Nama : Siti Rabiatul

NIM : 2019E1C052

PROSEDUR KERJA

Isolasi jamur yang berasal dari organisme laut ( jangka waktu 6-9 minggu)
1. Langkah awal, pemotongan sampel (jaringan spons,biomassa alga atau daun bakau)
menjadi bagian kecil sekitar 1 cm, dibilas 3 kali dengan air laut untuk membersihkan
sisa permukaan yang menempel tips (untuk mencegah kontaminasi oleh
mikroorganisme sehingga dilakukan aseptis).
2. Rendam potongan sampel dalam Eanol 70 % v/v selama 60-120 detik untuk sterilisasi
permkaan dengan tips (jangan terlalu lama untuk sterilisasi karena dapat membunuh
jamur dalam jaringan).
3. Keringkan potongan tisu dengan kain katun steril (atau bilas dengan air laut buatan
yang steril) untuk menghentikan sterilisasi dengan Etanol.
4. Oleskan potongan dengan hati-hati di atas permukaan cawan petri pertama yang berisi
media isolasi A dengan pinset steril, kemudian letakkan kembali di atas kain katun steril
dan potong menjadi segmen-segmen yang lebih kecil dengan silet steril (kontrol
negatif).
5. Tempatkan potongan-potongan yang kecil pada cawan petri kedua yang berisi media
isolasi A sehingga tepi yang baru dipotong bersentuhan langsung dengan permukaan
agar. Tutup cawan agar dengan parafilm, beri label dan simpan pada 20-25 °C. Kultur
disimpan antara 20 ° C dan 25 ° C di bawah siang hari. Pertumbuhan jamur dari segmen
yang dipotong biasanya dimulai setelah 2-3 hari sampai 14 hari setelah permulaan
percobaan.
6. Strain jamur yang berbeda akan berkembang dari satu sampek. Isolasi/ pisahkan strain
individu dengan mentransfer ujung hifa yang tumbuh dari ujung jaringan yang dipotong
dengan loop steril ke cawan petri segar yang berisi medium B.Tips (pemurniaan galur
jamur dapat dilakukan dengan diulang sampai koloni dianggap murni ini tergantung
pada kondisi kultur dan strain jamur yang berbeda, pertumbuhan dapat diamati setelah
2-3 hari. Strain murni harus tumbuh selama ~1– 2 minggu sebelum pemeriksaan lebih
lanjut.
7. Transfer/ masukkan strain jamur murni untuk identifikasi taksonomi seperti yang
dijelaskan dalam Kotak 1.
8. Untuk fermentasi skala kecil dan skala besar, inokulasikan strain jamur murni ke dalam
labu Erlenmeyer 1.000 ml yang berisi 300 ml medium Wickerham cair atau 210 g
medium beras padat. Untuk tujuan ini, potong strain yang menutupi permukaan cawan
petri yang diinokulasi menjadi potongan-potongan kecil berukuran ~1,5 cm × 1,5 cm
dan pindahkan potongan-potongan ini dengan loop steril ke dalam labu Erlenmeyer
yang berisi media yang disterilkan. (budidaya dilakukan pada suhu kamar dengan
kondisi statis pada siang hari tergantung pada pertumbuhan jamur. Kultur media cair
diiinkubasi selama 3-4 minggu, sedangkan pada beras selama 4-6 minggu).
9. Akhiri fermentasi dengan menambahkan 250 ml EtOAc ke dalam labu kultur dan
biarkan labu tertutup setidaknya selama 24 jam. EtOAc akan meningkatkan
keterbasahan spora dan menurunkan jumlah spora, yang akan mengudara setelah labu
dibuka ( Untuk mencegah spora,penyebaran fragmen, labu hanya dibuka dibawah alirah
udara laminar).
 10. Penyimpanan jangka panjang dengan pemindahan galur jamur murni ke tabung BD
Falcon 10 ml berisi 5 ml medium MexA. Pertumbuhan dapat diamati setekah 3 hari
tergantung strain jamur, selanjutnya bekukan jamur secara bertahap.
 Pertama-tama masukkan dalam es suhu 4°C selama 2 jam
 Kedua, freezer dalam suhu -20°C selama 2 jam.
 Masukkan dalam freezer dalam suhu -80 °C dan disimpan dalam suhu tersebut.
Tips : Untuk pemulihan dari 80 °C, cairkan kultur beku dengan cepat dalam penangas
air pada suhu 37 °C dan pindahkan potongan kecil dengan loop steril ke cawan petri
yang berisi media B. Untuk mencegah kontaminasi lingkungan dengan bahan yang
layak, peralatan yang telah bersentuhan dengan bahan jamur harus diautoklaf pada 134
°C selama 15 menit sebelum digunakan kembali atau dibuang.
Ekstraksi kultur skala kecil (jangka waktu 2 hari)
11. Proses ekstrak kultur mengikuti langkah-langkah dalam opsi (A) medium cair skala
kecil;(B) Beras skala kecil menengah;(C) medium skala cair besar; )d) media nasi skala
besar.
a.Medium cair skala kecil
 Campur isi labu kultur termasuk 250 mL etil asetat yang ditambah secara
menyeluruh dalam Ultraturrax pada suhu 4.000μ paling sedikit untuk
penghancuran sel dan ekstraksi selama 10 menit.
 Saring campuran di bawah vakum menggunakan corong Buchner dan buang
residu miselium.
 Pindahkan filtrat kultur ke dalam corong pemisah. Pisahkan fase etil asetat
dan H2O dan ekstrak fase air dua kali dengan masing-masing 300 ml etil
asetat. Cuci gabungan fase etil asetat dengan 100 ml air demineralisasi untuk
menghilangkan garam laut yang tersisa.
b.Beras skala kecil menengah
 Potong media kultur yang mengandung miselium menjadi potongan-
potongan kecil untuk menjadian ekstraksi lengkap dengan etil asetat.
 Untuk ekstraksi optimal miselium dengan pelarut ekstraksi tambahan harus
disimpan di shaker selama 1 hari.
 Saring isinya di bawah vakum menggunakan corong Buchner dan ulangi
ekstraksi dengan etil asetat sampai habis
 Cuci gabungan fase etil asetat dengan 300 ml air untuk menghilangkan
glukosa dan pati.
c.Medium cair skala besar
 Pisahkan miselia jamur dari media kultus tutupi dengan 5 liter methanol
agar mencegah penyebaran fragmen,spora,labu di buka di bawah LAF.
Miselia dibiarkan semalaman).
 mengekstrak sel selama 10 menit pada 4000μ paling sedikit1menggunakan
Ultraturrax.
 Saring campuran di bawah vakum menggunakan corong Buchner.
 Ulangi ekstraksi dengan cara yang sama sampai habis sekitar 2-3 kali
 Ekstrak media kultur dengan cara sama dengan ekstraksi skala kecil untuk
mendapatkan ekstrak etil asetat.
d.Beras medium skala besar
  Ekstraksi media beras skala besar dengan cara yang sama seperti kultur skala kecil
menggunakan 10 liter etil asetat.
Pemeriksaan ekstrak kasar yang membutuhkan waktu beberapa hari hingga minggu
12. Pemeriksaan ekstrak kasar mengacu langkah-langkah dalam opsi (a) Untuk ekstrak
skala kecil dan opsi (b) ekstrak skala besar
a. Ekstrak skala kecil
 Keringkan ekstrak ETanol AC )berupa beras/cair) di bawah vakum (200 mbar)
menggunakan rotavapor pada suhu 40°C untuk menghasilkan residu padat atau
berminyak (tergantung ETAC yang digunakan dan ukuran labu alas bulat, dengan
waktu 40 menit dan ekstrak kering disimpan dalam freezer hingga pemeriksaan
lebih lanjut).
 Partisi residu antara n-heksana dan 90% v/v MeOH cair dengan perbandingan 1:1
v/v masing-masing 150 ml.
 Keringkan setiap fraksi di bawah vakum (200 mbar) menggunakan rotavapor pada
40℃ untuk menghasilkan residu berminyak atau padat.
 Serahkan semua fraksi ke TLC, HPLC analitik,LC-MS dan juga uji bioaktivitas
 Selidiki lanjut tergantung hasil pemeriksaan kimia dan biologi pada identitas
taksnonomi jamur. menggunakan rotavapor pada 40℃ untuk menghasilkan residu
berminyak atau padat.
b. Ekstrak skala besar
 Keringkan ekstrak etil asetat.atau metanol (baik dari beras atau biakan cair) di
bawah vakum (~200 mbar) menggunakan rotavapor pada 40 °C untuk
menghasilkan residu padat atau berminyak. Tergantung pada volume etil
asetat.yang digunakan dan ukuran labu bundar, langkah ini membutuhkan waktu
sekitar 40 menit liter1 dari pelarut.
 Partisi setiap residu antaran-heksana dan 90 % v/v MeOH dengan perbandingan
1:1 v/v menggunakan sedikit pelarut.
 Kirim semua fraksi ke TLC, HPLC analitis, LC-MS dan juga uji bioaktivitas
seperti uji difusi agar atau uji udang air asin atau uji MTT.
13. Sesuaikan dengan komponen fraksi, 2 prosedur permurnian yang berbeda dapat
diterapkan Untuk senyawa polar rendah atau menengah lihat opsi (a), untuk senyawa
polar lihat opsi (b).
a. Pecahan polaritas rendah atau sedang
 Fraksi yang mengandung senyawa polar rendah atau menengah selanjutnya
difraksinasi dan dimurnikan menggunakan metode MPLC seperti VLC.
Kemudian, pemurnian lebih lanjut dilanjutkan dengan kromatografi kolom (CC)
menggunakan fase diam normal atau terbalik dan fase gerak yang sesuai untuk
mengelusi komponen.
b. Fraksi polar pecahan kutub
 Fraksi yang sangat polar mengandung senyawa organik yang larut dalam air.
Dalam pengalaman kami, prosedur yang baik adalah menggunakan CC fase
terbalik (misalnya, RP-18) atau tempat tidur resin penukar ion seperti HP-20 yang
dielusi secara bertahap dari air ke metanol untuk menghilangkan sisa garam
mineral dan gula yang ada dalam fraksi ini. Metode kromatografi dilakukan
seperti yang dijelaskan dalam protokol sebelumnya yang berhubungan dengan
pemeriksaan ekstrak yang berasal dari makroorganisme laut.
14. Lanjutkan komponene individu isolasi dalam bentuk murni dan diidentifikasi secara
structural, dan menjalani uji bioaktivitas.
15. Penjelasan struktur dilakukan dengan berbagai metode spektroskopi, terutama MS dan
NMR (1 hari dan 2 hari). Untuk penjelasan konfigurasi absolut produk alam kiral baru,
metode derivatisasi seperti pembuatan ester Mosher atau dengan menggunakan metode
Marfey kadang-kadang diperlukan (sebagai alternatif, konfigurasi absolut dapat
dijelaskan dengan kristalografi sinar-X atau dengan spektroskopi CD diikuti dengan
perhitungan kimia kuantum).
16. Setelah komponen individu diisolasi dalam bentuk murni dan diidentifikasi secara
structural harus diuji bioaktivitas
17. Mempelajari hubungan struktur-aktivitas untuk mengidentifikasi senyawa yang
dioptimalkan yang berfungsi sebagai senyawa obat bersumber dari alam.