PETUNJUK PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

Penulis

Dr. Ni’matuzahroh
Prof. Dr. Ir. Tini Surtiningsih, DEA
Drs. Agus Supriyanto, M.Kes.
Tri Nurhariyati, S.Si.,M.Kes
Dr. Fatimah, S.Si., M.Kes.

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
2021
1
 Kata Pengantar

Alhamdulillah, ucapan syukur yang tak terhingga penyusun panjatkan ke

hadirat Allah Robb semesta alam. Berkat karunia sehat dan ilmu yang telah
diberikanNya kepada penyusun, maka buku “Petunjuk Praktikum Mikrobiologi
Lingkungan” ini dapat disusun untuk membantu mahasiswa Program Studi Ilmu dan
Teknologi Lingkungan yang memprogram praktikum mikrobiologi lingkungan, agar
lebih mudah memahami dan mempersiapkan praktikum yang akan dilakukan.
Materi yang diberikan pada praktikum ini sebagian besar disajikan dalam
bentuk tahapan kerja yang mudah diikuti oleh mahasiswa. Dasar teori hanya sedikit
yang disampaikan dengan harapan mahasiswa dapat mengeksplorasi dari sumber
bacaan lain.
Buku petunjuk praktikum ini masih terdapat banyak kesalahan dan belum
sempurna, untuk itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penyusun
butuhkan untuk perbaikan di masa datang.
Akhir kata, semoga buku ini bermanfaat bagi pihak yang membutuhkannya.

Surabaya, 7 September 2021

Penyusun

2
 Tata Tertib Praktikum
(Bila diselenggarakan secara offline di laboratorium)

1. Mahasiswa harus hadir di ruang praktikum tepat pada waktunya.

2. Mahasiswa harus mengikuti seluruh acara praktikum Mikrobiologi
Lingkungan, bila tidak hadir harus memberikan alasan dengan bukti yang sah
dan dapat diterima.
3. Dilarang gaduh, bercakap-cakap, merokok, makan dan minum selama acara
praktikum.
4. Jas laboratorium harus dilakukan selama melakukan praktikum di
laboratorium.
5. Sebelum dan sesudah praktikum, cucilah tangan dengan sabun antiseptik.
6. Jagalah alat-alat dengan baik. Jika ada kerusakan/kehilangan alat, mahasiswa
harus mengganti dengan alat serupa.
7. Untuk penggunaan alat-alat mikrobiologi yang besar seperti autoclave,
spektrofotometer, shaker, sentrifuge, dan lain-lain harus mengikuti petunjuk
operasional alat dengan pengawasan dosen pembina atau teknisi laboratorium.
8. Mahasiswa harus siap dengan materi praktikum dan teorinya. Pre test
dilakukan sebelum praktikum dimulai
9. Meja praktikum harus bersih sebelum dan sesudah praktikum, sampah dibuang
di tempat sampah.
10. Buatlah laporan hasil praktikum per kelompok dan dikumpulkan pada waktu
dan jam yang telah disepakati saat kontrak praktikum.

3
 Daftar Isi
Kata Pengantar ................................................................................................................

Tata Tertib Praktikum......................................................................................................

Daftar Isi..........................................................................................................................

Kontrak Praktikum...........................................................................................................

Praktikum 1 Pengenalan Alat Dan Teknik Sterilisas ...................................................

Praktikum 2 Mengenal Berbagai Jenis Media Dan Cara Pembuatannya.....................

Praktikum 3 Teknik Pemindahan Mikroorganisme Secara Aseptik.............................

Praktikum 4 Karakteristik Makroskopis dan Mikroskopis Mikroba

Morfologi Makroskopis Koloni Mikroba ...............................................

Morfologi Mikroskopis Mikroba (Pengecatan mikroba).........................

Praktikum 5 Pengukuran dan Penghitungan Kuantitas Mikroba

Penentuan Jumlah dan Ukuran Mikroba Secara Mikroskopis ................

Penghitungan Kuantitas Mikroba: Hitung Cawan (TPC) dan

Biomassa Sel (Metode Turbidimetrik).....................................................

Praktikum 6 Kurva Pertumbuhan Bakteri....................................................................

Praktikum 7 Uji Fisiologis Mikroba: Uji Fisiologis Bakteri Dan

Identifikasi Bakteri...................................................................................

Praktikum 8 Analisis Mikroba Air: Uji Mikrobiologi Air...........................................

Praktikum 9 Biomonitoring Pencemaran Perairan.......................................................

Praktikum 10 Analisis Mikroba Udara...........................................................................

Praktikum 11 Isolasi Dan Karakteristik Mikroba Tanah: Menghitung

Populasi Mikroba Tanah..........................................................................

Praktikum 12 Skrining Mikroba Potensial......................................................................

4
 Praktikum 1

PENGENALAN ALAT DAN

TEKNIK STERILISASI

TUJUAN
Bab ini dimaksudkan untuk mengenalkan pada mahasiswa :
1. Jenis-jenis alat laboratorium yang diperlukan dalam penelitian mikrobiologi
2. Konsep dan teknik sterilisasi dan prosedur yang harus dilakukan untuk
keberhasilan pengkulturan mikroorganisme.

PENDAHULUAN
Keberadaan mikroorganisme yang hidup di segala tempat ( tanah, udara, air,
makanan, pembuangan, dan pada permukaan tubuh) membuat para mikrobiolog
berusaha untuk memisahkan populasi suatu campuran mikroorganisme di alam ini
untuk memperoleh individu spesies tertentu yang akan dipelajari. Suatu kultur
mikroorganisme yang tersusun dari sel-sel spesies sejenis (tunggal) disebut sebagai
kultur murni. Untuk mengisolasi dan mempelajari mikroorganisme dalam kultur
murni, para mikrobiolog memerlukan perlengkapan dasar laboratorium yang berupa
bahan dan alat yang umumnya digunakan di bidang mikrobiologi.
Bahan ataupun peralatan yang dipergunakan di dalam bidang mikrobiologi harus
dalam keadaan steril sebagai syarat mutlak. Artinya pada bahan atau peralatan
tersebut tidak didapatkan mikroba lain yang tidak diharapkan, baik yang mengganggu
ataupun merusak media. Adapun bahan dan peralatan yang umumnya digunakan di
laboratorium mikrobiologi antara lain:
Cair
Media Semisolid Agar miring (slant)
Solid Agar tegak (deep)
Agar cawan (plate)

Autoklaf
Tabung kultur
Cawan petri
Peralatan Jarum ose loop dan tusuk Alat pemindah
Pipet
Waterbath Ruang kultivasi
Inkubator
Lemari pendingin

STERILISASI
Sterilitas merupakan syarat keberhasilan kerja dalam laboratorium mikrobiologi.
Untuk mencapainya, maka diperlukan teknik sterilisasi untuk memperoleh bahan dan

5
peralatan steril. Sterilisasi adalah proses proses untuk menjadikan peralatan dan
bahan-bahan bebas dari semua bentuk kehidupan. Tujuan dilakukan sterilisasi
sebelum pengkulturan adalah mematikan mikroorganisme lain yang tidak diinginkan
supaya tidak turut tumbuh dalam kultur murni. Berikut ini adalah garis besar teknik
sterilisasi yang umumnya dilakukan di laboratorium mikrobiologi.

Kering (udara panas) 1600C hingga 1800C selama 1.5 hingga 3 jam
Peralatan gelas kosong, pipet
Sterilisasi fisik
dengan panas Lembab (udara lembab) Uap bebas mengalir pada suhu 1000C (sterilisasi
sebentar)
Larutan thermolabil, misalnya gula-gula, susu, dll.

Autoklaf Uap bertekanan tinggi temperatur diatas 1000C (+ 1210C)

Media kultur, siring, larutan thermostabil, dll.

Sterilisasi Millipore-selulosa asetat disc Seitzasbestos pad, Pengambilan organisme dari

larutan
mekanik Berkefeld-diatomaceous earth, filter lilin, thermolabil dengan melewatkan
pada
dengan filtrasi sintered glass filter penarik-bakteri

Steriliasi Etilen oksida perangkat dari plastik dan pipet

Kimia Beta-propiolakton jaringan tubuh makhluk hidup
Desinfektan, larutan alkohol, larutan formalin

Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan
disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur tinggi. Cara sterilisasi
ini dapat dilakukan dengan menggunakan udara panas (panas kering) atau uap-air
panas (panas lembab) dengan tekanan tinggi. Sterilisasi panas kering mempergunakan
oven dengan temperatur 170-180 C selama 2 jam. Sterilisasi panas kering umumnya
dipergunakan untuk mensterilisasi peralatan gelas (tabung, labu, botol, dan
sebagainya). Sterilisasi panas lembab merupakan teknik sterilisasi yang banyak
digunakan, misalnya dengan menggunakan alat yang dinamakan autoklaf dengan
temperatur uap sekitar 121 C dan nilai tekanan 15 psi (1 atm) (Gambar 1.1).
Sterilisasi secara kimia dilakukan dengan mempergunakan berbagai jenis
desinfektan (larutan CuSo4, AgNO3, ZnO), larutan alkohol atau formalin. Beberapa
larutan garam seperti Nacl (9%) dan KCl (10%) dapat dipergunakan untuk membunuh
mikroba karena tekanan osmotiknya, yaitu menyebabkan dehidrasi pada substrat.
Sedangkan asam atau basa kuat dapat pula digunakan karena bersifat menghidrolisis
sel. Larutan KmNO4 (1%) dan HCl (1%) merupakan senyawa yang kuat karena dapat
mengoksidasi substrat. Sedangkan yang paling banyak digunakan adalah larutan
HgCl2 (0,1%), tetapi senyawa ketiga tersebut sangat beracun dan bersifat korosif serta
dapat dapat merusak jaringan inang dan mengendapkan protein. Pada tempat
penyimpanan air minum senyawa desinfektan yang umumnya digunakan adalah Cu
dari CuSO4, karena bila terkena air akan terjadi reaksi :

Cl2 + H2O  HCl + HOCl

HOCl  HCL + On

On inilah yang mempunyai daya oksidasi kuat untuk membunuh mikroba.

Sedangkan khlor mempunyai daya membunuh mikroba dalam dua cara, yaitu (1).

6
Secara oksidasi (On). (2). Khlorinasi langsung terhadap protein sel. Selain khlor,
larutan formalin atau formaldehid merupakan senyawa yang mudah larut dalam air,
tetapi sangat efektif dengan kadar antara 4 – 20 %. Begitu juga dengan larutan alkohol
dengan kadar 50 – 75 % banyak juga dipergunakan karena cepat menyebabkan
koogulasi (penggumpalan) mikroba.
Pada beberapa bahan yang dapat mengalami perubahan atau kerusakan akibat
pemanasan ataupun tekanan tinggi, teknik sterilisasinya dapat dilakukan dengan
secara mekanik, misalnya dengan saringan. Penyaringan dilakukan dengan filter
khusus, misalnya filter Berkefeld, Chamberland dan Seitz. Pemilihan jenis filter
tergantung dari tujuan penyaringan dan benda yang akan disaring. Saat ini yang
paling banyak digunakan adalah filter Chamberland dan Berkefeld dengan ukuran
porositas filter V (viel atau kasar), N (normal) dan W (weing atau halus).

Tipe-tipe filter yang dipergunakan dapat berbentuk filter selulosa, gelas atupun
porselen. Sedangkan cara penggunaan filter umumnya dilakukan sebagi berikut:
1. Filter ditempatkan antara corong dan penghubung, kemudian diikat.
2. Alat-filter ditempatkan diatas botol penampung hasil yang dihubungkan
dengan pompa vakum.
3. Larutan yang akan disaring ditempatkan pada corong dan pompa vakum
dijalankan, sehingga hasil saringan akan didapatkan pada botol penampung.

Pompa vakum dapat diganti dengan aliran air sebagai penghisap. Filter yang
sudah digunakan dapat dipergunakan lagi untuk memerikasa kandungan mikroba
yang terdapat dalam larutan.
a. Mengangkat filter yang sudah dipergunakan untuk menyaring, kemudian
ditanamkan ke dalam medium yang sudah disiapkan di dalam cawan petri.
b. Setelah masa inkubasi, pertumbuhan koloni mikroba dapat diamati dan
dihitung.
Sistem kerja filter, seperti pada saringan, yaitu melakukan seleksi terhadap
partikel-partikel yang lewat (disini mikroba) (Gambar 1.2).

PERLENGKAPAN
Bahan
Kertas sampul coklat, aluminium foil, kapas, kain kasa, kertas label, benang bol.

Alat
Bunsen, jarum inokulasi loop dan tusuk, pipet, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, gelas
Beaker, petri dish, pipet, rak tabung, autoklaf.

PROSEDUR
1. Sterilkan jarum inokulasi loop dan tusuk dengan cara membakar ujung jarum
yang terbuat dari logam pada api bunsen. Peganglah jarum dengan posisi agak
tegak di atas api, bakar jarum hingga berpijar dan pijar merambat hingga
pangkal bagian logam jarum. Lakukan seperti pada Gambar 1.3.
2. Untuk sterilisasi peralatan dari gelas seperti: tabung bakteriologis, dan labu
Erlenmeyer, tutuplah mulut gelas dengan kapas yang sudah dilapisi kain kasa,
kemudian tutup dengan aluminium foil. Sedangkan untuk gelas Beaker cukup
ditutup langsung dengan aluminium foil dan ikatlah erat dengan benang.

7
3. Untuk sterilisasi pipet, tutuplah ujung bagian untuk meniup dari pipet dengan
kapas, kemudian bungkus seluruh permukaan pipet dengan kertas sampul coklat.
4. Sedangkan untuk sterilisasi petri dish, cukup membungkus sepasang petri
(bagian bawah dan tutupnya) dengan kertas sampul coklat. Cara meletakkan
petri dish yang terbungkus dalam autoklaf, petri dish harus menghadap ke atas
atau bagian tutup ada di atas.
5. Cara menggunakan autoklaf : a). Pastikan air dalam autoklaf cukup (tinggi air +
2 cm dibawah dasar keranjang) atau sebanyak 3-5 liter; b). Aturlah alat-alat
yang akan disterilkan ke dalam keranjang autoklaf dalam posisi dimana kira-kira
seluruh permukaan alat dapat terjangkau oleh uap dalam autoklaf; c). Tutuplah
autoklaf dengan erat, kemudian atur pengontrol waktu pada angka 20 (20 menit)
dan pastikan pengontrol exhaust dalam keadaan terbuka dan pengontrol drain
dalam keadaan tertutup; d). Setelah uap naik, yaitu ditandai dengan keluarnya
uap dari selang pembuangan yang ditandai dengan bunyi mendesis, maka
tutuplah lubang exhaust; e) setelah autoklaf bekerja selama + 20 menit dan
sudah terdengar alarm tanda selesai, jangan langsung membuka tutup autoklaf
tetapi tunggu sampai penunjuk tekanan menunjuk pada angka 0.

Gambar 1.1. Alat autoklaf dan bagian-bagiannya

8
Gambar 1.2. Cara kerja saringan dalam menyeleksi partikel jasad yang lewat

Gambar 1.3. Teknik sterilisasi loop dengan pembakaran api bunsen

9
 Praktikum 2

MENGENAL BERBAGAI JENIS MEDIA

DAN CARA PEMBUATANNYA

TUJUAN
Bab ini dimaksudkan untuk memberi pengetahuan kepada mahasiswa mengenai
berbagai jenis media pertumbuhan mikroba dan menguasai cara-cara pembuatannya.

PENDAHULUAN
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat hara (nutrient) yang
berguna untuk membiakkan dan pertumbuhan mikroba. Media dapat digolongkan
berdasarkan bentuk, susunan kimia dan fungsinya.
1. Berdasarkan bentuknya terdiri dari : media padat, media semi padat dan media
cair
2. Berdasarkan susunan kimia nya terdiri dari :
a. Media sintetik / media siap saji, adalah media yang dibuat dari bahan-bahan
yang susunan kimianya diketahui dengan pasti, media ini diproduksi dan
dibuat oleh pabrik/industri seperti : Difco, Oxoid, dan Merck.
b. Media non sintetik / media alami, adalah media yang dibuat dari bahan-
bahan alami seperti daging, kentang, tauge dll. yang susunan kimianya tidak
diketahui dengan pasti, media ini dibuat sendiri
3. Berdasarkan fungsinya terdiri dari : media selektif, media diperkaya, media
diferensial, media penguji, media untuk menghitung mikroba dan media khusus.

Agar mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembangbiak di dalam media,

diperlukan persyaratan tertentu bagi media, yaitu :
1. harus mengandung semua unsur hara yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan
perkembangan mikroorganisme.
2. mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan
kebutuhan mikroorganisme.
3. dalam keadaan steril, artinya sebelum diinokulasi mikroorganisme yang
dimaksud, tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme lain yang tidak diharapkan.

Bentuk dan susunan media ditentukan oleh senyawa penyusun media, persentase
campuran dan tujuan penggunaan.

10
 Padat atau solid
Bentuk Cair (broth)
Semi-solid atau semi-cair
Alami
Susunan Sintetik
Media Semi-sintetik

Umum
Pengaya
Sifat Selektif
Differensiasi
Penguji
Penghitungan

Kelangsungan dan survival pertumbuhan mikroorganisme bergantung pada

ketersediaan nutrisi dan lingkungan tumbuh yang cocok. Pada dasarnya semua media
kultur adalah cair, semisolid, atau solid. Medium yang cair dan tidak mengandung
agen solid disebut medium cair (medium broth). Medium cair yang ditambah dengan
agen solid yang disebut agar menghasilkan medium solid atau semisolid.
Agar adalah ekstrak dari rumput laut yang merupakan karbohidrat kompleks
penyusun utamanya galaktosa dan tidak mengandung nutrisi. Medium solid
membutuhkan agar sekitar 1.5 hingga 1.8%. Sedangkan konsentrasi kurang 1 % dari
tersebut akan menjadi medium semisolid. Agar bertindak sebagai agen pemadat yang
sangat baik karena pada suhu 1000C berupa larutan sedangkan pada suhu 400C
memadat. Oleh karena itu organisme terutama yang patogen dapat dikultivasi pada
temperatur 37.50C atau sedikit lebih tinggi tanpa rasa kuatir medium akan meleleh.
Medium solid mempunyai keuntungan karena dapat memadat sehingga dapat
ditumbuhi mikroorganisme dengan menggunakan teknik khusus untuk mengisolasi
koloni yang berlainan. Pada saat masih cair, medium solid dalam tabung reaksi
diletakkan miring dengan sudut + 150, sehingga saat medium mendingin dan memadat
akan membentuk agar miring (slant agar). Media ini berguna untuk menyimpan kultur
murni untuk keperluan subkultur. Medium dalam tabung yang tidak dimiringkan
melainkan diletakkan pada posisi tegak pada rak, saat memadat akan menjadi agar
tegak (agar deep tube). Agar ini fungsi utamanya adalah untuk keperluan mempelajari
kebutuhan gas mikroorganisme. Sedangkan medium yang diletakkan dalam labu
Erlenmeyer, dapat dicairkan dalam waterbath kemudian dituang dalam cawan petri
menjadi agar cawan datar (agar plate) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.1.

11
 A B C

Gambar 2.1. Bentuk-bentuk media padat (agar) : A. Agar miring. B. Agar tegak. C. Agar
cawan datar.

PERLENGKAPAN
Bahan
Media sintetik dari MERCK yaitu : Nutrien Agar (NA) 20 g/l dari , Nutrien Broth
(NB) 8 g/l, Potato Dextrose Agar (PDA) 39 g/l; daging segar tanpa lemak 200 g;
kentang 200 g; tauge 100 g; dextrose 15 g; sukrosa 60 g; pepton 5 g; dan NaCl 0,5 g.

Alat
Tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas Beker , labu Erlenmeyer, api bunsen / spiritus,
alkohol, kapas, aluminium foil, gelas ukur / pipet volume 10 ml

PROSEDUR
A. Media Sintetik
1. Media Cair Nutrien Broth (NB)
a. Masukan media NB 0,8 gram kedalam gelas Beker.
b. Tambahkan 100 ml akuades.
c. Panaskan di atas kompor listrik sampai semua bahan terlarut sempurna.
d. masukkan ke dalan tabung reaksi masing-masing 6 ml.
e. Tutup rapat dengan kapas, kemudian lapisi dengan aluminium foil.\
f. Sterilkan dengan autoclave pada tekanan 1 atm, temp 121 oC selama 15-20
menit.
2. Media Padat Nutrien Agar (NA)
a. Masukkan media NA 2,0 gram ke dalam gelas Beker yang berisi 100 ml
akuades.
b. Selanjutnya kerjakan hal yang sama seperti membuat media NB.
3. MEDIA PADAT Potato Dextrose Agar (PDA)
a. Masukkan media PDA 3,9 ke dalam gelas Beaker yang berisi 100 ml
akuades.
b. Selanjutnya kerjakan hal yang sama seperti membuat media NB.

12
Media Non Sintetik
1. Media ekstrak daging agar
a. Daging segar 200 gram dipotong-potong dadu 1cm.
b. Masukkan ke dalam 1.000 ml akuades dalam panci.
c. Didihkan selama 1 jam di atas kompor listrik.
d. Saring ke dalam gelas Beker, tutup dengan aluminium foil,
e. Biarkan 1 malam dalam lemari es.
f. Pisahkan suspensi yang bening ke dalam Beker gelas, buang endapannya.
g. Tambah aquades hingga volume akhir 1.000 ml.
h. Tambahkan peptone 5 gram, NaCl 0,5 gram dan agar 15 gram.
i. Panaskan di atas kompor listrik hingga semua bahan terlarut sempurna.
j. Masukkan kedalam tabung reaksi masing-masing 6 ml.
k. Tutup rapat dengan kapas, kemudian lapisi dengan aluminium foil.
l. Sterilkan dengan autoclave pada tekanan 1 atm, temperatur 121oC selama
15-20 menit

2. Media kentang dextrose agar

a. Kentang kupas 200 gram dipotong-potong dadu 2 cm
b. Masukkan 1.000 ml akuades dalam panci.
c. Didihkan selama 1 jam di atas kompor listrik.
d. Saring kedalam gelas Beker.
e. Pisahkan suspensi yang bening ke dalam gelas Beker , buang endapannya.
f. Tambah akuades hingga volume akhir 1000 ml.
g. Tambahkan dextrosa 15 gram dan agar 15 gram.
h. Panaskan di atas kompor listrik hingga semua bahan terlarut sempurna.
i. Masukkan ke dalan tabung reaksi masing-masing 6 ml.
j. Tutup rapat dengan kapas, kemudian lapisi dengan aluminium foil.
k. Sterilkan dengan autoclave pada tekanan 1 atm, temp 121oC selama 15-20
menit.

3. Media tauge agar

a. Didihkan 100 g tauge dalam 1000 ml akuades dalam panci selama 1 jam di
atas kompor listrik.
b. Saring kedalam gelas Beker
c. Tambahkan sukrosa 60 gram dan agar 15 gram.
d. Panaskan di atas kompor listrik hingga semua bahan terlarut sempurna.
e. Masukkan ke dalan tabung reaksi masing-masing 6 ml.
f. Tutup rapat dengan kapas, kemudian lapisi dengan aluminium foil.
g. Sterilkan dengan autoclave pada tekanan 1 atm, temperatur 121oC selama
15-20 menit.

13
 Praktikum 3

TEKNIK PEMINDAHAN
MIKROORGANISME SECARA ASEPTIK

TUJUAN
Bab ini dirancang untuk mengajari mahasiswa dalam menguasai teknik pemindahan
bakteri secara aseptik

PENDAHULUAN
Mikroorganisme terdapat dimana-mana, oleh karena itu mikrorganisme luar
yang tidak dikehendaki dapat masuk kedalam biakan murni melalui aliran udara,
kontak tangan yang tercemar, atau melalui tersentuhnya media atau permukaan
tabung bagian dalam oleh benda yang belum disterilkan.
Untuk mencegah mikroorganisme luar yang tidak dikehendaki masuk kedalam
biakan murni, perlu digunakan teknik aseptik, dimana semua peralatan maupun media
pertumbuhan yang akan digunakan pada teknik ini harus dalam keadaan steril/aseptik.
Ada Beberapa metode untuk memindahkan biakan murni dari satu wadah ke
wadah yang lain secara aseptik:
a. Metode streak / gores
b. Metode spread / sebar
c. Metode pour plate / cawan tuang

Pada praktikum ini akan dipelajari langkah demi langkah cara memindahkan
biakan murni dengan teknik aseptik. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri
dari satu spesies tunggal.
Usahakan agar teknik aseptik ini dapat dikuasai dengan baik karena akan
digunakan dalam sebagian kegiatan laboratorium berikutnya atau untuk kegiatan
penelitian akhir studi bidang mikrobiologi.

PERLENGKAPAN
Kultur
Rak tabung reaksi, tabung reaksi, media nutrient broth (NB), media nutrient agar
(NA)

Alat
Jarum ose / lup inokulasi, batang kaca bentuk L untuk metode sebar spread, api
bunsen / spiritus, alkohol, aluminium foil

14
PROSEDUR
A. Metoda streak / gores pada tabung agar miring
4. Siapkan jarum ose/lup inokulasi dari kawat nikrom, panjang kawat 6-10 cm,
pada ujung kawat terdapat lingkaran dengan diameter antara 2-4 mm.
5. Siapkan 3 tabung reaksi yang disumbat kapas, 1 tabung berisi biakan murni
bakteri, 1 tabung berisi medium padat NA / agar miring steril, 1 tabung berisi
media cair NB steril
6. Pegang 2 tabung reaksi di tangan kiri (1 tabung berisi biakan murni bakteri
dan 1 tabung berisi medium cair NB) dan jarum ose di tangan kanan
7. Panaskan jarum ose di atas pembakar spiritus sampai seluruh kawatnya pijar,
kemudian gerakkanlah dengan cepat ose tersebut kearah bawah di atas api
sehingga sebagian tangkai jarum ose ikut terpanasi, biarkan jarum ose
mendingin selama + 20 detik sebelum dipakai, untuk mencegah matinya
bakteri yang akan dipindahkan.
8. Angkat sumbat kapas ke dua tabung reaksi satu demi satu, mulai dengan
sumbat tabung yang terdekat dengan tangan kanan yaitu tabung yang berisi
biakan bakteri, dengan cara melingkarkan jari kelingking di sekitar sumbat
kapas.
9. Angkatlah sumbat kapas tabung yang berisi media steril dengan jari manis,
gerakan memutar biasanya memudahkan lepasnya sumbat dari mulut tabung
10. Panaskan mulut kedua tabung reaksi yang tidak bersumbat dengan cara
melakukannya bolak-balik sebanyak dua kali di atas api. Jagalah agar sudut
kemiringan tabung tidak melebihi 45o bila tidak tersumbat.
11. Masukkan lup pada tabung yang berisi bakteri untuk dipindahkan ke dalam
tabung yang berisi media cair steril
12. Panaskan kembali mulut kedua tabung tersebut seperti semula
13. Kembalikan sumbat masing-masing tabung seperti sediakala, tutup dengan
aluminium foil.
14. Ulangilah pemindahan aseptik untuk memindahkan sejumlah kecil bakteri
kedalam tabung berisi agar miring NA steril. Cara inokulasi agar miring
dimulai dengan meletakkan lup yang mengandung bakteri pada dasar
kemiringan agar, lalu ditarik ke atas dengan gerakan zigzag.
15. Setelah mulut tabung dipanaskan dan disumbat kembali dengan kapas dan
aluminium foil, simpanlah tabung ke rak tabung
16. Berilah etiket pada semua tabung yang baru diinokulasi, letakkan tabung di
ruang yang disediakan untuk diinkubasi selama 48 jam pada suhu kamar.
17. Pada kegiatan praktikum berikutnya, Amatilah tabung-tabung tsb, bila teknik
pemindahan secra aseptik dilakukan dengan baik maka tabung NB akan
tampak keruh, sedangkan pada agar miring NA tampak zig-zag koloni bakteri
18. Tunjukkan ,hasil praktikum Anda pada Dosen/asisten yang bertugas.

B. Metoda streak / gores pada agar cawan Petri

1. Bagian bawah cawan Petri yang berisi Nutrient Agar dibagi menjadi 4 bagian
dengan menggunakan spidol
2. Buka tutup cawan Petri dengan mulutnya didekat api Bunsen
3. Pijarkan ujung lup, dinginkan
4. Masukkan lup pada tabung yang berisi bakteri
5. Ujung lup yang berisi bakteri digoreskan di atas cawan Petri dimulai dari
bagian 1, lanjutkan ke bagian 2, kemudian bagian 3 dan terakhir bagian 4.

15
 Perhatian selama menggores dari bagian 1 sampai bagian 4, ujung lup yang
mengandung bakteri tidak boleh keluar dari dalam cawan Petri
6. Tutup cawan Petri, kemudian isolasi sekeliling cawan, sehingga cawan
tertutup rapat, untuk selanjutnya sama dengan di atas mulai no.13 – 15

C. Metode spread / sebar

1. Pipet 0,1 ml biakan murni bakteri dengan pipet volume
2. Buka tutup cawan Petri yang berisi agar nutrient dengan mulutnya didekat api
Bunsen
3. Pipet 0,1 ml biakan bakteri dan diteteskan di atas media padat
4. Kemudian sebarkan /spread dengan alat spread dari gelas bentuk L, secara
merata
5. Tutup cawan Petri, kemudian isolasi sekeliling cawan, sehingga cawan
tertutup rapat, untuk selanjutnya sama dengan di atas mulai no.13 - 15

D. Metode pour plate / cawan tuang

1. Pipet 1 ml biakan murni bakteri dengan pipet volume
2. Buka tutup cawan Petri kosong yang sudah steril dengan mulutnya didekat api
bunsen
3. Masukkan 1 ml biakan bakteri tsb di atas cawan Petri kosong
4. Kemudian tuang larutan nutrient agar yang masih cair t. 40 oC (dapat di coba
dengan menempelkan labu Erlenmeyer yang berisi NA cair, jika di pipi sudah
tidak terasa tidak terlalu panas siap digunakan) kedalam cawan Petri yang
berisi bakteri tersebut
5. Tutup cawan Petri, putar-putar 3 kali ke kiri dan 3 kali ke kanan
6. Biarkan di suhu ruang sampai agarnya membeku dan diisolasi sekitar cawan.
Biakan lalu disimpan di diinkubator sesuai dengan suhu dan waktu yang
dibutuhkan untuk pertumbuhannya. Selanjutnya sama dengan di atas mulai
no.13 - 15

16
 Praktikum 4

KARAKTERISTIK MIKROBA:
MORFOLOGI MAKROSKOPIS DAN
MIKROSKOPIS

TUJUAN
Bab ini dirancang agar mahasiswa dapat membedakan karakteristik kultural
mikroorganisme yang menjadi syarat utama dalam upaya mengidentifikasi dan
mengklasifikasikan organisme dalam kelompok taksonominya

PENDAHULUAN
Mikroorganisme apabila ditumbuhkan pada bermacam-macam jenis media, akan
mengembangkan perbedaan dalam penampakan makroskopis pada pertumbuhannya.
Perbedaan-perbedaan ini disebut karakteristik kultural, dan digunakan sebagai dasar
untuk memisahkan mikroorganisme ke dalam kelompok-kelompok taksonomi.
Karakteristik kultural untuk semua mikroorganisme yang sudah dikenali terdapat
dalam Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Mikroorganisme tersebut
dideterminasi dengan menumbuhkannya pada media nutrient agar miring di tabung
reaksi dan media nutrient agar datar di cawan petri, nutrient broth dan nutrient gelatin.
Pola pertumbuhan yang ditunjukkan pada masing-masing media diuraikan di bawah
ini.

NUTRIENT AGAR MIRING pertumbuhan ditunjukkan pada satu garis lurus

inokulasi pada permukaan agar, dan evaluasi pertumbuhannya dengan cara di bawah
ini:
1. Kelimpahan Pertumbuhan: Banyaknya pertumbuhan dinyatakan sebagai none
(tidak tumbuh), slight (lemah), moderate (sedang), large (lebar)
2. Letak Pertumbuhan: Pertumbuhan koloni di permukaan agar, pertumbuhan di
bawah permukaan (di dalam) agar
3. Pigmentasi: Mikroorganisme kromogenik dapat menhasilkan pigmen intraseluler
yang bertanggung jawab dalam pembentukan warna organisme yang terlihat pada
permukaan koloni. Mikroorganisme lainnya juga ada yang dapat menghasilkan
pigmen ekstraseluler (bersifat larut) yang diekskresikan ke dalam medium dan
juga menghasilkan warna. Pada umunya mikroorganisme bersifat non
kromogenik yang akan nampak berwarna putih hingga abu-abu
4. Konsistensi: Dapat dievaluasikan berdasarkan banyaknya cahaya yang dilewatkan
pada koloni yang tumbuh. Karakter termasuk sebagai opaque (buram/tidak
tembus cahaya), translucent (tembus cahaya sebagian/partial), atau transparent
(transparan/tembus cahaya penuh)
5. Bentuk: Penampakan koloni yang tumbuh pada satu goresan lurus pada
permukaan agar dinyatakan sebagai berikut:
a. Filiform: Sinambung/continuees, pertumbuhan seperti benang dengan tepian
yang rata

17
 b. Echinulate: Sinambung, pertumbuhan seperti benang, dengan tepian tidak rata
(irregular)
c. Beaded: Nonconfluent (tidak sinambung) hingga semiconfluent
d. Effuse: Tipis, pertumbuhan menyebar
e. Arborescent: Pertumbuhan seperti pohon
f. Rhizoid: Pertumbuhan seperti akar

NUTRIENT AGAR PLATE (AGAR CAWAN)

Karakteristik koloni yang tumbuh terpisah dengan baik dapat dievaluasi dengan ciri-
ciri sebagai berikut:
1. Ukuran: Pinpoint (titik sangat kecil), small (kecil), moderate (sedang), large
(lebar)
2. Pigmentasi: Warna koloni
3. Bentuk: Bentuk koloni yang digambarkan sebagai berikut:
a. Circular: Tepian yang teratur/tidak patah
b. Irregular: Tepian yang berlekuk
c. Rhizoid: Pertumbuhan menyebar seperti akar
4. Tepi: Penampakan tepian terluar koloni yang digambarkan sebagai berikut:
a. Entire: Sangat luas
b. Lobate: Lekukan yang jelas
c. Undulate: Lekukan seperti gelombang
d. Serrate: Bergerigi
e. Filamentous: Seperti benang, tepian menyebar
5. Elevasi: Sudut penonjolan pertumbuhan koloni pada permukaan agar yang
digambarkan sebagai berikut:
a. Flat: Datar, elevasi tidak nyata
b. Raised: Sedikit menonjol
c. Convex: Elevasi berbentuk kubah
d. Umbonate: Menonjol dengan elevasi konveks di bagian tengah

KULTUR NUTRIENT BROTH Evaluasi berdasarkan penyebaran dan penampakan

pertumbuhan sebagai berikut:
1. Seragam dengan penyebaran yang rata: Pertumbuhan yang tersebar rata
dengan baik dalam seluruh medium
2. Floccculant: Agregate yang mudah terbelah yang tersebar di seluruh medium
3. Pellicle: Tebal, pertumbuhan yang membentuk blok di permukaan medium
4. Sediment: Pertumbuhan terkonsentrasi pada bagian bawah kultur broth, bisa
bergranular, serpihan atau flocculant

NUTRIENT GELATIN Medium padat ini dapat dicairkan oleh aktivitas enzimatik
dari gelatinase. Pencairan yang terjadi mempunyai bermacam-macam pola:
1. Crateriform: Daerah permukaan yang mencair bentuknya seperti mangkuk
2. Napiform: Pencairan bentuk seperti bulbus pada permukaan
3. Infundibuliformis: Bentuk seperti corong
4. Saccate: Memanjang, seperti tabung
5. Startiform: Pencairan penuh dari setengah bagian atas medium

18
PERLENGKAPAN
Bahan
Kultur Pseudomonas aeruginosa dalam nutrient broth yang berusia 24 jam,
Micrococcus luteus, Escherichia coli, Bacillus cereus dan Mycobacterium smegmatis.
Rancangan per kelompok: masing-masing lima nutrient agar cawan, nutrient agar
miring, nutrient broth dan nutrient gelatin dalam tabung.
Alat
Bunsen, jarum inokulasi, loop dan tusuk

PROSEDUR
1. Beri label masing-masing cawan petri dan tabung dengan nama organisme yang
akan diinokulasi dan berilah identitas masing-masing kelompokmu
2. Dengan teknik steril, inokulasikan pada masing-masing media sesuai petunjuk
berikut:
a. Nutrient agar cawan: dengan loop steril, inokulasikan mikroorganisme dengan
cara metode gores untuk mendapat koloni yang terpisah
b. Nutrient agar miring: dengan loop steril, buatlah goresan lurus satu kali, mulai
pada bagian butt dan tarik jarum ke atas bagian slant permukaan agar
c. Nutrient broth: dengan loop steril, inokulasikan tiap organisme ke dalam
tabung nutrient broth. Gojok loop beberapa kali untuk melepaskan kultur
d. Nutrient gelatin: dengan jarum tusuk steril, lakukan inokulasi dengan
menusukkan masing-masing organisme
3. Inkubasi semua kultur pada temperatur 370C selama 24-48 jam
4. Bedakan karakteristik kultural mikroorganisme pada berbagai media yang telah
ditanami

19
Praktikum 4

20
21
22
23
24
25
26
Praktikum 5

27
28
29
30
 Praktikum 5

Penghitungan Kuantitas Mikroba: Hitung

Cawan (TPC) dan Biomassa Sel (Metode
Turbidimetrik)

TUJUAN
Bab ini bertujuan untuk membuat mahasiswa paham mengenai:
1. Teknik seri pengenceran dan penentuan konsentrasi biomassa bakteri yang
variabel dengan metode hitungan cawan (TPC)
2. Penentuan turbiditas suatu kultur mikroba dengan menggunakan spektrofotometer
dan kolerasinya terhadap hitungan sel yang bersangkutan

PENDAHULUAN
Analisis material yang berupa makanan, air, susu dan udara dalam hal-hal tertentu
membutuhkan perhitungan jumlah mikroorganisme. Metode yang dapat dilakukan
untuk memenuhi hal tersebut antara lain: penghitungan mikroskopik langsung,
elektronik sel counter seperti misalnya coulter counter, metode kimiawi untuk
mengetahui massa sel atau penyusun selular, pengukuran turbidimetri untuk
peningkatan massa sel dan penghitungan total koloni pada cawan yang menggunakan
metode pengenceran seri agar cawan. Pada praktikum kali ini akan dilakukan dua
teknik penentuan jumlah bakteri dalam suatu sampel atau kultur, yaitu:

1. Metode Hitung Cawan

Metode hitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat
hidup akan berkembang biak menjadi satu koloni. Jadi jumlah koloni yang
muncul pada cawan mengandung suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat
hidup yang terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasai dalam metode
ini adalah mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut.
Setelah inkubasi, jumlah koloni masing-masing cawan diamati. Untuk memenuhi
pesyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni adalah yang
mengandung antara 30 – 300 koloni. Karena jumlah mikroorganisme dalam
sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya
satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat
tersebut, maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah
organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalihkan
jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang
bersangkutan.

2. Metode Turbidimetrik
Metode turbidimetrik merupakan metode pengukuran kekeruhan biakan dengan
fotokolorimetri. Namun agar data yang diperoleh pengukuran ini dapat
dinyatakan sebagai konsentrasi organisme, diperlukan suatu kurva standar yang
menyatakan korelasi antara kekeruhan biakan dengan jumlah organisme per-ml

31
 biakan. Kurva semacam ini dapat diperoleh dengan cara menggunakan metode
hitungan cawan untuk menentukan hitungan organisme di dalam biakan yang
kekeruhannya diketahui. Sekali kurva standar ini diperoleh, maka sejumlah
biakan organisme sejenis dapat dengan cepat diukur kekeruhannya dan
konsentrasinya segera diketahui dengan cara membaca kurva standar tersebut.

Untuk memahami cara kerja fotokolorimeter, sumber cahaya dalam alat tersebut
memancarkan seberkas cahaya putih melalui dua buah lensa dan celah masuk ke suatu
kisi difraksi yang pada gilirannya menyebarkan cahaya menjadi berkas-berkas
horisontal dengan semua warna spektrum. Dari warna ungu dan ultra ungu
(gelombang cahaya pendek), sampai kepada warna merah (gelombang cahaya
panjang). Spektrum cahaya jatuh pada layar gelap yang dilengkapi dengan celah
keluar. Hanya bagian spektrum yang kebetulan jatuh pada celah tersebut memasuki
sampel yang akan menjadi berkas monokromatik. Panjang gelombang mana yang
akan masuk melalui celah tersebut dapat diatur dengan menyesuaikan arah kisi
difraksi melalui pemutaran tombol pengatur panjang gelombang pada alat tersebut.

Untuk mencatat Optical Density (OD) atau % transmitan digunakan galvanometer.

Makin sedikit jumlah sel dalam suspensi, makin besar intensitas cahaya yang lolos
dan makin tinggi pula % transmitan yang tercatat. Sebelum alat tersebut digunakan
untuk mengukur sampel, terlebih dahulu harus dikalibrasi dengan tabung berisikan
medium steril untuk menetapkan 100%T. Setelah dikalibrasi maka kekeruhan sampel
biakan dapat dibaca dengan cara menaruh tabung berisi biakan tersebut ke dalam
sampel alat tersebut. Melalui perhitungan, nila %T kemudian diubah dan dinyatakan
sebagai nilai Absorbans (A) atau rapat optis (Optical Density atau OD)

PERLENGKAPAN
BAHAN: ALAT:
- Kultur E. coli dalam NB - Tabung fotokolorimeter
- Media NB steril - Pipet steril
- Media NA cair - Cawan petri steril
- Medium NB steril dalam tabung reaksi - Tabung reaksi
- Akuades - Waterbath
- Api bunsen/spiritus - Spektrofotometer Spectronic 20
- Alkohol
- Kapas
- Aluminium foil

PROSEDUR
1. Siapkan enam tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml medium NB steril dan
berilah label pada tabung dengan label 1:101, 1:102, ..., 1:106 dan tujuh cawan petri
dengan label 1:100, 1:101, 1:102, ..., 1:106
2. Kocoklah (gambar 3a.1) atau vortek suspensi biakan E. coli sampai kekeruhannya
merata (homogen). Pengkocokan sebaiknya dilakukan lebih dari 25 kali atau
memvorteknya selama satu menit supaya homogen. Saat mengkocok atau
memvortek jangan sampai sumbat (kapas) basah akan suspensi. Kemudian secara
aseptik pipetlah 5 ml suspensi E. coli dan masukkan ke dalam tabung
fotokolorimeter untuk diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer yang

32
 telah diset. Setiap akan mengukur nilai absorbansi, tabung fotokolorimeter harus
diseka dengan tisu. Bila nilai absorbansinya lebih dari 1, maka sampel diencerkan
dengan blanko (medium NB steril) sampai perbandingan tertentu untuk
mendapatkan nilai absorbansi <1. Catatlah nilai absorbansi yang diperoleh
sebagai nilai absorbansi pengenceran 1:100 atau nilai absorbansi suspensi biakan
E. coli awal. Hasil OD sebenarnya adalah faktor pengenceran dikali nilai OD
setelah diencerkan. Setelah itu pipet 1 ml lagi suspensi biakan E. coli secara
aseptik untuk dimasukkan ke dalam cawan petri steril yang berlabel 1:100.
Selanjutnya pipet lagi 1 ml suspensi biakan E. coli dan masukkan ke dalam tabung
reaksi berlabel 1:101 untuk mendapatkan biakan suspensi E. coli dengan nilai
pengenceran 1:101. Setelah itu letakkan pipet dalam tempat disinfektan
3. Langkah nomor 3 sama dengan langkah nomor 2, yaitu melakukan serangkaian
seri pengenceran mulai 1:101, 1:102, ..., 1:106 disertai pengukuran nilai absorbansi
dan pemindahan 1 ml suspensi biakan masing-masing seri pengenceran ke dalam
cawan petri steril yang sesuai (berlabel sama) dengan seri pengenceran tersebut
4. Siapkan medium NA cair (±500C) dan tuangkan ke dalam tujuh cawan petri yang
telah berisi suspensi biakan E. coli dari serangkaian seri pengenceran (1:100,
1:101, 1:102, ..., 1:106). Kemudian putar-putarkan masing-masing cawan petri di
atas meja dengan perlahan-lahan sebanyak 20 kali dengan gerakan membentuk
angka delapan
5. Biarkan agar dalam cawan petri menjadi padat. Setelah itu letakkan cawan petri
dalam posisi terbalikdan inkubasi pada suhu kamar (±370C) selama 24 jam
6. Amati pertumbuhan dengan menghitung populasi koloni yang muncul dengan
bantuan coulter counter. Pilihlah cawan yang jumlah koloninya antara 30-300.
bila koloni dalam satu cawan kurang atau lebih dari 30 – 300, maka tidak
memenuhi syarat untuk dihitung. Kalkulasi jumlah organisme atau bakteri E. coli
dalam sampel adalah jumlah koloni yang terhitung dikalikan faktor
pengencerannya. Bila ada satu cawan yang mempunyai jumlah koloni yang
memenuhi syarat, hitunglah rata-ratanya dan jumlah koloni yang terhitung per
pengenceran hanya digunaka dua bilangan nyata. Satuan yang digunakan dari
hasil perhitungan adalah jumlah organisme per ml biakan atau sampel (cfu/ml)
7. Prosedur kerja awal sampai akhir sesuai dengan Gambar 4.1 Hasil akhir dari
praktikum ini adalah diperoleh suatu grafik antara nilai absorbansi (OD) masing-
masing nilai pengenceran (sumbu y) dengan jumlah koloni masing-masing
pengenceran (sumbu x), sehingga diketahui korelasi antara nilai OD (kekeruhan)
dengan jumlah sel viabel dalam biakan seperti Gambar 4.2.

33
34
 Praktikum 6

KURVA PERTUMBUHAN BAKTERI

TUJUAN
1. Mengambil data dinamika pertumbuhan populasi kultur bakteri.
2. Membuat kurva pertumbuhan dari suatu kultur bakteri
3. Menentukan waktu generasi kultur bakteri.

PENDAHULUAN
Studi mengenai pertumbuhan populasi bakteri memerlukan inokulasi sel-sel
yang viabel ke dalam media cair steril, dan inkubasi kultur pada kondisi aerob,
temperatur, dan pH optimum. Pada kondisi ini sel-sel akan secara cepat bereproduksi.
Dan dinamika pertumbuhan mikroba dapat dipetakan dalam kurva pertumbuhan
populasi, yang dibuat dengan memplotkan peningkatan jumlah sel terhadap waktu
inkubasi. Kurva pertumbuhan bakteri dapat digunakan untuk menggambarkan tahap-
tahap dari siklus pertumbuhan bakteri. Kurva juga memudahkan pengukuran jumlah
sel dan kecepatan pertumbuhan dari organisme pada kondisi yang distandarkan
sebagai waktu generasi yaitu, waktu yang dibutuhkan oleh mikroba untuk mengganda.
Pembentukan kurva pertumbuhan yang sempurna memerlukan waktu sekitar 24
jam dalam labu kultur yang diinkubasi di shaker (alat penggojok), populasinya diukur
selama inkubasi dengan interval waktu tertentu. Tetapi untuk percobaan laboratorium
tidak diharuskan untuk mencapai kurva pertumbuhan sempurna. Oleh karena itu
percobaan berikut ini mengikuti prosedur yang dimodifikasi untuk medapatkan fase
lag dan fase log saja. Kurva akan diplotkan pada kertas semilog dengan menggunakan
dua nilai pengukuran pertumbuhan. Metode langsung memerlukan penghitungan sel-
sel viabel menggunakan pengenceran seri dari sampel kultur uji yang diambil tiap
interval waktu 30 menit. Sedangkan metode tidak langsung dilakukan dengan
pengukuran peningkatan kekeruhan kultur bakteri menggunakan metode turbiditas
dengan bantuan alat spektrofotometer Peningkatan kekeruhan pada tiap interval waktu
30 menit dipakai sebagai indikator terjadinya peningkatan massa sel.
Siswa akan menentukan waktu generasi dengan metode langsung dan tidak
langsung dari data kurva pertumbuhan. Penentuan tidak langsung dengan cara yang
sederhana dari fase log seperti pada Gambar 5.1. Pilihlah dua titik pada skala
densitas optik, misalnya 0.2 dan 0.4, yang merepresentasikan turbiditas yang
mengganda. Dengan menggunakan penggaris, gambarkan garis antara dari tiap
densitas optik yang terpilih pada ordinat dengan garis dari kurva pertumbuhan.
Kemudian buat garis tegak lurus dari titik-titik akhir pada kurva pertumbuhan
terhadap absis interval waktunya masing-masing. Dengan persamaan sebagai berikut,
tentukan waktu generasinya:

35
 GT = t(O.D. 0.4) – t(O.D. 0.2)
GT = 90 menit – 60 menit = 30 menit

Metode langsung menggunakan skala jumlah sel pada kurva pertumbuhan dengan
persamaan di bawah ini:

g = t log 2
log b – log B

g = waktu generasi
B = jumlah sel bakteri pada awal fase log, atau titik dalam fase log
b = jumlah sel bakteri pada akhir fase log
t = waktu dalam jam atau menit antara B dan b

Gambar 6.1 Metode tidak langsung untuk menentukan waktu generasi

PERLENGKAPAN
Kultur
Kultur bakteri Escherichia coli yang berumur 10 hingga 12 jam dalam media Nutrien
Broth (NB). Kultur dapat dipertahankan dalam fase log dengan menyimpan dalam
pendingin, 100 ml NB dalam labu Erlenmeyer 250 ml, 35 buah tabung reaksi berisi 9
ml akuades steril, dan 500 ml NA (Nutrien Agar) dalam 5 botol.

Alat
Shaker inkubator, Spektrofotometer (Spectronic 20, Milton Roy), tabung cuvet, hand
taily counter, colony counter, dua puluh delapan cawan petri, pipet steril 1 ml dan 10
ml, gelas Beaker 1000 ml, Bunsen.

PROSEDUR
2. Bagilah ke 35 akuades steril 9 ml menjadi 7 set masing-masing 5. Beri label tiap
set sesuai dengan waktu inokulasi (t0, t30, t60, t90, t120, t150, t180) dan tiap set
beri label sesuai pengencerannya (10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6).
3. Beri label tujuh set cawan petri sesuai dengan waktu inokulasi, faktor pengenceran
yang dicawankan (10-4, 10-5, 10-6, 10-7) dan beri identitas Anda.

36
4. Cairkan ke 5 botol NA dalam water bath. Dinginkan dan pertahankan pada suhu
450C.
5. Dengan pipet steril, tambahkan 5 ml kultur E. coli yang masih pada fase log ke
dalam labu yang berisi 100 ml NB yang sudah dilabel inisial Anda. O.D. awal (t0)
harus berkisar antara 0.08 hingga 0.1 pada 610 nm. Cara penggunaan
spektrofotometer mengacu pada praktikum 8.
6. Setelah t0 O.D. ditentukan, vortex labu kultur dan secara aseptik pindahkan 1 ml
ke dalam akuades 9 ml yang berlabel 10-2 dan lanjutkan pada seri pengenceran
selanjutnya.
7. Letakkan labu kultur dalam shaker inkubator dan atur kecepatan 120 rpm pada
suhu kamar(30oC).
8. Cawankan pengenceran t0 pada cawan yang berlabel t0 seperti digambarkan pada
Gambar 9.3. secara aseptik tuang 15 ml media Nutrien Agar (NA) cair dalam
cawan dan goyangkan dengan gerakan memutar yang teratur.
9. Selanjutnya tiap 30 menit pindahkan secara aseptik 5 ml suspensi kultur dalam
kuvet dan ukur densitas optiknya. Juga pindahkan 1 ml suspensi kultur dalam
akuades yang berlabel 10-2 dan interval waktu yang sesuai, lakukan seri
pengenceran selengkapnya, dan cawankan dalam cawan petri sesuai labelnya.
10. Jika hasil pour plate dalam cawan petri telah memadat, inkubasikan dalam
inkubator selama 24 jam pada suhu 370C.

HASIL PENGAMATAN
1. Hitunglah sel-sel bakteri yang berhasil ditumbuhkan pada semua cawan!
2. Catatlah densitas optik dan hasil perhitungan jumlah sel ke dalam tabel berikut

Waktu Hitungan Cawan:

Densitas Optik Log jumlah
Inkubasi jumlah sel
@610 nm sel/ml
(menit) (CFU)/ml

3. Pada kertas semilog yang terlampir, plotkan:

a. Densitas optik pada ordinat dan waktu inkubasi pada absis
b. Log jumlah sel pada ordinat dan waktu inkubasi pada absis
(Pada kedua grafik, tariklah garis yang menghubungkan titik dari hasil
plot. Fase log digambarkan pada bagian garis yang lurus)
4. Hitunglah waktu generasi kultur tersebut dengan menggunakan metode
langsung dengan persamaan matematis dan metode tidak langsung dengan
membuat garis penghubung dari skala O.D pada kurva. Tuliskan
penghitungan anda dan catat waktu generasinya

Waktu Generasi
Metode langsung : ..........

37
 Metode tidak langsung : ..........

TUGAS DISKUSI
Petunjuk : jawablah pertanyaan –pertanyaan di bawah ini

1. Jelaskan apa saja yang terjadi pada kultur bakteri saat fase lag !

2. Sebutkan faktor-faktor yang menyebabkan terjadinya fase stasioner pada kultur

bakteri !

3. Jelaskan apa yang dimaksud dengan waktu generasi !

4. Bisakah waktu generasi dihitung dari fase apapun dari kurva pertumbuhan ?
Jelaskan !

5. Apakah waktu generasi merupakan parameter yang berguna untuk menunjukkan

tipe media apa yang terbaik untuk pertumbuhan suatu organisme spesifik?
Jelaskan !

38
 Praktikum 7

UJI FISIOLOGIS MIKROBA: UJI

FISIOLOGIS BAKTERI DAN IDENTIFIKASI
BAKTERI

TUJUAN
Mengamati secara langsung maupun tidak langsung produk kegiatan enzimatik
bakteri

PENDAHULUAN
Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa.
Karena itu, ciri fisiologis atau biokimia merupakan kriteria yang sangat penting dalam
identifikasi spesimen yang tak dikenal. Tanpa hasil pengamatan fisiologis yang
memadai mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidaklah
mungkin untuk dilakukan. Di dalam kegiatan ini, kita akan diperkenalkan pada
beberapa macam uji fisiologis sehingga dapat dipergunakan untuk mengidentifikasi
organisme tak dikenal dalam kegiatan berikutnya.
Enam dari 13 uji yang akan dilakukan merupakan reaksi biooksidasi, yaitu reaksi-
reaksi enzimatik yang berkaitan dengan respirasi dan fermentasi. Keenam uji tersebut
adalah fermentasi gula dalam tabung Durham, fermentasi asam campuran (uji metil
merah), fermentasi butanadiol (uji Voges Proskauer), produksi katalase, reduksi nitrat
dan uji oksidase. Tiga uji berikutnya yaitu hidrolisis triptofan (uji indol), hidrolisis
urea dan hidrolisis pati, merupakan reaksi hidrolisis yang disebabkan oleh enzim-
enzim ekstraseluler. Sedangkan uji-uji lainnya merupakan uji yang secara rutin juga
seringkali diperlukan untuk membantu usaha identifikasi

PERIODE I
BAHAN
Biakan dalam Trypticase Soy Broth (TSB) berumur 24 jam: Escherichia coli,
Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Bacillus
subtilis, Bacillus cereus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, dan
Streptococcus faecalis.
Biakan dalam agar miring Trypticase Soy Broth (TSB): Staphylococcus aureus.
1. Tabung Durham berisi kaldu glukosa dengan indikator merah fenol
2. Tabung medium MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer)
3. 3 tabung agar miring
4. 3 tabung kaldu tripton
5. 2 tabung kaldu nitrat
6. 1 cawan TSA
7. Hidrogen peroksida
8. Kertas plumbun asetat

39
 9. 1 tabung kaldu urea

PROSEDUR
1. Pada semua tabung dan cawan yang akan diinokulasi, bubuhkan nama anda,
nomor kegiatan, tanggal, serta nama organisme yang digunakan sebagai inokulum
2. Inokulasikan berbagai macam organisme pada media yang telah ditentukan seperti
terdaftar di bawah ini dengan memperhatikan beberapa catatan penting yang
disertakan di bawahnya:
E. coli : kaldu glukosa dalam tabung
medium MR – VP
agar miring sitrat simmons
kaldu tripton
kaldu nitrat
E. aerogenes : medium MR – VP
Agar miring sitrat simmons
Kaldu tripton
P. aeruginosa : cawan TSA
P. vulgaris : TSB
B.subtilis : cawan agar petri
3. Uji Koagulase
a. Gunakan biakan S. aerus dalam agar miring TSA
b. Letakkan setetes air pada kaca objek yang bersih. Secara aseptik,
pindahkanlah dengan lup inokulasi sedikit biakan S. aerus ke atasnya dan aduk
sampai memperoleh suspensi yang rata
c. Secara aseptik, pindahkanlah 2 lup penuh plasma kelinci ke atas suspensi
bakteri. Campurkanlah baik-baik
d. Bila orgsnisme tersebut koagulase positif, maka dalam waktu 5 – 15 detik
akan terlihat gumpalan-gumpalan fibrin. Catat hasil pengamatan anda
4. Uji Katalase
a. Gunakan biakan S. aerus dalam agar miring TSA
b. Letakkan 2 tetes hydrogen peroksida 3% pada kaca objek yang bersih. Secara
aseptik pindahkanlah dengan lup sedikit inokulasi biakan S. aerus ke atasnya
dan campurkanlah baik-baik
c. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen yang
menunjukkan bahwa organisme yang bersangkutan menghasilkan enzim
katalase yang mengubah hydrogen peroksida menjadi air dan oksigen.
Catatlah hasil pengamatan anda

PERIODE II
BAHAN
2 tabung reaksi berukuran 13 x 100 mm
Indikator metil merah
Reagen Barrit (larutan A dan B)
Reagen uji nitrit (larutan A dan B)
Debu seng (Zn)
Tusuk gigi
Reagen uji oksidase
Reagen kovac
Iodium gram

40
PROSEDUR
1. Uji Fermentasi Karbohidrat
Amati biakan dalam tabung Durham berisi kaldu glukosa dengan indikator merah
fenol. Bila warna medium berubah menjadi kuning, artinya bakteri tersebut
membentuk asam dari fermentasi glukosa. Bila pada tabung kecil yang diletakkan
terbalik di dalam tabung medium itu terdapat gelembung, artinya dari fermentasi
tersebut terbentuk pula gas. Catat hasil pengamatan anda.
2. Uji MR (Methyl Red = merah metil)
a. Ambillah 2 tabung bersih ukuran 13 x 100 mm
b. Ambil kedua biakan MR – VP anda. Tuangkan biakan tersebut masing-
masing setengahnya ke dalam tabung-tabung bersih itu. Jangan lupa memberi
tanda pada tabung sehingga tidak tertukar, simpanlah tanda untuk uji
berikutnya (uji VP)
c. Pada salah satu tabung MR – VP dari setiap organisme tambahkan 3 – 4 tetes
indikator merah metil. Bila warna medium berubah menjadi merah, artinya
terbentuk asam. Catat hasil pengamatan anda.
3. Uji VP (Voges-Proskauer)
Pada sisa biakan dalam medium MR – VP masing-masing organisme,
tambahkanlah reagen Barrit yaitu 10 tetes larutan A dan 10 tetes larutan B.
Kocoklah tabung keras-keras selama 20 – 30 detik. Bila terlihat warna merah
muda, artinya terjadi pembentukan 2,3 butanadiol atau reaksi Voges-Proskauer
positif. Kadang-kadang diperlukan waktu 2 jam untuk memperoleh hasil dari uji
ini. Catat hasil pengamatan anda.
4. Uji nitrit
a. Ambillah tabung-tabung biakan anda dalam kaldu nitrat
b. Tambahkan ke dalamnya masing-masing 2 – 3 tetes larutan A (asam
sulfanilat) dan 2 – 3 tetes larutan B (dimetil-α-naftilamin). Perhatian:
dimetil-α-naftilamin bersifat karsinogenik, karena itu jangan sampai mengenai
kulit anda
c. Bila dalam biakan yang diuji terdapat nitrit, maka segera terbentuk warna
merah, artinya uji ini positif
d. Bila tidak terlihat perubahan warna, dengan menggunakan tusuk gigi
tambahkanlah sedikit debu seng ke dalam tabung biakan. Bila terbentuk
warna merah artinya uji tersebut negatif, sedangkan bila tidak terjadi
perubahan warna, artinya uji tersebut positif
5. Uji oksidase
a. Ambilah biakan P. aeruginosa dalam cawan TSA anda
b. Genangi beberapa koloni bakteri dalam cawan tersebut dengan reagen uji
oksidase (larutan dimetil-p-fenildiaminahidroklorida 1%)
c. Uji positif ditandai dengan berubahnya koloni menjadi merah muda, lalu
merah tua, merah gelap, akhirnya hitam

41
6. Uji indol
a. Ambillah biakan anda dalam TSB
b. Tambahkan ke dalamnya masing-masing 10 – 12 tetes reagen Kovac. Bila
dalam biakan tersebut terdapat indol, maka di bagian atas biakan akan segera
terbentuk lapisan warna merah. Catatlah hasil pengamatan anda
7. Uji hidrolisis urea
Amatilah tabung biakan kaldu urea anda. Uji positif ditunjukkan oleh
terbentuknya warna merah keunguan setelah inkubasi. Catat hasil pengamatan
anda
8. Uji hidrolisis pati
Ambillah cawan petri anda. Genangi seluruh permukaan agar dengan iodium
gram. Uji positif ditandai dengan tampaknya area jernih di sekitar pertumbuhan
organisme yang anda goreskan. Catatlah hasil pengamatan anda
9. Uji hydrogen sulfida
Amatilah tabung biakan TSB yang disisipi kertas plumbum asetat. Bila pada
kertas tersebut tampak warna hitam, artinya uji tersebut positif. Catat hasil
pengamatan anda
10. Uji penggunaan sitrat
Amatilah biakan agar miring sitrat simmons anda, apakah ada perubahan warna
dan apakah ada pertumbuhan. Catatlah hasil pengamatan anda
11. Uji hemolisis darah
Pada setiap cawan darah, amatilah area di sekitar koloni atau pertumbuhan. Bila
area tersebut jernih, artinya terjadi hemolisis sel-sel darah secara lengkap

42
 Praktikum 8

ANALISIS MIKROBA AIR: UJI

MIKROBIOLOGI AIR

TUJUAN
Praktikum ini dimaksudkan untuk mengajarkan mahasiswa :
1. Prosedur uji bakteriologik air.
2. Mencari nilai MPN coliform dan TPC bakteri coli pada sampel air
3. Cara mengisolasi bakteri Escherichia coli dari sampel air.

PENDAHULUAN
Air yang kita gunakan untuk keperluan sehari-hari, mengandung berbagai jenis
mikroba (patogen dan non patogen) di dalamnya. Seiring dengan berkembangnya
industri, penduduk dan meluasnya areal pemukiman, ketersedian akan air bersih yang
layak diminum semakin langkah. Salah satu hal yang perlu diperhatikan dalam
menilai kelayakan / kualitas air untuk menjadi air minum adalah jenis bakteri yang
terkandung di dalamnya.
Pemakaian air sungai sebagai air minum masih aman digunakan asalkan
mikroorganisme (bakteri) yang terkandung di dalamnya tidak bersifat patogen. Air
minum yang tercemar oleh kuman dapat menyebabkan wabah penyakit usus.
Ditemukannya kuman-kuman patogen dari air minum, misalnya Salmonella tiphy,
Shigella dysentriae, Vibrio cholera, Escherichia coli merupakan bukti langsung
bahwa air minum sudah tercemar kotoran manusia. Salah satu metode pencegahan
yang dapat dilakukan adalah dengan monitoring kualitas air secara mikrobiologik
sebelum dijadikan sebagai sumber air minum.
Keberadaan kuman-kuman patogen dalam sampel air umumnya dalam jumlah
kecil dan karena sukarnya teknik pengisolasian, maka pemeriksaan baktriologik air
minum untuk mengetahui keberadaan kuman patogen menjadi tidak praktis. Selain
itu, analisis air tidak memungkinkan dapat menentukan semua jenis kuman patogen.
Oleh karena itu, dilakukan suatu pendekatan dengan melakukan pemeriksaan
bateriologis terhadap keberadaan kuman komensal usus manusia, yaitu bakteri koli
(koli fekal dan non fekal) utamanya bakteri Escherichia coli (E. coli) sebagai
indikator terjadinya pencemaran fekal. Digunakannya E. coli sebagai indikator
kualitas air disebabkan, E. coli hidup di usus manusia dan hewan dan keluar dari tinja,
sehingga keberadaannya di air memperingatkan tentang kemungkinan adanya patogen
lain yang berasal dari usus atau sistem pencernaan hewan dan manusia. Selain itu E.
coli juga dapat memfermentasikan laktosa dengan membentuk gas pada suhu kamar,
sehingga untuk uji bakteriologik air merupakan indikator yang terpercaya.

Pemeriksaan bakteriologik air terdiri dari :

Pemeriksaan kuantitatif, yaitu untuk menentukan atau mendeteksi bakteri koli
dalam air, terdiri dari tiga tahap yaitu:
a. Uji pendugaan (presumtive test)
Uji ini dilakukan untuk menduga keberadaan bakteri koli dalam suatu sampel
air. Uji dilakukan dalam medium fermentasi kaldu laktosa (laktosa broth) yang

43
 berisi tabung Durham. Uji dinyatakan positif bila terbentuk gas pada tabung
Durham, karena bakteri koli mampu memfermentasikan laktosa dengan
menghasilkan gas yang merupakan ciri khasnya. Uji pendugaan dapat
menunjukkan kuantitas mikroorganisme koli yang merupakan jumlah
perkiraan terdekat (MPN : Most Probable Number). MPN didapatkan dengan
menghitung jumlah tabung positif dari tiap seri setelah 24 jam inkubasi pada
suhu 37 C. Jumlah tabung tersebut dicocokkan dengan tabel MPN yang
sesuai dengan jumlah seri tabung yang digunakan (misal MPN 3-3-3 atau
MPN 5-5-5) untuk mengetahui nilai MPN.

b. Uji penegasan / penentu (confirmed test)

Konfirmasi dari uji pendugaan perlu dilakukan, karena nilai positif (gas) dari
uji pertama dapat juga merupakan reaksi dari bakteri non koli yang bukan
indikator pencemar fekal. Uji penentu memerlukan medium selektif atau
diferensial, misalnya BGLB (Brilliant Green Lactose Broth) dengan
dilengkapi tabung Durham, EMB (Eosin Metylen Blue) atau endo agar.
Umumnya digunakan BGLB dengan tabung Durham karena diketahui ox-bile
dan brillian green dalan BGLB mampu menghambat pertumbuhan bakteri
gram positif yang termasuk memfermentasikan laktosa seperti Clostridia.
Syarat uji bernilai positif sama dengan uji pendugaan. Bila pada tahap ini di
dalam kultur uji masih terbentuk gas, maka sampel air dinyatakan tidak layak
minum.

c. Uji pelengkap (completed test)

Uji ini merupakan analisis akhir dari sampel air untuk mendeteksi keberadaan
bakteri koli fekal. Metode yang digunakan adalah pengecatan Gram terhadap
bakteri yang muncul / tumbuh pada media EMB agar pada uji penentu. Bila
karakter koloni berwarna hijau metalik dan hasil pengamatan dengan
mikroskop menunjukkan bakteri berbentuk batang Gram negatif, artinya
bakteri tersebut adalah E. coli dan uji pelengkap bernilai positif.

a. Pemeriksaan kualitatif, yaitu untuk menentukan total mikroba yang terdapat dalam
sampel air yang umumnya menggunakan media kaldu agar. Adapun untuk
melindungi dan mencegah masyarakat terhadap bahaya penyakit yang bersumber
dari air, maka WHO dan menteri kesehatan RI menetapkan baku mutu air minum
sebagai berikut::

Baku mutu WHO Menkes RI

MPN coliform 0/100 ml air 0/100 ml air
MPN E.coli 0/100 ml air 0/100 ml air
TPC 100 kuman/ml air 200 kuman/ml air

PERLENGKAPAN
Bahan
Media cair laktosa (laktose broth), medium cair BGLB, media agar EMB, media agar
Salmonella Shigella Agar (SSA), agar kadu (NA) dan sampel air (air kemasan, air
PAM dan sungai).

44
Alat
Tabung reaksi, tabung Durham, Cawan petri, labu Erlenmeyer, pipet ukur, dan
Bunsen.

PROSEDUR
A. Pemeriksaan kuantitatif

1. Uji pendugaan dengan metode 3-3-3

Metode ini menggunakan 3 kelompok tabung. Masing-masing kelompok
terdiri dari 3 tabung dan tiap-tiap tabung reaksi pada kelompok satu, dua dan
tiga berturut-turut berisi 10, 5, 5 ml medium kaldu laktosa dan tabung Durham
yang telah dalam keadaan steril. Kemudian pada tiap-tiap tabung kelompok
satu, dua dan tiga ditambahkan 10, 1, 0, 1 ml sampel air uji secara aseptik
menggunakan pipet ukur. Selanjutnya semua tabung reaksi diinkubasi pada
suhu kamar (37 C) selama 24 jam. Bila tidak terdapat cukup gas (<10 %)
dalam tabung Durham, maka sebaiknya inkubasi dilanjutkan sampai 24 jam
kemudian (total 48 jam inkubasi). Bila dalam 24 jam dinyatakan jumlah gas
yang berada di tabung Durham cukup (10 %), maka uji presumtif dinyatakan
diduga positif. Catatlah banyaknya tabung reaksi pada masing-masing
kelompok yang bernilai positif, gunakan tabel Mc Crady untuk mengetahui
nilai MPN kuman coliform tiap 100 ml sampel air uji.

2. Uji penegasan / penentu

Biakan dalam tabung reaksi yang bernilai positif pada masing-masing
kelompok ditanam kembali pada tabung reaksi yang berisi medium cair BGLB
yang didalamnay dilengkapi tabung Durham. Volume medium dan biakan
yang ditambahkan sesuai dengan kelompok asal uji presumtif. Kemudian
diinkubasi 24 jam pada suhu kamar (37 C). Bila terdapat gelembung gas
dinyatakan uji penegas positifdan dianggap mengandung E. coli. Catatlah
banyaknya tabung reaksi yang bernilai penegas positif dari masing-masing
kelompoknya. Gunakan tabel Mc Crady untuk mengetanui nilai MPN kuman
E. coli tiap 100 ml sampel air uji.

3. Uji pelengkap
Biakan dalam tabung yang bernilai uji penegas positif di tanam secara gores
(streak method) pada media EMB. Kemudian diinkubasi pada suhu kamar
(37 C) selama 48 jam. Setelah itu dilakukan pengecatan Gram terhadap
koloni yang muncul / tumbuh. Uji lengkap bernilai positif bilai koloni yang
muncul berwarna hijau metalik dan hasil pengecatan Gram melalui
pengamatan mikroskop diketahui bakteri berbentuk batang Gram negatif. Jika
uji lengkap bernilai positif, maka dapat dipastikan bakteri tersebut adalah
Escherichia coli.

B. Pemeriksaan kualitatif
Metode yang digunakan adalah TPC (total plate count). 1 ml sampel air yang tidak
diencerkan di tanam menggunakan metode cawan tuang dengan media kaldu agar
untuk mengetahui total bakteri dalam sampel air uji dan media SSA untuk
mengetahui keberadaan bakteri Salmonella dan Shigella dalam sampel air uji.

45
Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar ((37 C). Koloni yang
muncul dihitung populasinya dan bila jumlah koloni lebih dari 300 koloni, maka
digunakan quebec colony counter sebagai alat bantu menghitung. Jumlah koloni
yang telah ditemukan adalah jumlah bakteri per ml sampel air uji.

46
47
 Praktikum 9

BIOMONITORING PENCEMARAN
PERAIRAN
TUJUAN
Melakukan pemantauan perairan pantai dengan menggunakan indikator
biologis yaitu bakteri.

PENDAHULUAN
Air adalah materi esensial di dalam kehidupan. Tidak ada satupun makhluk
hidup di dunia ini yang tidak membutuhkan air. Sebagai contoh sel hidup baik pada
hewan maupun tumbuhan sebagian besar tersusun oleh air. Selain itu air juga
menyediakan habitat bagi berbagai jenis organisme baik makro maupun mikro.
Air rentan tercemar dan merupakan substrat yang paling parah akibat
pencemaran. Berbagai jenis pencemaran air dapat berasal dari:
- Sumber domestik  rumah tangga, perkampungan, pasar, kota, dan
sebagainya.
- Sumber non-domestik  pabrik, industri, pertanian, peternakan, perikanan,
serta sumber-sumber lainnya.
Secara langsung ataupun tidak langsung, sumber pencemaran tersebut akan
berpengaruh terhadap kualitas air, baik untuk keperluan air minum, air industri atau
keperluan lainnya. Karena itu, sangat penting dilakukan pemantauan terhadap kondisi
perairan guna mengantisipasi pencemaran air yang lebih parah.
Pemantauan biologis atau biomonitoring merupakan pengukuran dan evaluasi
kondisi sistem kehidupan (biota). Hasil kegiatan tersebut merupakan parameter yang
dapat memberikan gambaran kondisi sistem biologis, dari tingkat individu sampai
ekosistem, dan juga landscape (abiotik), terutama akibat aktivitas manusia.
Biomonitoring merupakan “alat” untuk mempelajari dinamika suatu
ekosistem, baik secara meruang maupun mewaktu, sebagai usaha melindungi
ekosistem dan kepentingan manusia. Kegiatan pemantauan tersebut dapat dilakuakan
dengan menggunakan parameter fisik, kimiawi, dan biologis. Usaha pemantauan
secara fisik dan kimiawi, relative lebih mudah dan cepat diketahui, tetapi kurang
memberikan keakuratan mengenai kondisi atau masalah ekosistem yang sebenarnya.
Penggunaan organisme dalam pemantauan tersebut (biomonitoring) mempunyai
kelebihan dibandingkan jenis pemantauan yang lain, yaitu organisme perairan tertentu
dapat memberikan respon biologis, dari tingkat molekuler sampai komunitas,
terhadap perubahan yang terjadi dalam ekosistem.
Salah satu indikator biologis yang dapat digunakan adalah dengan
menggunakan bakteri. Berbagai jenis mikroorganisme dapat ditemukan di berbagai
perairan. Pada perairan murni dapat ditemukan bakteri belerang, bakteri besi, bentuk
spiral, berpigmen, atau tidak berpigmen dan beberapa pembentuk spora. Untuk
perairan yang berhubungan dengan tanah banyak ditemukan jenis Bacillus.
Mikroorganisme tersebut merupakan flora mikroorganisme air. Sedangkan untuk
perairan yang tercemar banyak ditemukan bakteri patogen.

48
 Untuk pemantauan biomonitoring ini dapat dilakukan dengan mengetahui atau
menghitung keberadaan bakteri patogen, bakteri halotoleran, dan heterotrofik,
menghitung MPN bakteri koli fekal, dan menghitung MPN bakteri minyak.

PERLENGKAPAN
Alat:
- Timbangan analitik
- Erlenmeyer
- Pengaduk
- Kompor listrik
- Autoclave
- Cawan petri
- Tabung reaksi+rak
- Alat vortex
- Bunsen dan korek api
- Pipet volume
- Gelas ukur
- Tabung Durham
- Ose
- Kapas
- Aluminium foil
- Selotip

Bahan:
- Sampel air laut (pantai Kenjeran)
- Mengetahui keberadaan bakteri patogen menggunakan media:
 SSA untuk menumbuhkan bakteri Salmonella dan Shigella
 EMB agar untuk menumbuhkan bakteri Escherichia coli
 TCBS untuk menumbuhkan bakteri Vibrio cholera dan Vibrio
parahaemolitycus
- Menghitung TCP bakteri halotoleran dan heterotrofik menggunakan media:
 NA untuk menumbuhkan bakteri heterotrofik
 Marine agar untuk menumbuhkan bakteri halotoleran
- Menghitung MPN bakteri koli fekal dengan media:
 LB untuk uji penduga
 BGLB untuk uji penentu
 EMB untuk uji pelengkap
- Menghitung MPN bakteri minyak menggunakan:
 Yeast Ekstrak = 0,1 g/100 ml
 K2HPO4 = 0,05 g/100 ml
 MgSO4 = 0,02 g/100 ml
- Minyak tanah
- Akuades steril
- Alkohol 70%

PROSEDUR
1. UJI KEBERADAAN BAKTERI PATOGEN
a. Buatlah media EMB agar, TCBS agar, dan SSA, dengan melarutkan media
dalam aquades dan memanaskannya hingga mendidih.

49
 b. Sterilisasi media EMB agar dengan autoclave pada 121°C selama 15
menit, sedangkan untuk media TCBS agar dan SSA tidak perlu disterilisasi
autoclave.
c. Inokulasikan sampel air laut sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri steril dan
tambahkan media secukupnya kemudian homogenkan (duplo).
d. Inkubasi biakan selama 24 jam, kemudian amati bentuk morfologinya.

2. PENGHITUNGAN Total Plate Count (TPC) BAKTERI

HALOTOLERAN DAN HETEROTROFIK
a. Buatlah media NA dan Marine agar, dengan melarutkan masing-masing
media dalam aquades sesuai dengan etiket dan memanaskan hingga
mendidih. Kemudian autoclave selama 15 menit.
b. Lakukan pengenceran berseri sampel air dari 101 sampai 108 kali
c. Inokulasikan sampel air pada seri pengenceran 106, 107, dan 108 dengan
mengambil 1 ml sampel dan masukkan ke dalam cawan petri, lalu
tambahkan media dan homogenkan (duplo).
d. Inkubasi biakan selama 24 jam dalam suhu kamar. Kemudian hitung
koloni bakteri yang tumbuh pada kedua jenis media tersebut.

3. PENGHITUNGAN MPN BAKTERI KOLI FEKAL

a. Uji Pendugaan
 Buatlah media Lactose Broth dengan melarutkan media dalam
aquades sesuai dengan etiket.
 Masukkan media ke dalam 15 tabung reaksi dengan volume
masing-masing tabung 7 ml.
 Masukkan tabung Durham ke dalam masing-masing tabung reaksi
dan atur supaya tidak terdapat gelembung udara di dalam tabung
Durham.
 Sterilisasi media dengan autoclave pada 121°C selama 15 menit.
 Encerkan sampel air sebanyak 10 kali dalam 90 ml aquades steril
kemudian homogenkan.
 Ambil 10 ml sampel yang telah diencerkan dan masukkan ke dalam
5 tabung pertama yang telah berisi media dan tabung Durham.
 Ambil 1 ml sampel yang telah diencerkan dan masukkan ke dalam
5 tabung kedua yang telah berisi media dan tabung Durham.
 Ambil 0,1 ml sampel yang telah diencerkan dan masukkan ke
dalam 5 tabung ketiga yang telah berisi media dan tabung Durham.
 Inkubasi ke 15 tabung dalam oven pada suhu 44,5°C selama 24
jam.
 Catat hasil positif pada tabung, yang ditunjukkan dengan adanya
gelembung udara pada tabung Durham.

50
 b. Uji Penentu
 Buatlah media BGLB Broth (Brilliant Green Lactosa Bile Broth)
dengan melarutkan 4 gram media ke dalam 100 ml aquades.
 Masukkan media ke dalam tabung reaksi (sesuai dengan jumlah
tabung yang menunjukkan hasil positif pada uji penduga), dengan
volume masing-masing tabung 7 ml.
 Masukkan tabung Durham ke dalam masing-masing tabung dan
atur agar dalam tabung Durham tidak terbentuk gelembung udara.
 Sterilisasi media dengan autoclave pada 121°C selama 15 menit.
 Dari tabung pada uji penduga yang menunjukkan uji positif, ambil
suspensinya sekitar 1 ml dan masukkan dalam tabung uji penentu
yang berisi media BGLB Broth dan homogenkan.
 Inkubasi bakteri oven pada suhu 44,5°C selama 24 jam.
 Catat hasil positif pada tabung yang ditunjukkan dengan adanya
gelembung udara pada tabung Durham.

c. Uji Pelengkap
 Buatlah media EMB agar dan sterilkan media dengan autoclave
pada 121°C selama 15 menit.
 Tuang media EMB agar dalam tiga buah cawan Petri.
 Bagi ketiga cawan petri yang berisi media EMB dengan spidol di
bagian belakang cawan Petri menjadi lima bagian.
 Inokulasikan bakteri dari tabung yang menunjukkan hasil positif
pada satu bagian dari media dalam cawan Petri dengan cara
gores/streak.
 Inkubasi bakteri pada suhu 44,5°C.
 Catatlah hasil positif pada tiap bagian, yang ditunjukkan adanya
koloni berwarna hijau metalik.

4. PENGHITUNGAN MPN BAKTERI MINYAK

a. Buatlah media dengan melarukan yeast ekstrak (0,1 gr/100 ml), K 2HPO4
(0.05 gr/100 ml) dan MgSO4 (0.02 gr/100 ml) dan memanaskannya.
b. Masukkan media yang telah dibuat ke dalam 15 tabung reaksi ( tanpa
tabung Durham) masing-masing 7 ml media dan sterilisasikan dengan
autoclave pada 121°C selama 15 menit.
c. Uji sampel dengan memasukkan sampel air laut sebanyak 5 ml pada lima
tabung pertama, 1 ml pada lima tabung kedua, dan 0.1 ml pada lima
tabung ketiga.
d. Masukkan minyak sebanyak 2 ml ke dalam tiap-tiap tabung.
e. Inkubasi selama 5 hari pada suhu kamar. Amati ada atau tidaknya lapisan
putih antara minyak dan media sebagai hasil positif.

51
TABEL HASIL PENGAMATAN

Tabel 9.1. Uji Keberadaan bakteri patogen

Karakteristik koloni bakteri
Media Bakteri
Warna Bentuk Ukuran Tepi Elevasi
EMB agar
TCBS agar
SSA

Tabel 9.2. Perhitungan TPC bakteri halotoleran dan heterotrofik

Jumlah
Karakter
Media Pengenceran koloni yang CFU/ml Pembahasan
koloni
tumbuh
MA 10-4
10-5
NA 10-4
10-5

Tabel 9.3. penghitungan MPN bakteri koli fekal

Hasil pengamatan
Uji Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Penduga
Penentu
Pelengkap

Tabel 9.4. Penghitungan MPN bakteri minyak

Hasil pengamatan
Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

52
 Praktikum 10

ANALISIS MIKROBA UDARA

TUJUAN
Praktikum ini dimaksudkan untuk mengajarkan mahasiswa tentang:
1. Metode isolasi mikroba dari udara
2. Teknik analisis mikroba udara

PENDAHULUAN

Selain gas, partikel debu dan uap air, udara juga mengandung
mikroorganisme. Di udara terdapat sel vegetatif dan spora bakteri, jamur dan
ganggang, virus dan kista protozoa. Selama udara terkena sinar matahari, udara
tersebut akan bersuhu tinggi dan berkurang kelembabannya. Selain mikroba yang
mempunyai mekanisme untuk dapat toleran pada kondisi ini, kebanyakan mikroba
akan mati.
Udara terutama merupakan media penyebaran bagi mikroorganisme. Mereka
terdapat dalam jumlah yang relatif kecil bila dibandingkan dengan di air atau di tanah.
Mikroba udara dapat dipelajari dalam dua bagian, yaitu mikroba di luar ruangan dan
di dalam ruangan.

Sumber Mikroorganisme Di Udara

Meskipun terdapat mikroorganisme di udara, belum ditemukan mikroba yang
berhabitat asli dari udara. Udara bukanlah lingkungan alami bagi mikroorganisme
karena tidak mengandung cukup air dan nutrisi untuk mendukung pertumbuhan dan
reproduksinya.
Salah satu sumber mikroba udara yang paling umum adalah mikroba yang
berasal dari tanah. Mikroorganisme tanah dibebaskan ke udara ketika terganggu oleh
pukulan angin, dan tetap tersuspensi di sana untuk jangka waktu yang panjang.
Tindakan manusia seperti menggali atau membajak tanah juga dapat melepaskan
mikroba ke udara. Demikian pula mikroorganisme yang ditemukan dalam air,
mungkin juga dilepaskan ke udara dalam bentuk tetesan air atau aerosol. Percikan air
oleh angin juga bisa menghasilkan tetesan atau aerosol. Angin dapat membawa
mikroorganisme dari bagian permukaan tanaman atau hewan ke udara. Mikroba ini
dapat berupa komensal atau patogen tanaman atau hewan yang ditempelinya. Studi
menunjukkan bahwa mikroorganisme patogen tanaman mampu tersebar pada jarak
yang sangat jauh melalui udara. Sebagai contoh, spora Puccinia graminis dapat
tersebar pada jarak lebih dari seribu kilometer dari tempat asalnya.
Sumber utama dari mikroorganisme udara adalah manusia dan makhluk hidup
lain. Pada manusia, bagian permukaan tubuh (kulit) dapat merupakan “gudang”
mikroba yang sewaktu-waktu dapat tersebar ke udara. Demikian pula, mikroba
komensal maupun patogen pada saluran pernapasan atas dan mulut terus-menerus
dibuang ke udara dengan aktivitas seperti batuk, bersin, berbicara dan tertawa.

53
Distribusi Mikroba di Udara
Belum ada mikroba yang habitat aslinya di udara. Mikrooganisme di udara
dibagi menjadi 2, yaitu mikroorganisme udara di luar ruangan dan mikroorganisme
udara di dalam ruangan. Mikroba paling banyak ditemukan di dalam ruangan.

1. Mikroba Di Luar Ruangan

Mikroba yang ada di udara berasal dari habitat perairan maupun terestrial.
Mikroba di udara pada ketinggian 300-1,000 kaki atau lebih dari permukaan bumi
adalah organisme tanah yang melekat pada fragmen daun kering, jerami, atau partikel
debu yang tertiup angin. Mikroba tanah masih dapat ditemukan di udara permukaan
laut sampai sejauh 400 mil dari pantai pada ketinggian sampai 10.000 kaki. Mikroba
yang paling banyak ditemukan yaitu spora jamur, terutama Alternaria, Penicillium,
dan Aspergillus. Mereka dapat ditemukan baik di daerah kutub maupun tropis.
Mikroba yang ditemukan di udara di atas pemukiman penduduk di bawah ketinggian
500 kaki yaitu spora Bacillus dan Clostridium, yeast, fragmen dari miselium, spora
fungi, serbuk sari, kista protozoa, alga, Micrococcus, dan Corynebacterium, dll.

2. Mikroba Di Dalam Ruangan

Dalam debu dan udara di sekolah dan bangsal rumah sakit atau kamar orang
menderita penyakit menular, telah ditemukan mikroba seperti bakteri tuberkulum,
streptokokus, pneumokokus, dan staphylokokus. Bakteri ini tersebar di udara melalui
batuk, bersin, berbicara dan tertawa. Pada proses tersebut ikut keluar cairan saliva dan
mukus yang mengandung mikroba. Virus dari saluran pernapasan dan beberapa
saluran usus juga ditularkan melalui debu dan udara. Patogen dalam debu terutama
berasal dari objek yang terkontaminasi cairan yang mengandung patogen. Tetesan
cairan(aerosol) biasanya dibentuk oleh bersin, batuk dan berbicara. Setiap tetesan
terdiri dari air liur dan lendir yang dapat berisi ribuan mikroba. Diperkirakan bahwa
jumlah bakteri dalam satu kali bersin berkisar antara 10.000 sampai 100.000.
Banyak patogen tanaman juga diangkut dari satu tempat ke tempat lain
melalui udara dan penyebaran penyakit jamur pada tanaman dapat diprediksi dengan
mengukur konsentrasi spora jamur di udara.
Mikroorganisme Udara Di Rumah Sakit, Meskipun rumah sakit adalah tempat
pengobatan berbagai penyakit, ada kasus dimana penyakit menular tambahan diderita
pasien pada saat rawat inap. Udara di dalam rumah sakit dapat bertindak sebagai
reservoir mikroorganisme patogen yang ditularkan oleh pasien. Infeksi yang diperoleh
selama perawatan di rumah sakit tersebut disebut infeksi nosokomial dan patogen
yang terlibat disebut sebagai patogen nosokomial. Infeksi, diwujudkan oleh gejala
terkait, setelah tiga hari dirawat di rumah sakit bisa dianggap sebagai infeksi
nosokomial (Gleckman & Hibert, 1982 dan Bonten & Stobberingh, 1995).
Infeksi nosokomial yang banyak ditemukan yaitu berasal dari Haemophilus
influenzae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, anggota Enterobacteriaceae dan virus pernafasan.

54
PERLENGKAPAN
1. Vacum cleaner (penyedot udara)
2. Cawan petri
3. Pipet
4. Tabung reaksi
5. Botol
6. Kasa steril
7. Kapas
8. Aquades
9. NA
10. Pewarna Gram
11. Aluminium foil

PROSEDUR
Metode I
1. Siapkan dua kasa steril, lalu celupkan kasa pada 5-10 ml aquades di cawan petri,
2. Letakkan kasa pada saringan vacum cleaner dengan posisi melintang, seperti
gambar di samping

3. Sedot udara selama 5 menit (luas ruangan ± 3x3m 2, jika luas ruangan lebih luas
atau lebih sempit waktu pengambilan dikonversikan sesuai luas ruangan),
pengambilan udara secara horizontal dengan memutar ruangan dan berhenti pada
titik awal putaran (mencatat waktu sebelum dan sesudah pengambilan),
4. Ambil kasa dengan pipet steril dan masukkan kasa dalam botol steril yang berisi
larutan garam fisiologis,
5. Tutup botol dengan kapas dan alumunium foil,
6. Lakukan pengenceran dengan mengambil 1 ml sampel ke dalam 9 ml aquades (10-
1
). Lanjutkan ke pengenceran 10-2 dan 10-3
7. Hasil pengenceran terakhir (10-3), diinokulasikan ke dalam NA secara pourplate
diinkubasi selama 7 hari.
8. Hitung dan identifikasi koloni yang tumbuh pada media NA.
9. Lakukan pewarnaan gram dan karakterisasi secara mikroskopis

Metode II
1. Siapkan cawan petri yang telah berisi media NA dan PDA. Khusus untuk PDA,
media telah ditambahkan larutan chlorampenicol 1% sebanyak 1 ml.
2. Letakkan cawan yang berisi media tersebut pada tiap sudut ruangan yang akan
dianalisis mikrobanya pada ketinggian 1 meter di atas lantai ruangan.
3. Cawan petri dibiarkan dalam posisi terbuka (tanpa tutup) selama lebih kurang 30
menit
4. Tutuplah cawan tersebut, inkubasi 24 jam (untuk pengamatan bakteri), dan 7 hari
untuk pengamatan kapang.
5. Isolasi dan karakterisasi mikroba yang tumbuh pada kedua jenis media.

55
 Praktikum 11

ISOLASI DAN KARAKTERISTIK MIKROBA

TANAH: MENGHITUNG POPULASI
MIKROBA TANAH

TUJUAN
Praktikum ini dimaksudkan untuk mengajarkan mahasiswa tentang:
1. Prosedur uji mikroba tanah (Bakteri, Yeast, Mold)
2. Mencari nilai TPC pada sampel tanah
3. Cara mengisolasi mikroba dari sampel tanah

PENDAHULUAN
Kesuburan tanah tidak hanya tergantung pada komposisi kimiawinya,
melainkan pada ciri alamiah mikroorganisme yang menghuninya (Rao, 2007). Tanah
mengandung bermacam-macam mikroorganisme. Selain banyak terdapat bakteri, ada
juga protozoa, yeast/khamir, mold/jamur, alga dan cacing yang berukuran
mikroskopik dalam jumlah yang tidak terhitung. Jenis yang mendominasi akan
tergantung pada komposisi tanah, kelembapan, pH dan faktor lingkungan terkait
lainnya (Anderson, 1974).

PERLENGKAPAN
Bahan:
Medium Nutrient Agar (NA), Medium Potato Dextrose Agar (PDA), sampel tanah,
klorafemnikol, aquadea

Alat:
Botol steril, vortex, pipet ukur, tabung reaksi, cawan petri, bunsen, inkubator

PROSEDUR
1. Menyiapkan medium NA dan medium PDA. Pada medium PDA ditambahkan
kloramfenikol untuk menghindari tumbuhnya bakteri
2. Mengambil sampel tanah pada kedalaman 15 cm, sebanyak 10 gr dari lokasi yang
ingin diuji. Sampel disimpan dalam botol steril
3. Menambahkan aquades sebanyak 90 ml ke dalam botol steril berisi sampel tanah
yang akan diuji. Kemudian dilakukan homogenasi dengan cara divortek atau
dikocok. Sampel yang sudah dihomogenkan, didiamkan selama lebih kurang 10
menit. Selanjutnya diambil supernatannya sebanyak 1 ml dan dilakukan
pengenceran bertingkat sampai dengan 10-7
4. Hasil pengenceran di-pour plate ke dalam medium yang sudah disiapkan.
Pengenceran yang digunakan adalah 10-2, 10-3, 10-4 untuk tanah normal, sedangkan
untuk tanah subur digunakan pengenceran 10-4, 10-5, 10-6

56
5. Pengamatan dilakukan setelah masa inkubasi 24 jam, 48 jam, dst. sesuai dengan
masa inkubasi jenis mikroorganisme yang ingin diamati
Praktikum 12

SKRINING MIKROBA POTENSIAL

TUJUAN
Praktikum ini dimaksudkan untuk mengajarkan mahasiswa tentang prosedur skrining
mikroba amilolitik, lipolitik, proteolitik dan selulolitik.

PENDAHULUAN
Penggunaan mikroba untuk upaya bioremediasi limbah membutuhkan upaya
eksplorasi mikroba potensial pendegradasi senyawa penyusun limbah. Hal-hal yang
perlu diperhatikan dalam eksplorasi mikroba potensial adalah sebagai berikut:
1. Pemahaman tentang karakteristik morfologis dan fidiologis mikroba diperlukan
dalam isolasi mikroba.
2. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba.
3. Kesabaran, ketelitian, dan kemampuan dalam mengenal karakteristik koloni
mikroba yang tumbuh saat skrining awal sangat membantu untuk menguranngi
jumlah uji lanjut yang sering digunakan untuk mengukur aktivitas dari masing-
masing isolate tunggal yang didapatkan.
4. Metode penyimpanan stok isolate mikroba juga harus menjadi perhatian penting
untuk tetap mempertahankan atau menghambat penurunan kemampuan
degradasinya.
Perlu diketahui bahwa jenis-jenis mikroba yang telah diketahui mempunytai
peranan penting dalam proses biodegradasi lingkungan dari pencemaran utamanya
dari golongan bakteri, khamir, dan kapang. Macam-macam mikroba potensial tersebut
adalah mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik, dan selulolitik.
Berikut ini adalah gambaran tentang uji amilolitik, proteolitik, lipolitik, dan
selulolitik:
1. Uji Amilolitik
Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas
polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik.
Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis
menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa.

57
Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk
ke dalam sel. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Amilum akan
bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media.
Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi
pati digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum akan
bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada
media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada
amilum yang berbentuk spiral.

Pada uji amilolitik, hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling
koloni, sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam.

58
2. Uji Lipolitik
Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah
mikroorganisma. Untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan enzim
lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak.
Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase
diantaranya adalah dengan menggunakan media Trybutirin Agar, Rodhamine Agar
dan Spirit Blue Agar. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator
yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis
lemak.

Pada uji lipolitik, reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning di

sekeliling koloni, sedangkan reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap
berwarna merah.

3. Uji proteolitik
Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam
bentuk kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan
monomernya berupa asam amino. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis.

59
 Pada uji proteolitik, aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone
jernih di sekeliling koloni.

4. Uji Selulolitik
Enzim selulolitik adalah enzim yang mengkatalisis pemutusan ikatan (3- 1,4
glikosidik molekul selulosa dan turunannya. Ada beberapa macam enzim selulolitik
diantaranya aviselase, CMCase dan selulase dan dihasilkan oleh mikroba selulolitik
yang hidup di alam, baik secara bebas maupun di dalam tubuh hewan. Beberapa
publikasi menunjukkan bahwa mikroba pengurai selulosa dapat menguraikan turunan
selulosa, sedangkan pengurai turunan selulosa belum tentu dapat menguraikan
selulosa. Untuk mengisolasi mikroba selulolitik, umumnya selulosa digunakan
sebagai sumber karbon dan bukan turunan selulosa, namun belum dijelaskan turunan
selulosa mana yang dimaksud.
Menurut literatur, enzim selulolitik yang dihasilkan oleh satu jenis mikroba
disandi oleh gen-gen yang berbeda, baik dalam hal jumlah pasangan basa maupun
urutan nukleotidanya. Di samping itu, ekspresi gen penyandi enzim selulolitik
dipengaruhi oleh ketersediaan bahan selulosik dalam media pertumbuhannya.
Meskipun demikian, belum dijelaskan apakah gen-gen penyandi enzim selulolitik
berinteraksi pada proses biosintesis enzim selulolitik.
Jika mikroba pengurai turunan selulosa dapat menguraikan selulosa dan
pengurai selulosa dapat menguraikan turunan selulosa, bahkan enzim-enzim
selulolitik dapat diproduksi secara bersama dalam satu preparat enzim, ini
menunjukkan bahwa ada interaksi antara gen-gen penyandi enzim selulolitik pada
proses biosintesis enzim selulolitik. Adanya interaksi antara gen-gen penyandi enzim
selulolitik pada proses ekspresinya perlu diteliti sebagai salah-satu upaya
mengungkap bagaimana biosintesis enzim selulolitik dikendalikan.

60
PERLENGKAPAN
Alat dan Bahan
1. Empat cawan petri yang masing-masing berisi media untuk uji amilolitik,
proteolitik, lipolitik, dan selulolitik.
2. Jarum Ose Loop
3. Bunsen
4. CMC, Rhodamine atau Tributyrin Agar, Nutrient Agar, Iodine, Amilum, Skim
Milk Agar (SMA)

PROSEDUR
1. Uji Amilolitik
a. Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan mikroba tanah
yang tumbuh pada praktikum mikroba tanah secara streak.
b. Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC
c. Setelah selesai inkubasi, amati penampakan makroskopis. Hidrolisis zat pati
terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan hasil negatif
ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam.

2. Uji Proteolitik
a. Inokulasikan mikroba tanah yang tumbuh pada praktikum mikroba tanah secara
streak pada Skim Milk Agar (SMA)
b. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
c. Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling
koloni.

3. Uji Lipolitik
a. Inokulasikan mikroba tanah yang tumbuh pada praktikum mikroba tanah secara
streak pada media Tributyrin Agar dengan indikator neutral red
b. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
c. Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni, sedangkan
reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah.

61
4. Uji Selulolitik
a. Inokulasikan mikroba tanah yang tumbuh pada praktikum mikroba tanah secara
streak pada media yang mengandung substrat selulosa
b. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
c. Reaksi positif ditandai oleh zona bening di sekeliling koloni, sedangkan reaksi
negatif ditandai tidak adanya zona bening.

62