09/01/2023

Uji Kemurnian

Metode

➢ KLT/KKt (Pengembangan
tunggal dgn 3 macam
Menguji tingkat pengembang yg berbeda)
kemurnian isolat ➢ KLT/KKt dua dimensi
Uji Kemurnian Isolat/Senyawa ➢ Penentuan titik lebur/leleh
➢ HPLC/KCKT
➢ GCMS/KGSM
Metode Pemisahan Bahan Alam ➢ Metode lain …

1 2

1
 09/01/2023

KLT/KKt Pengembangan Tunggal KLT/KKt pengembangan tunggal

1. Siapkan bejana KLT (chamber)
2. Lapisi bejana dengan kertas saring
3. Siapkan fase gerak/pengembang (tunggal/campuran)
4. Masukan pengembang 1 ke dalam bejana dan tutup
Minimal digunakan 3 sistem rapat.Biarkan bejana jenuh dengan uap
pengembang
pengembang/fase gerak yang berbeda
5. Sejumlah isolat dilarutkan dalam beberapa mL pelarut
sampai diperoleh larutan yang tidak terlalu kental dan
tidak terlalu encer.
6. Totolkan isolat pada pelat KLT/KKt dengan
menggunakan pipa kapiler

3 4

2
 09/01/2023

Penotolan sampel Lanjutan...

7. Biarkan totolan mengering (pelarut menguap)

8. Masukan pelat yg sudah ditotolkan ke dalam bejana.
(perhatian tinggi permukaan pengembang dalam bejana
harus lebih rendah dari pada totolan bercak)
9. Biarkan pengembang naik sampai sekitar 1-2 cm
sebelum pinggir pelat
10. Angkat pelat,biarkan pelat mengering (pelarut menguap)
11. Amati bercak
12. Ulangi untuk pengembang ke 2 dan 3

5 6

3
 09/01/2023

K husus untuk KLT

➢ Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu

ultraviolet.
Param et er M u rn i ? ⦁ Jika bercak tidak berwarna atau berflouresensi di bawah
lampu uv,semprot dengan penampak bercak universal
asam sulfat 10% (MeOH).

7 8

4
 09/01/2023

K husus untuk KKt KLT/KKt Pengembangan Tunggal

➢ Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu Isolat kemungkinan murni jika
ultraviolet. kromatogram pada ketiga macam
⦁ Jika bercak tidak berwarna atau berflouresensi di
bawah lampu uv,semprot dengan penampak bercak
pengembang di atas hanya menunjukan
khusus/ penampak bercak umum (tidak korosif) 1 bercak

9 1
0

5
 09/01/2023

Uji kemurnian Isolat Pengembangan tunggal Diskusi (1)…

Mengapa harus digunakan

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
minimal 3 sistem
UV λ 254 nm UV λ 366 nm H2SO 4 λ 10% H2SO 4 10%
UV λ 366 nm
pengembang/fase gerak
Keterangan :Fase diam silika gel F254 pra salut
pengembang :
yang berbeda
1 = aseton-kloroform-asam format-air 10:10:1:1
2 = etil asetat-aseton-asam format 15:3:1
3 = butanol-asam asetat-air 4:1:5

1 1
1 2

6
 09/01/2023

KLT/KKt dua dimensi

1. Siapkan bejana KLT (chamber)

2. Lapisi bejana dengan kertas saring
3. Siapkan fase gerak/pengembang (tunggal/campuran)
4. Masukan pengembang 1 ke dalam bejana dan tutup
rapat.Biarkan bejana jenuh dengan uap pengembang
KLT 2 Dimensi 5. Sejumlah isolat dilarutkan dalam beberapa mL pelarut
sampai diperoleh larutan yang tidak terlalu kental dan
tidak terlalu encer.
6. Totolkan isolat pada pelat KLT/KKt dengan
menggunakan pipa kapiler

1 1
3 4

7
 09/01/2023

Lanjutan... Lanjutan...
7. Biarkan totolan mengering (pelarut menguap)
13.Masukan pelat/kertas pada pengembang ke 2
8. Masukan pelat yg sudah ditotolkan ke dalam bejana. (pengembang ke 2 lebih polar dari pada yg ke 1)
(perhatian tinggi permukaan pengembang dalam bejana
14. Angkat pelat/kertas,biarkan pelat/kertas mengering
harus lebih rendah dari pada totolan bercak)
(pelarut menguap)
9. Biarkan pengembang naik sampai sekitar 1-2 cm
15. Amati bercak
sebelum pinggir pelat
10. Angkat pelat,biarkan pelat mengering (pelarut menguap)
11. Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu
ultraviolet. (TIDAK DISEMPROT D ENGAN
PENAMPAK BERCAK)
12. Pelat di putar 90 (tegak lurus)
1 1
5 6

8
 09/01/2023

K husus untuk KLT K husus untuk KKt

➢ Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu
ultraviolet.
⦁ Jika bercak tidak berwarna atau berflouresensi di bawah
lampu uv,semprot dengan penampak bercak universal
asam sulfat 10% (MeOH).
➢ Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu
ultraviolet.
⦁ Jika bercak tidak berwarna atau berflouresensi di
bawah lampu uv,semprot dengan penampak bercak
khusus/ penampak bercak umum (tidak korosif)

1 1
7 8

9
 09/01/2023

Uji Kemurnian Isolat Pengembangan dua dimensi KLT/KKt dua dimensi

Isolat kemungkinan murni jika

1 1 1 1

2 2 2 2
kromatogram pada kedua macam
pengembang di atas hanya
1
UV λ 254 nm UV λ 366 nm H2SO 4 10% H2SO 4 10%
UV λ366 nm

m enunj ukan 1 bercak

Keterangan :Fase diam silika gel GF254 pra salut, uji KLT 2 dimensi
Pengembang :
1= etil asetat-asam format-air 18:1:1
2= etil asetat-aseton-asam format-air 10:3:1:1

1 2
9 0

10
 09/01/2023

Diskusi (2)…

KeuntunganVs Kerugian Parameter Nilai yang didapatkan

uji kemurnian dengan dari KLT atau KKt ?
Metode KLT/Kkt ?

2 2
1 2

11
 09/01/2023

Diskusi (3)… Diskusi (4)…

Rf Contoh:
Data Pustaka :diketahui nilai Rf suatu senyawa 0,45

hRf Pengujian di lab.diperoleh nilai Rf 0,45

RRf ??? Di lakukan dengan fase diam dan pengembang yang sama
dengan pustaka

Kesimpulan
Rx Apakah senyawa yang sama ????

2 2
3 4

12
 09/01/2023

Faktor-faktor yang mempengaruh nilai R f Faktor-faktor yang mempengaruh nilai Rf

• Kejenuhan chamber • Total plat dalam chamber

• Adsorben/penjerap
• Suhu
• Kelembaban
• Plat pra salut atau bukan?
• Ketebalan dari lapis tipis
• Metode aktivasi plat
• Jarak bercak dari sisi plat
• Jarak yang ditempuh pengembang/ tinggi plat
• Pengkuran bercak
• Komposisi dari pengembang
• Kemurnian dari sistem pengembang
• Konsentrasi sampel

2 2
5 6

13
 09/01/2023

Diskusi (5)... Co-cromatography

1. Kuersetin
2. Apigenin 7-O-glikosida
3. Isolat
4. Luteolin 7-O-glikosida

Co-chromatography ? Fase diam :Silika gel F254 pra salut

Pengembang :
Etil asetat-asam format-air (18:1:1)

UV λ 254 nm Asam Sulfat 10%

(metanol)

2 2
7 8

14
 09/01/2023

Co-Chromatography Penentuan Titik Lebur

D engan alat Electrothermal

1. Isolat
2. Isolat + Luteolin 7-O-glikosida 1. Masukan sejumlah isolat ke dalam pipa kapiler khusus
3. Luteolin 7-O-glikosida untuk penentuan titik lebur.
2. Set angka pada alat elektrotermal 10°C di bawah titik
Fase diam :Silika gel F254 pra salut
Pengembang :etil asetat-asam format
lebur isolat
air (18:1:1) 3. Alat elektrotermal dijalankan, amati suhu pada saat
UV λ 254 nm
mulai melebur (dicatat) sampai isolat melebur semua
Asam sulfat 10%
(Metanol) (dicatat)

2 3
9 0

15
 09/01/2023

Pipa kapiler
lebar (1,1-1,8 mm)
panjang (90-100 mm)

Sampel
Pipa kapiler
D ijatuhkan sehingga sampel
ada pada bagian dasar kapiler
(sampel setinggi 2-3 mm)
Penentuan Titik Leleh/Lebur
Pipa kapiler ujung terbuka

Pipa kapiler ujung tetutup

3 32(Shriner.,P 25)
1

16
 09/01/2023

Melting Point Apparatus Kalibrasi Alat

33 S3h4riner,P 28

17
 09/01/2023

Titik lebur Diskusi (6)…

Murni atau tidak ? ? ?
Jika isolat langsung melebur pada suhu leburnya atau
melebur pada jarak maksim um 2°C maka isolat dapat
dinyatakan murni
⦁ D ata Pustaka jarak lebur senyawa X adalah 245 – 247 °C .
⦁ D ari hasil penelitian diperoleh senyawa yang diduga“ X “
melebur pada jarak 242 – 244 °C.
⦁ Apakah senyawa “ X “ dapat dinyatakan murni ?
⦁ Apakah senyawa yang diduga senyawa “ X “sama dengan
senyawa X pustaka ?

35 36

18
 09/01/2023

Co-melting point Diskusi (7)…

⦁ Campuran dua atau lebih senyawa yang tidak identik
→menunjukan penurunan titik lebur

⦁ Campuran dua senyawa yang identik → tidak

m enimbulkan penurunan titik lebur dari titik lebur
sebelumnya. Keuntungan Vs Kerugian
Uji kemurnian dengan penetuan titik lebur ?
⦁ SenyawaA dan B dibuat campuran :
%A %B
20 80
50 50
80 20

37 38

19
 09/01/2023

Diskusi (8)…

Uji kemurnian dengan HPLC ?

Uji kemurnian dengan G C M S ? Ada Pertanyaan ? ? ?

Uji kemurnian dengan Rotasi Optik ?

Metode lain? Terim a k as ih

39 40

20