BAKTERI HIDUP - terdiri dari satu sel

- semi transparan
- sulit diamati dengan mikroskop
tanpa pewarnaan karena tidak
mengadsorbsi ataupun
membiaskan cahaya

Tujuan pewarnaan :
- Membuat sel bakteri lebih mudah diamati
- Untuk melihat bentuk, ukuran dan susunan sel bakteri
- Mengamati struktur eksternal dan internal bakteri

Tujuan pembuatan preparat hidup bakteri tanpa pewarnaan :

- Untuk melihat gerak bakteri
1. Vaselin pada sudut kaca 2. 2 ose suspensi biakan
penutup

3. Kaca obyek diletakkan di atas 4. Preparat tetes

bergantung diperiksa
kaca penutup, kemudian dibalik dengan pembesaran
dengan cepat lensa obyektif 10x, 45x
senyawa organik yang mempunyai gugus kromofor dan
gugus auxokhrom yang terikat pada cincin benzena
Contoh gugus Kromofor Auxokhrom
azo -N=N- -NH2 -I
nitroso -N=O -OH -Br
tio =C=S- -OCH3 -Cl
nitro -NO2
NO2 NO2
+
+ H
O 2N NO2 O 2N NO2
O-
trinitrobenzena asam pikrat (zat warna)
kuning bukan zat warna gugus auxokhrom
mengalami disosiasi
elektrolit
- lazim digunakan dalam proses pewarnaan bakteri

- dalam bentuk larutan, gugus kromofornya (yang mewarnai)

bermuatan positif

- gugus kromofor bereaksi dengan muatan-muatan negatif

dalam sel bakteri (bakteri kaya dengan muatan-muatan
negatif pada gugus fosfat asam nukleatnya)
 Beberapa contoh zat warna basa :
NH2

CH3 CH3
+ - -
N S N Cl N N+ Cl
N
CH3 CH3

NH
Biru Metilen 2
Safranin
CH3 CH3
CH3 CH3
NH2 NH2 -
Cl
H2 N C H2 N C
NH2 Cl N H 2+

CH3 CH3

Basic Fuchsin Chlorida Fuchsin

- Tidak mewarnai sel bakteri
- Dalam bentuk larutan gugus kromofornya bermuatan negatif
sehingga tidak dapat bereaksi dengan muatan-muatan
negatif pada sel bakteri

Beberapa contoh zat warna asam :

Eosin , congo red, India ink, negrosin

Br Br
NaO O O
Na +
Br Br
COO -

Eosin
 Beberapa macam pewarnaan
1. Sederhana
2. Diferensial
a. Gram
b. tahan asam
3. Khusus a. pewarnaan inti sel
b. pewarnaan endospora
c. pewarnaan membran sitoplasma
d. pewarnaan dinding sel
e. pewarnaan simpai
f. pewarnaan flagel
4. Negatif

Keterangan : Pewarnaan 1, 2 dan 3 disebut pewarnaan positif

karena mewarnai sel bakteri.
Pewarnaan no. 4 disebut pewarnaan negatif,
karena sel bakteri tidak terwarnai, yang berwarna
latar belakangnya
Mordant : zat yang dapat meningkatkan afinitas atau pengikatan
zat warna dengan sel bakteri.

Pewarnaan dengan mordant :

- Menyingkat waktu proses pewarnaan
- Membuat hasil pewarnaan lebih intentif

Beberapa contoh mordant : amonium oksalat, fenol, asam tanat,

garam-garam Al, Fe, Sn, Zn, Cu, Cr.

Contoh pewarnaan dengan mordant :

- Pewarnaan sederhana dengan Carbolfuchsin
- Pewarnaan Gram
- Pewarnaan Tahan asam
- Pewarnaan Dinding sel
- Pewarnaan Flagel
- Pewarnaan Spirochet
Teknik aseptis untuk memindahkan kultur bakteri dengan ose
Pembuatan Preparat Bakteri
Pewarnaan sederhana
Menggunakan 1 macam zat warna :
dengan metilen biru ➔ sel bakteri berwarna biru
dengan safranin ➔ sel bakteri berwarna merah
Tujuan : untuk mengamati bentuk, ukuran dan susunan sel
bakteri

Pewarnaan Biru Metilen Pewarnaan Carbolfuchsin

 Pewarnaan Gram : (termasuk pewarnaan diferensial)
Menggunakan lebih dari 1 macam zat warna
Tujuan : untuk membedakan bakteri Gram Positif dan
bakteri Gram negatif berdasarkan kemampuan
bakteri menahan kompleks crystal-violet-yodium
dalam selnya pada proses pencucian dengan
alkohol-aseton

Bakteri Gram positif Bakteri Gram negatif

Zat warna yang disiapkan untuk pewarnaan Gram
→Crystal violet dengan amonium oksalat
A. crystal violet 2g
etil alkohol 20 ml
B. amonium oksalat 0,8 g
aquadest 80 ml
A dan B dicampur
→Safranin (sebagai zat warna kontras)
safranin O* 10 ml
aquadest 100 ml
*2,5 g dalam 100 ml etilalkohol
Selain zat warna disiapkan
→Larutan yodium modifikasi Gram
yodium 1g
KI 2g
aquadest 300 ml
→Larutan pencuci
etilalkohol 95% : aseton (7:3)
 Alkohol-aseton
(7:3)
1 menit 1 menit 0,5 menit
  Pewarnaan Gram
Urutan Reaksi dan warna bakteri
pelaksanaan Gram positif Gram negatif
sel bakteri berwarna sel bakteri berwarna
1. crystal violet
ungu ungu
kompleks CV-Y kompleks CV-Y
2. larutan yodium
sel berwarna ungu sel berwarna ungu
dinding sel lemak terekstraksi
mengalami dehidrasi dari dinding sel
3. pencucian pori-pori mengecil pori-pori membesar
dengan alkohol- komplek CV-Y tidak kompleks CV-Y
aseton (7:3) meninggalkan sel, tercuci keluar
sel tetap berwarna sel tidak berwarna
ungu
tidak berpengaruh, sel menyerap zat
4. safranin sel tetap berwarna warna → merah
ungu
www.google.com
  Pewarnaan Tahan Asam (termasuk pewarnaan
diferensial)
Tujuan : membedakan antara bakteri tahan asam dan
tidak tahan asam
Bakteri tahan asam Bakteri tidak tahan asam
Mycobacterium leprae Bakteri lain
Mycobacterium tuberculosis
Nocardia asteriodes
Dinding sel memiliki wax layer Dinding sel tidak memiliki
sampai 60% dari berat kering wax layer
dinding sel → sel bakteri sulit
diwarnai → harus dibantu dengan
panas 60˚ – 90˚ C
Dapat menahan zat warna Tidak dapat menahan zat
(carbolfuchsin) selama pencucian warna selama pencucian
dengan alkohol-asam
Sel bakteri tetap berwarna merah Sel bakteri berwarna biru
dengan biru metilen
 Zat warna yang disiapkan untuk pewarnaan
Tahan Asam
 Carbolfuchsin Ziehl-Neelsen
A. basic fuchsin 0,3 g
alkohol 95% 10 ml
B. fenol c.p 5g
aquadest 95 ml
A dan B dicampur
 Biru metilen
biru metilen 0,3 g
alkohol 95% 30 ml
akuades 100 ml
 Larutan pencuci
alkohol asam : HCl 37% c.p 3 ml
alkohol 95% ad 100 ml
 Tahapan pewarnaan Tahan Asam
1. Preparat + lar. Carbolfuchsin Ziehl-Neelsen → dipanaskan
sampai terjadi penguapan, dibiarkan dalam keadaan
tersebut selama 3 menit, preparat dijaga tetap basah.
2. Preparat dicuci air kran → dicuci alkohol-asam hingga
preparat berwarna merah muda.
3. Preparat dibilas air kran.
4. Preparat ditetesi lar. biru metilen → didiamkan 1 menit.
5. Preparat dicuci dengan air kran, dikeringkan.
6. Diamati secara mikroskopis dengan pembesaran 10 x 100
Pewarnaan Tahan Asam
 Pewarnaan Khusus
Pewarnaan endospora (metode Schaeffer & Fulton)
Endospora bakteri tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan
sederhana atau diferensial, karena pembungkus luarnya
impermeabel terhadap zat kimia (zat warna). Untuk mewarnai
endospora perlu dibantu dengan panas (70˚ – 90˚ C) dan zat
warna yang ditingkatkan konsentrasinya.
Zat warna yang dipakai : malachite green 5%
safranin 0,5%
bakteri : Bacillus subtilis 24 – 48 jam
Bacillus cereus 24 – 48 jam
Prosedur pewarnaan :
1. Preparat bakteri diberi malachite green, diamkan 60 detik
2. Preparat dipanaskan selama 30 detik dalam keadaan
mengeluarkan uap, kemudian didinginkan
3. Preparat dicuci air kran 30 detik
4. Preparat diberi safranin, diamkan 30 detik
5. Preparat dicuci air kran, dikeringkan dan diamati dengan
mikroskop, pembesaran lensa 10 x 100
spora

Sel
vegetatif
 Pewarnaan Granula metakromatik (Volutin)
Granula metakromatik : polimer fosfat disimpan sebagai
cadangan sumber karbon dan
energi, digunakan untuk biosintesis
dan sebagai ciri identifikasi
Corynebacterium diphteriae.

Untuk pewarnaan disediakan : Corynebacterium diphteriae

Albert’s diphteriae stain
Larutan lugol
Albert’s diphteriae stain Lugol’s Iodine Solution
Toluidine blue 0,15 g Iodine c.p 5g
Methylgreen 0,20 g KI c.p 10 g
As.asetat (glasial) 1 ml Akuades 100 ml
Alkohol 95% 2 ml
Air suling 100 ml
 Prosedur pewarnaan
Albert’s diphteriae stain

preparat

didiamkan 5 menit,
larutan lugol kelebihan zat dibuang

preparat

didiamkan 1 menit

preparat dicuci air kran

dikeringkan dengan tisu

diamati dengan mikroskop

(pembesaran lensa 10 x 100)
 Granula
metakromatik

Corynebacterium diphteriae
 Pewarnaan simpai
Bakteri : Klebsiella pneumoniae 24 jam
Bahan : lar. crystal violet 1% b/v
lar. Cu SO4 20% b/v
Cara kerja : 1. preparat dikeringkan tanpa fiksasi
2. preparat diberi lar. Crystal violet,
didiamkan 2 menit
3. preparat dicuci dengan lar. Cu SO4
20%, dikeringkan di udara
4. diamati dengan mikroskop (10 x 100).
Hasil : sel bakteri berwarna biru tua, simpai berwarna biru
ungu.
 Pewarnaan flagel
Flagel tidak dapat dilihat dengan mikroskop cahaya
karena ukuran diameternya = 12 – 18 nm. Ukuran Ø flagel dapat
diperbesar dengan pemberian suspensi garam asam tanat →
terbentuk presipitat pada dinding sel dan flagel.
Bakteri : Proteus vulgaris
Bahan : 1. Leifson’s flagela stain A, B, C.
2. Lar. Metilen biru 1%
Cara kerja : - usapan bakteri dibiarkan kering pada kaca obyek
tanpa fiksasi
- Leifson’s flagela stain A, B, C dicampur sama
banyaknya (sebelum dipakai)
- preparat diberi Leifson’s stain, diamkan 10
menit, kemudian dicuci air kran
- diberi larutan metilen biru, diamkan 1 menit,
dicuci air kran dan keringkan di udara
- diperiksa dengan mikroskop (10 x 100)
Hasil pemeriksaan : flagel berwarna merah, sel bakteri biru
 Pewarnaan negatif
Digunakan untuk bakteri yang sukar diwarnai secara langsung
(ordo Spirochaetales).
Zat warna : zat warna asam → lar. Nigrosin 10%, Indian ink,
Congo red
Dengan zat warna asam sel bakteri tidak terwarnai, yang
terwarnai adalah latar belakangnya.
Tujuan pewarnaan negatif :
Untuk meningkatkan pengamatan struktur sel bakteri
yang sulit diamati dengan pewarnaan positif → contoh simpai
(kapsul).
Beberapa contoh zat warna
dengan gugus azo –N=N– : metil merah
sudan black
dengan gugus tiasina : metilen biru
dengan gugus asina
amino asina : neutral red
safranin : safranin O
indulin : nigrosin
trifenilmetan : basic fuchsin
crystal violet
pararosanilin,
victoria blue