanan sebuah garpu
replikasi melalui nikel yang diinduksi nuklease bisa menghasilkan DNA DSB. Studi
tambahan dengan Cas9 nickases akan diperlukan untuk lebih memahami perbedaan yang
bergantung pada lokus dalam efisiensi induksi mutasi HDR dan indel.

Menentukan spesifisitas dari nuclease Cas9 yang dipandu RNA

Untuk menilai spesifisitas RGN, beberapa kelompok telah menciptakan varian gRNA
yang mengandung 1-4 nukleotida mismatch di wilayah komplementaritas dan kemudian
memeriksa kemampuan molekul ini untuk mengarahkan aktivitas nuklease Cas9 pada sel
manusia pada gen reporter atau gen endogen, lokasi target. Yang lebih relevan untuk
mempelajari spesifisitas adalah menilai aktivitas Cas9 di lokasi target DNA genom target
potensial, (yaitu situs yang memiliki beberapa perbedaan nukleotida dibandingkan dengan
target yang dimaksud). Sejumlah penelitian telah meneliti beberapa situs target potensial
yang berbeda pada 1 sampai 6 posisi dari situs sasaran pada sel manusia. Secara keseluruhan,
laporan ini menemukan kasus mutasi off-target di lokasi yang berbeda dengan sebanyak 5
posisi di dalam wilayah protospacer dan / atau yang memiliki urutan PAM alternatif berupa
NAG51. Selain itu, tes sekuensing yang lebih sensitif telah digunakan untuk mengidentifikasi
frekuensi rendah mutasi off-target. Meskipun telah disarankan bahwa kandungan GC yang
lebih tinggi pada RNA: Antarmuka hibridisasi DNA mungkin berpotensi membantu
menstabilkan kompleks Cas9: gRNA, tingkat mutagenesis yang tinggi telah diamati untuk
lokasi yang tidak sesuai dengan perkiraan 30% konten GC.
Strategi yang agak lebih komprehensif untuk memeriksa spesifisitas Cas9 adalah
untuk mengidentifikasi situs-situs yang tidak memenuhi sasaran dari variasi varian yang
sebagian didasarkan pada urutan target yang diinginkan. Studi ini menemukan lokasi yang
tidak sesuai dengan posisi 3 (dan mungkin lebih) relatif terhadap lokasi sasaran. Hasil ini
serupa dengan penelitian lain, yang menggunakan seleksi vitro untuk aktivitas pembelahan
nuklease Cas9 untuk mengidentifikasi lokasi potensial dari luar dari perpustakaan varian
target yang sebagian merosot. Beberapa lokasi di luar sasaran yang diidentifikasi oleh pilihan
in vitro ini (dengan sampai 4 ketidakcocokan) juga terbukti bermutasi pada sel manusia.
Sebuah studi baru-baru ini yang menggunakan keseluruhan sekuensing exome tidak
menemukan bukti mutasi off-target Cas9 di tiga klon lini manusia K562 yang dimodifikasi.
Meskipun penulis mengetahui bahwa tingkat hasil negatif yang tinggi terkait dengan analisis
sekuensing eksepsi membatasi interpretasi data ini, namun hasil ini menunjukkan bahwa
dengan pemilihan target yang cermat, dimungkinkan untuk mengisolasi sel yang disuntikkan
Cas9 dengan eksom utuh. Contoh tambahan dengan cakupan sekuensing yang lebih dalam
dan keseluruhan genom (bukan keseluruhan exome) diperlukan untuk menentukan seberapa
mudah sel yang tidak memiliki mutasi di luar target dapat diisolasi. Kemampuan untuk
melakukannya akan mendorong penerapan teknologi Cas9 secara lebih luas. Namun, perlu
dicatat bahwa sekuensing dalam genom klon sel individual bukanlah pendekatan sensitif dan
tidak efektif untuk menentukan spektrum genomelida lengkap dari situs Cas9 di luar target.
Secara keseluruhan, berbagai penelitian yang dipublikasikan sampai saat ini sangat
mengesankan bahwa situs-situs yang tidak memenuhi target dari nuklease Cas9 yang dipandu
RNA dapat bervariasi dalam frekuensi dan menantang untuk diprediksi. Untuk situs target
tertentu, saat ini tidak mungkin untuk memperkirakan berapa banyak ketidakcocokan yang
dapat ditolerir, juga tidak sepenuhnya memahami mengapa beberapa situs dibelah sedangkan
yang lain tidak. Kita juga tidak tahu bagaimana konteks genomik dan / atau epigenomik dapat
mempengaruhi frekuensi pembelahan. Meskipun beberapa bukti awal menunjukkan bahwa
metilasi DNA mungkin tidak menghambat pengarsipan genom berbasis Cas9, tampaknya
masuk akal dan mungkin bahwa struktur kromatin dapat berperan dalam aksesibilitas di luar
lokasi. Pemahaman yang lebih komprehensif tentang efek off-target Cas9 harus menunggu
pengembangan ukuran global spesifisitas Cas9 dalam sel.

Metode Untuk Mengurangi Efek Off-Target Dari Nuklease Cas9

Salah satu strategi potensial adalah menguji efek reduksi konsentrasi gRNA dan /
atau Cas9 yang diekspresikan dalam sel manusia. Hasil dengan pendekatan ini telah dicampur
dengan satu kelompok yang mengamati penurunan yang lebih besar secara proporsional
dalam tingkat mutagenesis di luar target dibandingkan dengan mutagenesis ontarget untuk
dua gRNA dan kelompok lain yang mengamati penurunan proporsional hampir dua gRNA
lainnya.
Pendekatan lain yang diusulkan untuk meningkatkan spesifisitas melibatkan
penggunaan "potongan terpasangan" di mana potonganseimbang yang berdekatan dihasilkan
di lokasi target menggunakan dua gRNA dan Cas9 nickase (Gambar 3d). Cas9 nickase yang
ditargetkan ke situs pada untai DNA yang berlawanan yang dipisahkan oleh empat sampai
100 pb dapat secara efisien menginduksi mutasi indel atau peristiwa HDR dengan template
donor oligonukleotida DNA untai tunggal pada sel manusia dan tikus.Pasangannikase dapat
mengurangi efek offtarget Cas9 akibat gRNA pada sel manusia. Penambahan gRNA kedua
dan substitusi Cas9 nickase untuk Cas9 nuklease dapat menyebabkan penurunan tingkat
mutasi yang tidak diinginkan pada off-target yang
diketahuisebelumnyadarigRNAaslipertama. Namun, pertanyaan yang belum terjawab adalah
apakah gRNA kedua dapat dengan sendirinya menginduksi berbagai mutasi offtarget Cas9 di
genom.Salah satu cara penting untuk memperbaiki sistempasangan nickase mungkin adalah
dengan memodifikasinya sehingga aktivitas dua gRNA sangat bergantung satu sama lain
untuk aktivitas pengeditan genom, sehingga setiap gRNA hanya aktif untuk genom editing
saat terikat pada DNA di dekat yang lain.
Efek off-target dapat dikurangi secara substansial dengan menggunakan gRNA yang
telah dipersingkat pada ujung 5 'daerah komplementer mereka. GRNA terpotong (tru-gRNA)
yang memiliki 17 atau 18 nukleotida komplementaritas pada umumnya berfungsi seefisien
gRNApanjang normal dalam mengarahkan aktivitas Cas9 pada target tetapi menunjukkan
penurunan efek mutagenik pada lokasi yang tidak diobservasi dan sensitivitas yang
ditingkatkan terhadap ketidakcocokan tunggal atau ganda pada gRNA / DNAinterfase. Tru-
gRNA dapat digunakan bersamaan dengan strategi lain untuk meningkatkan spesifitas Cas9
(misalnya tru-gRNA telah ditunjukkan untuk memperbaiki spesifisitas pasangan nickase) dan
untuk memperbaiki spesifisitas protein fusi dCas9 untuk aplikasi non-nuklease. (Dijelaskan
di bawah).

Pertimbangan praktis untuk menerapkan teknologi CRISPR-Cas

Akibat kemajuan pesat teknologi didunia, pengguna teknologi CRISPR-Cas
menghadapi berbagai pilihan tentang bagaimana mempraktekkannya. Disini kita membahas
beberapa parameter yang perlu dipertimbangkan saat menerapkan metodologiCRISPR-Cas.

Pilihan Platform RNA Primer

 Penting untuk dicatat bahwa efisiensi aktivitas Cas9 untuk lokus tertentu dapat
dipengaruhi oleh susunan RNA primer yang digunakan. Seperti yang dijelaskan di atas,
penelitian terbaru telah menggunakan satu gRNA tunggal yang merupakan perpaduan dari
crRNA terprogram dan bagian dari tracrRNA, namun penelitian sebelumnya juga
menggunakan konfigurasi 'dual gRNA' di mana crRNA dan tracrRNA diekspresikan secara
terpisah. Secara umum, penelitian yang menggunakan single gRNA secara pasti dilaporkan
memiliki potensi untuk diedit lebih tinggi daripada menggunakan dual gRNAs13, 14, 17, 61.
Temuan ini menunjukkan bahwa sistem gRNA tunggal mungkin lebih aktif daripada sistem
gRNA ganda, mungkin karena dua komponen dapat merakit Lebih efisien dari tiga
komponen.
Sebagai tambahan, single gRNA yang memiliki panjang variabel urutan tracrRNA
pada ujung 3' telah digunakan dalam kelompok yang berbeda. Perbandingan sistematis
umumnya menunjukkan bahwa gRNA tunggal yang lebih panjang (mengandung bagian 3
dari urutan tracrRNA yang lebih lama) lebih aktif daripada yang lebih pendek 51. gRNA
tunggal yang paling umum digunakan sampai saat ini panjangnya sekitar 100 nts dan secara
pasti menjukkan bahwa Cas9 dapat mengarah ke situs genom ragi, tembakau, beras, gandum,
sorghum, mencit, Tikus, kelinci, katak, lalat buah, cacing gelang, ulat sutra dan sel induk
somatik dan pluripoten. Tru-gRNA yang dijelaskan di atas adalah versi yang dipersingkat
dari gRNA tunggal ~ 100 nt.

Penargetan range dan pemilihan sisi target gRNA

Pemilihan promotor digunakan untuk mengekspresikan gRNAs agar dapat membatasi
sisi potensial DNA target. Misal RNA polimerase III dipengaruhi oleh promotor U6 atau
promotor T7 yang memerlukan G atau GG pada 5’ urutan akhir RNA yang akan
ditranskripsikan (gambar a & b). Hasilnya, gRNAs yang ditunjukkan dari promotor terbatas
menargetkan sisi yang sesuai dengan bentuk GN, NGG atau GGN, NGG; sisi tersebut
diharapkan berlangsung sekali dalam 32 pb atau sekali dalam 128 pb pada urutan DNA acak.
Dalam memasangkan pasang basa memerlukan strategi yang menunjukkan dari dua sisi untai
DNA yang bearlawanan dengan rentang jaraknya. Salah satu cara untuk mengurangi
pembatasan range target adalah dengan memilih sisi tanpa memperhatikan identitas pertama
atau dua basis pertama pada akhir 5’ (yaitu membuat gRNAs menjadi tidak cocok pada posisi
tersebut). Strategi lain yang potensial untuk memotong pembatasan ini adalah dengan
menambahkan G atau GG yang diperlukan pada 5 ' akhir gRNA, sehingga pengkodean
gRNA transkrip dengan 1 atau 2 pb lebih panjang (gambar 5a, b). Kedua strategi ini telah
berhasil digunakan untuk menghasilkan gRNAs aktif tetapi dengan efisiensi variabel dalam
perbaikan aktivitas genom dengan nuklease Cas9. gRNAs diperpanjang pada efisiensi dan
spesifitas dari pembelahan mediasi-RGN.

Pengiriman Komponen CRISPR-Cas

RGNs
telahdikirimkeberbagaijenisseldanorganismemenggunakanberbagaimetodepenyampaian.Dala
mkulturselmamalia, penelititelahmenggunakan electroporation, Nucleofectiondan
transfection non-replikasi DNA plasmid ke transiently mengungkapkan Cas9
dangRNAsLipofectamine-dimediasi.
Vektorlentiviraljugatelahdigunakanuntukkonstitutifekspres Cas9 dan /
ataugRNAsdikulturpadaselmanusiadan mouse. In vitro ditranskrip RNA dan / atau DNA
plasmid telahdisuntikkanlangsungkedalamembrio; misalnya, dalamembriodarizebrafis,
fliesfruit, micedan rats. Kedua plasmid DNA dan RNA jugatelahdisuntikkankedalam gonad
dari roundworms dewasa, dandalamsatustudi yang dimurnikan protein Cas9
kompleksdengangRNAadalah injected. Selain model hewandanbarissel, Cas9
telahberhasildigunakan di spesiestanamanbeberapatermasukgandum, beras, sorgum,
tembakau,
danseladathalemenggunakanberbagaimetodepenyampaianstandartermasuktransformasi PEG-
dimediasiprotoplas, transfer Agrobacterium-dimediasiembriodanjaringandaun, dan /
ataupembomanselkalusdengan plasmid DNA. untuksebagianbesaraplikasi RGN,
ekspresitransiengRNAsdan Cas9 biasanyacukupuntukmenginduksigenom editing efisien.

Strategi Melakukan Eksperimen Pengendalian Efek Target dari RGN

Adanya CRISPR RGN menimbulkan efek dari target dan ketidakmampuan untuk
mengidentifikasi semua perubahan pada skala genom secara luas. Beberapa strategi mungkin
digunakan untuk menyingkirkan mutasi dari target. Penjelasan alternatif untuk setiap fenotip
yang diamati misalnya; komplementasi dengan pengenalan kembali tipe gen wild yang dapat
digunakan untuk mengkonfirmasi efek KO. Selain itu, mutasi mirip dengan strategi
penargetan gen dengan multiple RNAi. Situs yang berbeda pada masing-masing gRNA
diharapkan memiliki berbagai efek target yang berbeda, jika fenotip diamati dengan masing-
masing gRNA berbeda ini. GRNA dapat dirancang dan dibangun dengan cepat,
pembuatannya sederhana dan layak untuk diterapkan. Tipe strategi terakhir dengan sistem
Cas9. Khasiat tinggi dari nomenlease Cas9 untuk menginduksi mutasi menjadikannya
pilihan yang menarik untuk menciptakan garis sel masif dan utuh meskipun perlu
memperhitungkan efek di luar target.

APLIKASI NON-NUCLEASE SISTEM CRISPR-CAS

Sistem CRISPR-Cas digunakan untuk mengatur ekspresi gen endogen atau memberi
label lokus kromosom spesifik pada sel hidup atau organisme. Cas9 (dCas9) yang tidak aktif
secara katalitik atau "mati", varian yang membawa mutasi D10A dan H840A yang tidak
membelah DNA, dapat direkrut oleh gRNA ke lokasi DNA target tertentu. Dcas9 menekan
promotor bakteri secara efisien dengan gRNA yang berinteraksi dengan sekumpulan urutan
yang berada di hulu promotor. Namun, hanya gRNA yang berinteraksi dengan untai non-
template yang menginduksi represi yang dimediasi dCas9. Perubahan ekspresi gen yang
disebabkan oleh fusi dCas9 pada sel manusia sejauh ini lebih rendah daripada yang
disebabkan oleh faktor transkripsi berbasis TALE yang serupa. Kemampuan aktivator
berbasis dCas9 berfungsi secara sinergis konsisten dengan observasi sebelumnya untuk
aktivator berbasis TALE pada sel manusia.
Strategi alternatif untuk mengikat domain efektor heterolog ke kompleks dCas9-
gRNA terikat DNA adalah untuk mengeksploitasi pasangan interaksi protein RNA yang
didefinisikan dengan baik. Pendekatan ini menggunakan dua komponen yang direkayasa:
sebuah gRNA yang memiliki satu atau dua tempat pengikatan RNA untuk protein bulu MSP
fase yang menyatu dengan ujung 3 dan perpaduan protein mantel MS2 ke domain efektor.
Penambahan urutan pengikatan RNA MS2 ke gRNA tidak menghilangkan kemampuannya
untuk menargetkan dCas9 ke lokasi DNA tertentu. Selanjutnya, co-ekspresi fusi protein MS2
coat dengan gRNA hibrida dan dCas9 digunakan untuk merekrut domain aktivasi ke
promoter gen pada sel manusia. Meskipun pengaktifan yang diamati tampaknya kurang kuat
daripada fusi langsung ke dCas9, jenis konfigurasi ini memberikan opsi dan fleksibilitas
tambahan untuk perekrutan multipleks domain efektor ke promotor tertentu.
Bukti menunjukkan bahwa efek dari jumlah kecil domain aktivasi dCas9 atau fusi
domain dCas9 yang diuji sampai saat ini dapat sangat spesifik pada sel manusia yang dinilai
berdasarkan eksperimen RNA. Namun, tidak semua kejadian menyebabkan perubahan
transkripsi gen. Masih harus ditentukan apakah efek fusi dCas9 lainnya terbukti sama
spesifiknya dengan efek genom-wide mereka karena aktivator dan represor berbasis dCas9
ini atau jika, seperti rekan inti mereka, mereka akan mendapatkan keuntungan dari spesifitas
yang disempurnakan yang diberikan oleh tru-gRNA .
Dalam aplikasi lain, telah ditunjukkan bahwa fusi EGFP-dCas9 dapat digunakan
untuk memvisualisasikan lokus DNA yang menyimpan urutan berulang seperti telomere
hanya dengan satu gRNA atau lokus non-repetitif menggunakan 26 sampai 36 gRNA yang
terpasang di wilayah 5 kb DNA. Strategi pencitraan ini menyediakan alat yang ampuh untuk
mempelajari dinamika dan struktur kromosom dan memperluas sistem dCas9 di luar aplikasi
berbasis ekspresi gen.