Rangkuman Materi

Penentuan bakteri Legionella di perairan dan lainnya sampel lingkungan (2020)

PENDAHULUAN
Spesies Legionella, penyebab legionellosis, adalah bakteri akuatik yang tersebar luas di alam dan terdapat di air pada kisaran suhu 20
– 43 °C. HSE mencatat bahwa ada risiko legionella yang cukup dapat diperkirakan jika suhu air di semua atau sebagian sistem air
mungkin antara 20–45 °C.

Spesies Legionella lazim dalam sistem air buatan, dan bakteri penyebab penyakit dapat ditularkan dari sistem ini ke individu melalui
aerosol, atau antara individu langsung. Menara pendingin, sistem air panas dan dingin, kolam renang atau spa, dan berbagai sumber
lain juga umumnya dikaitkan dengan wabah yang bermula dari adanya bakteri legionella.

Saat ini, jumlah legionella seringkali rendah dan jarang melebihi 1% dari total populasi bakteri. Akibatnya, perlu untuk
mengkonsentrasikan flora bakteri dari sampel air sebelum menggunakan teknik kultur selektif untuk mengisolasi bakteri Legionella.

Namun, dalam penyelidikan wabah, ketika sumber potensial dapat menunjukkan jumlah legionella yang tinggi dan sangat
terkontaminasi dengan bakteri lain, sampel harus diperiksa dengan dan tanpa tahap konsentrasi yang digunakan. Sampel yang tidak
terkonsentrasi dapat menghasilkan legionella bahkan ketika legionella biasanya tidak terdeteksi dalam sampel yang terkonsentrasi
karena pertumbuhan berlebih oleh organisme lain. Konsentrasi dapat dicapai dengan menggunakan teknik filtrasi atau sentrifugasi,
atau kombinasi keduanya.

1
A. Deteksi dan pencacahan spesies Legionella dengan filtrasi, elusi dan pelapisan menyebar ke media selektif
1. Prinsip
Mikroorganisme, termasuk Legionella, dalam sampel air harus dipekatkan dengan filtrasi membran dan/atau sentrifugasi. Untuk
mengurangi pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan yang dapat menghambat pertumbuhan Legionella, sebagian dari
spesimen pekat harus diberi perlakuan dengan asam. Selain itu, bagian selanjutnya dari spesimen pekat harus diperlakukan dengan
panas. Porsi uji yang diberi perlakuan asam, diberi perlakuan panas dan tidak diberi perlakuan kemudian harus diinokulasi ke cawan
Petri yang berisi media agar selektif dan diinkubasi. Sampel sedimen, biofilm, dan endapan permukaan lainnya tidak memerlukan
konsentrasi tetapi mungkin memerlukan elusi sebelum kultur.
Organisme Legionella yang diinkubasi pada media berbahan dasar arang menghasilkan koloni dengan tampilan morfologi yang khas.
Ada beberapa spesies Legionella yang tidak menghasilkan morfologi koloni yang khas pada isolasi primer misalnya L. longbeachae,
L. cincinnatiensis. Berikut merupakan tampilan koloni bakteri legionella pneumophila sp pada dasar gelas kaca.

Gambar 1. 1 Koloni bakteri L.pneumophila pada dasar gelas kaca

2
2. Batas deteksi
Tidak semua biosida mengenali zat penetral dan jika ada, mereka akan terus mengerahkan efek bakterisidalnya setelah pengambilan
sampel. Kegagalan untuk menetralkan biosida dapat mengakibatkan hasil negatif palsu atau perkiraan jumlah mikroorganisme yang
terlalu rendah (mis. Legionella sp) yang ada dalam sampel. Oleh karena itu, wadah sampel harus berisi penetral yang sesuai jika
tersedia dan catatan biosida dan bahan penetral yang disimpan disimpan untuk mengontekstualisasikan hasil pemeriksaan yang
dilakukan. Bakteri lain, terutama pseudomonas, atau jamur yang ada dalam sampel dapat tumbuh pada media agar dan
menghambat pertumbuhan legionella sp atau sangat menutupi keberadaannya, namun pertumbuhan berlebih oleh mikroorganisme
lain tidak berarti bahwa sampel negatif untuk Legionella. Pencacahan Legionella mungkin diremehkan karena umumnya diasumsikan
bahwa satu sel legionella menghasilkan satu koloni yang terlihat. Namun jumlah sebenarnya mungkin jauh lebih tinggi karena
rumpun sel Legionella juga hanya menghasilkan satu koloni. Metode kultur yang saat ini digunakan untuk mendeteksi legionella dari
air jarang mencapai pemulihan 100%, dengan sebagian besar praktik saat ini hanya mencapai tingkat antara sekitar 10 - 50%.
Akibatnya, jumlah legionella yang sebenarnya dalam air biasanya lebih tinggi.

3. Penyimpanan sampel selama pengiriman

Pada suhu yang lebih rendah dari 6 °C Legionella dapat memasuki keadaan hidup tetapi tidak dapat dibudidayakan. Pada suhu di
atas 20 °C kemungkinan legionella dapat berkembang biak, oleh karena itu transportasi dan penyimpanan pada suhu sekitar 6 °C - 20
°C direkomendasikan. Sampel harus dianalisis sesegera mungkin tidak lebih dari dua hari, dan sebaiknya dalam waktu 24 jam.
Namun laboratorium harus memverifikasi bahwa pengangkutan dan kondisi penyimpanan yang dipilih sesuai.

3
4. Peralatan Kerja pendukung

No. Pelaratan Deskripsi

1. Filter membran untuk konsentrasi dan Filter membran poliamida (polietersulfon) atau polikarbonat, ukuran pori
elusi nominal 0,22 μm dan diameter 47 - 142 mm. Filter membran berdiameter lebih
besar lebih cocok untuk menyaring volume air yang lebih besar atau sampel
yang mengandung lebih banyak partikel, dan menahan laju aliran yang lebih
tinggi. Filter membran polikarbonat harus digunakan dengan laju aliran yang
lebih rendah tetapi ini akan memperpanjang waktu pemrosesan.
2. Vacum Serangkaian alat filtrasi membran terdiri dari vakum. Pompa vakum yang cocok
untuk filter membran dengan diameter 47 mm dan volume penyaringan air
biasanya hingga 1 liter.
3. Alat Filtrasi Peralatan filtrasi membran tekanan positif cocok untuk menyaring volume yang
lebih besar atau sampel air yang lebih keruh. Peralatan ini biasanya dilengkapi
dudukan filter dan corong dan harus tahan terhadap autoklaf. Diameter filter
dapat bervariasi antara 47 - 142 mm.
4. Pompa peristaltik filtrasi membran Pompa peristaltik filtrasi membran tekanan positif mampu menghasilkan laju
tekanan positif aliran hingga 3 liter per menit dengan kontrol kecepatan variabel. Sebagai
alternatif, kompresor dan bejana tekan dapat digunakan
5. Tabung Silikon Tabung silikon dengan diameter dalam dan luar seperti yang ditentukan oleh
produsen pompa peristaltik
6. Centrifuge Centrifuge mampu mencapai gaya sentrifugal 6000 ± 100 g selama 10 menit
atau 3000 ± 100 g selama 30 menit. Alat ini harus dioperasikan pada suhu
antara 15 – 25 oC. Idealnya, rotor harus dari jenis “swingout”. Juga diperlukan
tabung yang sesuai, sebaiknya yang memiliki dasar kerucut, dan ember
pengaman dengan kapasitas yang sesuai.
7. Inkubator Inkubator, mampu dipertahankan pada suhu 36,0 ± 1,0 °C. Inkubator yang
dilembabkan lebih disukai, tetapi penggunaan karbon dioksida adalah opsional.
8. Cell scrapers. Pengikis sel. Ini tersedia secara komersial.
9. Mikroskop binokular berdaya rendah Mikroskop binokular berdaya rendah, dengan pembesaran minimal 6 kali, dan
diterangi dari atas dengan cahaya insiden miring.

4
 10. Lampu ultraviolet Memancarkan cahaya dengan panjang gelombang 360 ± 20 nm.
11. Plastik steril Kantong plastik food grade steril, misalnya kantong stomacher.
12. Ultrasonic waterbath -
13. Waterbath/ Penangas Air Penangas air, mampu dipertahankan pada suhu (50 ± 1) °C.
14. Vortex mixer -
15. Wadah steril Wadah steril tutup ulir, misalnya wadah universal.
16. Tang berujung halus -

5. Media dan reagent

No Reagent Komposisi Kadar Prosedur Pembuatan
.
1. Larutan Ringer’s Natrium klorida (NaCl) 2,25 g Larutkan bahan dalam air dan aduk rata. Encerkan
Kalium klorida (KCl) 0,105 g larutan yang dihasilkan dengan air dengan
Kalsium klorida heksahidrat 0,12 g perbandingan 1:10. Larutan ini dapat disalurkan
(CaCl2H12O6) 0,05 g sesuai kebutuhan dalam volume yang sesuai ke
Natrium hidrogen karbonat (NaHCO2) 1000 ml dalam wadah yang sesuai, ditutup dan diautoklaf
Air hingga pada suhu 121 oC selama 15 menit dg pH akhir
larutan harus 7,0 ± 0,2
2. Larutan garam Page’s Natrium klorida (NaCl) 0,12 g Larutkan bahan dalam air dan aduk rata. Larutan
Magnesium sulfat heptahidrat (MgSO4) 0,004 g yang dihasilkan dapat disalurkan sesuai kebutuhan
Kalsium klorida dihidrat (CaCl2.2H2O) 0,004 g dalam volume yang sesuai ke dalam wadah yang
Dinatrium hidrogen ortofosfat 0,142 g sesuai, ditutup dan diautoklaf pada suhu 121 °C
(Na2HPO4) 0,136 g selama 15 menit. Untuk memfasilitasi penyiapan
Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4) 1000 mL yang akurat, 10 liter larutan garam Page’s dapat
Air hingga disiapkan dan dibagikan dalam volume yang
diperlukan untuk autoklaf pada 121 °C selama 15
menit. Sebagai alternatif, larutan pekat dapat
disiapkan dan diencerkan sesuai untuk digunakan.

3. Larutan Buffered Buffer N-2-acetamido-2-amidoethane- 10,0 g Tambahkan 0,4 g L-sistein hidroklorida ke dalam 10

5
charcoal yeast extract sulphonic acid (ACES)
agar with L-cysteine Kalium hidroksida
(BCYE) Arang aktif
Ekstrak ragi (tingkat bakteriologis)
α-ketoglutarat, garam kalium
Agar-agar
L-sistein hidroklorida monohidrat
Besi(III) pirofosfat
Air hingga
ml air. Saring-sterilkan larutan dengan penyaringan
2,8 g melalui filter membran dengan ukuran pori nominal
2,0 g 0,22 μm. Tambahkan 0,25 g besi(III) pirofosfat ke
10,0 g dalam 10 ml air. Saring-sterilkan larutan dengan
1,0 g penyaringan melalui filter membran dengan ukuran
12,0 g pori nominal 0,22 μm. Larutan yang telah disterilkan
0,4 g dapat disimpan dalam wadah steril yang bersih pada
0,25 g suhu – 20 (± 3) °C hingga 3 bulan, tetapi harus
1000 ml dibiarkan mencapai suhu kamar sebelum digunakan.
Jika larutan ini tidak segera digunakan, larutan
tersebut harus disterilkan ulang sebelum
ditambahkan ke media.
Tambahkan 10 g buffer N-2-acetamido-2-
amidoethane-sulphonic acid (ACES) ke dalam 500 ml
air dalam wadah yang sesuai. Larutkan buffer dengan
mendiamkan wadah dalam penangas air pada suhu
45 - 50 °C. Tambahkan 2,8 g kalium hidroksida ke
dalam 480 ml air dan larutkan dengan mengocok
perlahan. Campurkan kedua larutan.Buffer ACES
dapat mengubah sifat ekstrak ragi jika urutan berikut
tidak diikuti secara ketat.
Tambahkan secara berurutan ke dalam 980 ml
larutan buffer ACES alkalin, 2 g arang aktif, 10 g
ekstrak ragi dan 1 g garam α-ketoglutarat. Aduk rata
di antara setiap penambahan. Jika perlu, gunakan
larutan kalium hidroksida 0,1 mol l-1 atau larutan
asam sulfat 0,1 mol l-1 dan sesuaikan pH larutan
buffer ACES yang dihasilkan menjadi 6,8 ± 0,1.
Tambahkan agar, aduk rata dan autoklaf pada suhu
121 oC selama 15 menit. Setelah autoklaf, biarkan
larutan mendingin hingga 50 ± 2 °C dalam penangas
air. Secara aseptis, tambahkan larutan L-sistein dan
besi(III) pirofosfat, aduk rata di antara setiap
penambahan. PH media akhir harus 6,8 ± 0,2 pada 25
6
 °C. Keluarkan media, dalam volume 20 ml, ke dalam
cawan Petri, berdiameter antara 90 - 100 mm dan
biarkan media menjadi dingin. Biarkan kelembapan
berlebih pada agar mengering. Cawan Petri dapat
disimpan pada suhu 5 ± 3 °C dalam wadah kedap
udara dalam gelap hingga 4 minggu.
Media sensitif terhadap panas dan pemanasan yang
terlalu lama atau suhu yang terlalu tinggi selama
sterilisasi dapat sangat mempengaruhi kualitas
nutrisi media
4. Larutan Buffered Pada pembuatan media ini disiapkan dengan
charcoal yeast extract prosedur yang sama seperti reagen no. 3 tetapi
agar without L-cysteine tanpa penambahan L-sistein hidroklorida.
(BCYE –cys)

7
5. Larutan Buffered Polimiksin B sulfat 80.000 iu l- Media ini lebih selektif daripada BCYE (no.3). Ini
charcoal yeast extract Vankomisin hidroklorida 1 termasuk glisin dan antibiotik dan harus disiapkan
agar with glycine and Cycloheximide 1 mg l-1 seperti yang dijelaskan pada bagian (no.3) dengan
antibiotic supplements Glycine (bebas amonia) 80 mg l-1 penambahan glisin sebelum agar ditambahkan, dan
(GVPC) 3 g l-1 penambahan suplemen antibiotik, setelah
penambahan larutan L-sistein dan besi(III) pirofosfat
Cycloheximide bersifat hepatotoksik dan pakaian
pelindung yang sesuai harus dikenakan saat
menangani bahan kimia ini. Konsentrasi (sekitar
7000 iu mg-1) dari setiap batch polimiksin B sulfat
harus diperiksa untuk memastikan tercapainya
konsentrasi akhir yang benar.
Larutkan polimiksin B sulfat dalam jumlah yang
sesuai (sekitar 200 mg, yaitu sekitar 1400000 iu)
dalam 100 ml air. Saring-sterilkan larutan melalui
filter membran 0,22 μm, dan buang dalam volume
yang sesuai, biasanya sekitar 5,7 ml, ke dalam wadah
steril. Larutan dapat disimpan pada -20 ± 3°C hingga
6 bulan. Namun, larutan harus dibiarkan mencair ke
suhu kamar sebelum digunakan.
Larutkan 20 mg vankomisin hidroklorida dalam 20 ml
air. Saring-sterilkan larutan melalui filter membran
0,22 μm dan bagikan larutan, dalam volume 1 ml, ke
dalam wadah steril. Wadah ini dapat disimpan pada
suhu -20 ± 3°C hingga 6 bulan, tetapi larutan harus
dicairkan hingga suhu kamar sebelum digunakan.
Larutkan 2 g sikloheksimid dalam 100 ml air. Saring-
sterilkan larutan melalui filter membran 0,22 μm dan
bagikan larutan, dalam volume 4 ml, ke dalam wadah
steril. Wadah ini dapat disimpan pada suhu -20 ± 3°C
hingga 6 bulan, tetapi larutan harus dicairkan hingga
suhu kamar sebelum digunakan.
Siapkan media, seperti dijelaskan pada bagian no. 3,
tetapi dengan penambahan glisin sesaat sebelum
penambahan agar. Sesuaikan pH larutan menjadi 6,8
8
 6. Larutan Buffer asam Campurkan 3,9 ml larutan asam klorida 0,2 mol l-1
dengan 25 ml larutan kalium klorida 0,2 mol l-115.
Sesuaikan pH larutan menjadi 2,2 ± 0,2 dengan
penambahan 1 mol l-1 larutan kalium hidroksida.
Simpan larutan yang dihasilkan dalam wadah
tertutup, di tempat gelap, pada suhu kamar. Solusi
ini dapat disimpan hingga satu bulan sebelum
digunakan. Siapkan 0,2 mol l-1 larutan asam klorida
dengan menambahkan 17,4 ml asam klorida pekat
(berat jenis 1,18, uji minimum 35,4 %, kira-kira 10 M)
ke dalam 1000 ml air. Tergantung pada konsentrasi
asam, volume asam yang tepat mungkin perlu
disesuaikan sebagaimana mestinya.
Siapkan 0,2 mol l-1 larutan kalium klorida dengan
melarutkan 14,9 g kalium klorida dalam 1000 ml air.
Siapkan 1 mol l-1 larutan kalium hidroksida dengan
melarutkan 40 g kalium hidroksida dalam 1000 ml
air.

6. Posedur analisis
a) Persiapan sampel air
Di sebagian besar skenario pengujian, jumlah legionella dalam sampel air tertentu tidak diketahui. Oleh karena itu, teknik
konsentrasi harus dilakukan pada semua sampel cairan sebelum analisis. Jika sampel diketahui mengandung sampel cairan
legionellae tingkat tinggi, sampel dapat diinokulasi langsung ke media GVPC (No.5).

 Sebelum alikuot sampel dikeluarkan dari sampel yang diserahkan ke laboratorium, sampel harus dicampur dengan inversi
lembut untuk menghasilkan larutan atau suspensi yang dihomogenisasi sambil meminimalkan produksi aerosol.

9
  Volume sampel yang digunakan dalam analisis harus dicatat sebelum pemekatan dengan filtrasi dan/atau sentrifugasi.
Volume akhir dari setiap suspensi pekat harus mewakili antara konsentrasi 100 kali lipat dan 1000 kali lipat dari volume
sampel asli. CATATAN: Jika terlihat adanya pemisahan atau sedimentasi dalam sampel, sebaiknya dicatat.
 Volume sampel yang digunakan dalam analisis harus dicatat (A ml) dan sampel dicampur secara menyeluruh untuk
menangguhkan kembali bahan yang disimpan. Tindakan ini dapat menghasilkan aerosol yang mengandung Legionella.
 Sampel kemudian harus didiamkan selama periode waktu yang tepat untuk memungkinkan penyebaran aerosol yang
terbentuk sebelum prosedur pemekatan dilakukan.

b)Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil metode

Volume sampel yang dianalisis dan tingkat konsentrasi yang diperlukan tergantung pada kekeruhan air, batas deteksi yang
diperlukan, dan tujuan pengambilan sampel. Pedoman saat ini di Inggris menetapkan batas kewaspadaan dan tindakan berdasarkan
jumlah Legionella yang disebutkan dari 100 unit pembentuk koloni (cfu) per liter. Oleh karena itu, tingkat konsentrasi harus
memungkinkan setidaknya 100 cfu dalam satu liter sampel dapat dideteksi.
 Jika sampel dikumpulkan dari tempat di mana orang berisiko lebih besar terkena infeksi Legionella, seperti layanan
kesehatan, mungkin ada persyaratan metode pemeriksaan untuk memiliki batas deteksi yang lebih rendah.
 Ketika langkah konsentrasi digunakan, mikroorganisme yang tidak dapat ditarik kembali karena menempel pada filter
membran atau sisi tabung sentrifus dapat mengurangi pemulihan. Selain itu, sebagian dari populasi sasaran mungkin tidak
dapat dibudidayakan (terbunuh atau rusak parah) sebagai akibat dari prosedur selektif.
 Resusitasi dan kulturabilitas Legionella juga bergantung pada penghambatan interferensi dari mikro organisme lain dan
untuk alasan inilah penggunaan senyawa antimikroba dalam media selektif, perlakuan sebagian sampel dengan asam atau
panas diperlukan.

10
 Kadang-kadang perlu untuk menguji ulang sampel. Ini mungkin karena gangguan dari organisme latar lebih besar dari yang
diperkirakan, atau jumlah Legionella lebih tinggi dari yang diharapkan, atau jenis Legionella tertentu dicari dalam
penyelidikan wabah. Dengan demikian, volume sampel yang dikumpulkan dan volume konsentrat akhir yang digunakan
dalam pemeriksaan harus cukup untuk memungkinkan pengujian ini dilakukan.
 Jika diperlukan untuk mendeteksi sejumlah kecil organisme, hal ini dapat dicapai dengan melakukan dua atau lebih langkah
konsentrasi. Namun, ini akan mengurangi pemulihan keseluruhan organisme karena kerugian yang dihadapi pada setiap
tahap.
 Volume sampel yang dikumpulkan untuk pemeriksaan idealnya adalah 1000 ml. Namun, volume yang lebih kecil dapat
diterima dengan batas deteksi yang lebih rendah, terutama bila hasil sampel tersebut diinterpretasikan oleh ahli mikrobiologi
yang berpengalaman.
 Tujuan dari volume sampel yang lebih kecil dapat meliputi: Kekeruhan tinggi, Sampel pre flush dari outlet volume kecil,
Dimana volume yang lebih besar akan mengencerkan konsentrasi sampel bakteri. Volume yang diperiksa harus dicatat.
 Konsentrasi organisme dari sampel air dapat dilakukan dengan filtrasi membran atau sentrifugasi atau dengan kombinasi
kedua teknik tersebut. Sentrifugasi mungkin diperlukan untuk sampel air yang sulit disaring. Ini mungkin terjadi pada sampel
yang terlihat keruh atau keruh, mengandung bahan koloid atau terkontaminasi dengan minyak atau zat hidrofobik lainnya.
Sampel air dengan jumlah bakteri non-Legionella yang tinggi dapat diencerkan dengan larutan Ringer 1:40 (No.1) atau
larutan garam Page (No.2). Volume sampel yang diencerkan atau diproses harus dicatat
 Konsentrasi yang diikuti dengan penempatan filter membran langsung pada agar mungkin sesuai jika sampel cenderung
mengandung tingkat mikroorganisme pengganggu yang lebih rendah dan diperlukan batas deteksi yang lebih rendah. Filtrasi
dan transfer membran langsung memperoleh batas deteksi yang lebih rendah dari 1 unit pembentuk koloni (cfu) per volume
sampel yang dianalisis.

11
  Dengan inokulasi langsung sampel ke media tanpa konsentrasi, dimungkinkan untuk mendeteksi satu cfu dalam volume yang
ditempatkan pada media kultur. Volume sampel yang diinokulasikan ke media biasanya tidak melebihi 0,5 ml. Jika tahap
konsentrasi tidak digunakan, batas deteksi, dengan asumsi pemulihan 100%, akan menjadi sekitar 5000 cfu per liter.
Kenyataannya, pemulihan jarang mencapai 100%.

c) Filtrasi membran
Untuk volume hingga 1000 ml, penyaringan vakum dapat digunakan. Kadang-kadang, lebih dari satu filter mungkin diperlukan dan
eluat digabungkan (15). CATATAN: Filtrasi tekanan positif kurang nyaman daripada sentrifugasi atau filtrasi vakum dan lebih cocok
untuk volume besar (biasanya lebih besar dari 1000 ml) dan untuk sampel dengan kekeruhan/partikulat tinggi tetapi dapat
menyebabkan pemulihan yang lebih buruk.

d) Elusi sampel dari filter membran

Ketika sampel telah disaring, suspensi organisme yang tertahan pada filter harus disiapkan. Volume (biasanya 5 – 10 ml) larutan elusi
steril (Larutan garam page’s) ditambahkan ke filter membran dalam wadah steril. Volume larutan elusi yang lebih besar mungkin
diperlukan untuk memastikan cakupan penuh dari filter membran.
Berbagai teknik elusi tersedia pada permukaan filter membran. Filter membran dapat digosok atau dipijat di dalam kantong
stomacher yang berisi larutan elusi. Sebagai alternatif, dengan menggunakan pengikis kultur jaringan steril, permukaan filter
membran dapat dikerok dan organisme dipindahkan ke dalam volume kecil larutan elusi steril. Selain itu, filter membran dapat
divorteks, dikocok dengan kuat, atau diultrasonikasi dalam volume kecil larutan elusi steril.Teknik yang digunakan untuk
meresuspensi organisme dari filter harus diverifikasi keefektifannya oleh laboratorium penguji. Suspensi kemudian dapat dibiakkan
secara langsung, atau dipekatkan lebih lanjut dengan sentrifugasi (A.10.2.2.6) dan kemudian dibiakkan.

12
Berikut macam-macam metode elusi permukaan filter membran dan deskripsi nya

No. Metode Elusi Deskripsi

1. Elusi dengan ultrasonikasi Ultrasonikasi filter membran umumnya digunakan untuk
menghilangkan endapan dari filter membran. Filter membran harus
ditempatkan dalam wadah steril dengan pengencer steril. Perawatan
harus diambil untuk memastikan bahwa pengencer menutupi
membran. Wadah harus ditempatkan dalam penangas ultrasonik
untuk memastikan bahwa air berada pada ketinggian yang sama atau
lebih tinggi dari pengencer dalam wadah. Waktu harus diverifikasi
oleh laboratorium. Frekuensi rendaman ultrasonik dari berbagai
produsen dapat bervariasi
2. Elusi dengan cara dikocok Membran harus ditempatkan dalam wadah steril dengan volume
pengencer yang cukup untuk menutupi membran (dengan atau tanpa
manik-manik kaca). Wadah harus dikocok setidaknya selama dua
menit tetapi waktu yang optimal harus diverifikasi oleh laboratorium
3. Elusi dengan menggosok Ke kantong plastik kecil untuk makanan, tambahkan volume larutan
elusi yang dibutuhkan. Catat volumenya (B ml). Menggunakan forsep
steril, pindahkan filter membran ke salah satu
sudut bawah tas.
Dari bagian luar kantong stomacher, pijat atau gosok filter membran
selama minimal 30 detik dengan menggunakan larutan elusi untuk
memfasilitasi resuspensi bahan sisa yang diendapkan. Waktu optimal
harus diverifikasi oleh laboratorium. Semua bahan yang disaring harus
dikeluarkan dari filter membran untuk menghasilkan suspensi
homogen yang tercampur dengan baik.
Dengan menggunakan pipet steril, pindahkan suspensi secara
kuantitatif dari kantong stomacher ke wadah yang sesuai.
Menangguhkan kembali residu deposit dan menghasilkan suspensi
homogen dengan vortex mencampur isi wadah. Suspensi ini
merupakan konsentrat sampel akhir dan, karena prosedur transfer
mungkin sedikit lebih kecil dari B ml asli.
4. Elusi dengan pengikisan Sebagai alternatif, dengan menggunakan forceps steril, lepas filter

13
 membran dari dudukan filter, dan tempatkan filter dalam cawan Petri
steril dengan ukuran yang sesuai (biasanya cawan Petri berdiameter
60 mm untuk filter membran 47 mm). Ke cawan Petri, tambahkan
volume larutan elusi dan, dengan menggunakan pengikis kultur
jaringan steril, keluarkan semua bahan yang disaring dari filter
membran dengan menggoreskan filter secara perlahan ke dalam
larutan elusi. Pengikisan harus dilakukan setidaknya dua kali di
seluruh filter membran dan berlawanan arah. Suspensi yang
dihasilkan kemudian harus dipindahkan ke tabung steril. Mungkin
perlu membilas cawan Petri dengan larutan elusi tambahan dan
memindahkan hasil cucian ke dalam tabung. Catat volume (B ml)
suspensi, yang merupakan konsentrat sampel akhir.
5. Elusi dengan vortexing Deposit juga dapat dielusi dari filter membran dengan pencampuran
vortex yang kuat. Filter membran harus dipindahkan langsung ke
wadah steril bertutup ulir yang sesuai dan, jika perlu, menggunakan
gunting steril, potong filter membran menjadi potongan-potongan
berukuran sesuai. Volume larutan elusi yang diketahui (X ml)
kemudian harus ditambahkan ke wadah yang dicampur dengan vortex
untuk menghasilkan suspensi yang homogen. Suspensi ini merupakan
konsentrat sampel akhir.
6. Konsentrasi menggunakan sentrifugasi Konsentrasi dengan sentrifugasi dapat memberikan tingkat pemulihan
yang jauh lebih rendah daripada teknik filtrasi membran, tetapi
mungkin diperlukan untuk sampel yang tidak dapat disaring. Volume
sampel (Xml, biasanya tidak kurang dari 200 ml) yang digunakan
dalam analisis harus dikocok untuk menangguhkan kembali partikel
apa pun dan sampel yang dihomogenisasi dihasilkan yang kemudian
harus didiamkan selama jangka waktu yang sesuai untuk
memungkinkan penyebaran aerosol yang terbentuk sebelum
dipindahkan ke tabung sentrifus yang sesuai. Suspensi kemudian
disentrifugasi pada 6000 g selama 10 menit (atau 3000 g selama 30
menit) dengan mempertahankan suhu antara 15 - 25 °C. Setelah
sentrifugasi, cairan supernatan bening yang cukup harus dikeluarkan
(dan dibuang). Suspensikan kembali sisa endapan dan hasilkan
suspensi yang dihomogenisasi dengan mencampurkan isi tabung

14
 sentrifus dengan vortex, volume akhir yang dihasilkan harus dicatat.
Suspensi ini merupakan konsentrat sampel akhir.
Jika centrifuge tidak memiliki kapasitas untuk memproses volume
yang dibutuhkan maka mungkin perlu membagi sampel menjadi
beberapa alikuot. Konsentrat kemudian harus digabungkan dan
volume akhir dicatat.
8. Konsentrasi lebih lanjut dengan sentrifugasi Jika suspensi akan dipekatkan lebih lanjut dengan sentrifugasi,
pindahkan suspensi dari kantong stomacher atau wadah lain langsung
ke tabung sentrifus. Volume akhir harus direkam. Centrifuge suspensi
pada 6000 g selama 10 menit (atau 3000 g selama 30 menit).
Keluarkan tabung dengan hati-hati dari centrifuge dan gunakan pipet
steril, tarik (dan buang) cairan supernatan bening yang cukup untuk
menyisakan volume yang diketahui (B ml, biasanya 1 - 2 ml).
Suspensikan kembali sisa endapan dan hasilkan suspensi yang
dihomogenkan dengan mencampurkan isi tabung sentrifus dengan
pusaran. Suspensi ini merupakan konsentrat sampel akhir.
9. Penyimpanan konsentrat dan suspensi penyeka, sedimen Untuk meminimalkan perubahan jumlah bakteri yang layak dalam
dan endapan lainnya analisis konsentrat tidak boleh lebih dari dua hari dari pengambilan
sampel. Kondisi penyimpanan harus antara 6 °C hingga 20 °C dan
dalam gelap. Namun laboratorium harus memverifikasi bahwa kondisi
penyimpanan yang dipilih dengan tepat menghindari perubahan yang
tidak diinginkan pada hasil analitis.
Untuk penyelidikan wabah atau tujuan epidemiologis, setelah kultur,
bagian konsentrat, sedimen atau suspensi biofilm yang tidak
digunakan dapat disimpan untuk referensi di masa mendatang, tetapi
tidak boleh disimpan lebih dari 3 bulan. Disimpan dalam kondisi ini,
organisme Legionella yang tertekan dapat dipulihkan kemudian.
Pengujian ulang konsentrat yang disimpan mungkin penting ketika
menyelidiki wabah penyakit Legionnaires, atau misalnya - jika jumlah
organisme Legionella yang tinggi atau pertumbuhan konfluen dari
koloni non Legionella diamati segera setelah inkubasi)

10. Kultur Bagilah sampel (pekat atau tidak pekat), menjadi tiga bagian. Gunakan
satu porsi tanpa perawatan lebih lanjut. Perlakukan dua porsi lainnya

15
 sesuai, satu dengan perlakuan panas dan satu lagi dengan perlakuan
asam.
11. Treatmen dengan Panas Tambahkan sedikitnya 0,15 ml konsentrat sampel, suspensi sampel
atau sampel tidak pekat ke wadah steril. Tempatkan wadah dalam
penangas air pada suhu 50 ± 1 °C selama 30 ± 2 menit
12. Treatment dengan asam Untuk sampel yang diproses dengan pemekatan dan elusi, larutan
penyangga asam pekat 2 kali dapat digunakan yang diencerkan
dengan volume yang sama dari konsentrat atau suspensi. Inkubasi
selama 5 ± 0,5 menit. Volume akhir yang diinokulasikan ke media
pertumbuhan perlu digandakan untuk mempertahankan batas deteksi
yang sama seperti untuk bagian panas dan bagian yang tidak diberi
perlakuan.
13. Inokulasi media selektif Inokulasikan cawan Petri terpisah dari agar selektif untuk setiap
bagian dengan volume yang diketahui (V ml, biasanya 0,1 - 0,5 ml)
sampel atau konsentrat sampel.
Untuk sampel yang diberi perlakuan asam, perlu menginokulasi dua
kali lipat volume konsentrat sampel untuk mencapai tingkat deteksi
yang sama dengan sampel yang tidak diberi perlakuan atau diberi
perlakuan panas, atau faktor pengenceran 2-1 perlu diperhitungkan
dalam perhitungan hasil.
Dengan penyebar jenis "tongkat hoki" plastik steril, distribusikan
inokulum cair ke seluruh permukaan agar. Setelah inokulasi, cawan
Petri harus didiamkan pada suhu kamar sampai volume inokula
terserap ke dalam agar. Lebih besar volume inokulum akan
membutuhkan waktu lebih lama agar inokulum dapat menyerap ke
dalam agar sebelum pelat dibalik untuk inkubasi.
14. Inkubasi Cawan Petri kemudian dibalik dan diinkubasi pada suhu 36,0 ± 1,0 °C
selama 10 hari. Sepanjang inkubasi, suasana lembab harus
dipertahankan. Hal ini dapat dicapai dengan berbagai cara, misalnya;
inkubasi dalam wadah tertutup atau tas atau dengan menempatkan
wadah air di dalam inkubator. Wadah air dalam inkubator dapat
terkontaminasi, misalnya dengan Legionella atau jamur, dan
karenanya harus dibuang secara berkala atau didesinfeksi.
15. Eximination of plates Pada interval yang sesuai, biasanya 2 - 3 hari (misalnya hari 3, 7 dan

16
 10), selama masa inkubasi 10 hari, cawan Petri harus dikeluarkan dari
inkubator dan media diperiksa pertumbuhannya. Idealnya, mikroskop
binokular dengan cahaya miring harus digunakan karena sangat sulit
untuk mengidentifikasi Legionella dengan mata telanjang. Koloni
Legionella seringkali berwarna putih keabu-abuan-biru-ungu, tetapi
bisa berwarna coklat, merah muda, hijau atau merah tua. Koloni halus
dengan seluruh tepi dan sebagian besar akan menunjukkan
penampilan kaca tanah yang khas (Gambar 1). Beberapa spesies
Legionellae mungkin tidak menghasilkan koloni ground-glass yang
khas pada isolasi primer.

7. Konfrimasi dan identifikasi

Berbagai metode tersedia untuk konfirmasi dan identifikasi organisme Legionella. Metode ini mungkin termasuk yang berikut, tetapi
laboratorium harus memverifikasi keefektifan pendekatan yang dipilih:

No. Metode Konfirmasi dan Identifikasi Uraian

1. Konfirmasi dengan Sub-kultur Koloni presumtif dari lempeng dengan jumlah tertinggi (setidaknya tiga
koloni dari setiap jenis morfologi) dan, jika sesuai (jika morfologi koloni
berbeda terdapat pada lempeng yang berbeda), setidaknya tiga koloni
dari masing-masing dari tiga lempeng (tanpa perlakuan, panas diberi
perlakuan, diberi perlakuan asam) harus disubkulturkan ke dalam dua
cawan Petri terpisah dari media (BCYE) dan (BCYE-cys).
Media alternatif untuk agar ekstrak ragi arang yang disangga tanpa
media Lcysteine (BCYE-cys) terdiri dari 4% agar darah kuda atau agar
nutrisi sebagaimana dirinci dalam ISO 11731. Setelah diinkubasi selama
2 - 3 hari pada suhu 36 ± 1,0 °C cawan Petri harus dikeluarkan dari
inkubator dan media diperiksa pertumbuhannya. Koloni yang hanya
tumbuh pada agar ekstrak ragi arang yang disangga dengan media L-
sistein (BCYE) dianggap sebagai organisme Legionella, dan koloni yang
tumbuh pada kedua media dianggap sebagai organisme non-Legionella.
Diasumsikan bahwa pemilihan koloni yang hati-hati akan menghasilkan

17
 subkultur murni pada kedua media, namun terkadang hal ini tidak
terjadi. Ini adalah praktik yang baik untuk memeriksa pelat di bawah
mikroskop untuk memastikan bahwa sampel yang tidak dikonfirmasi di
legionella bukan karena kesalahan pelapisan dari isolat campuran.
2. Aglutinasi lateks Koloni yang tumbuh di hadapan L-sistein dapat diuji lebih lanjut
menggunakan kit aglutinasi lateks berbasis antibodi yang tersedia
secara komersial. Kit ini biasanya dapat membedakan antara Legionella
pneumophila serogrup 1, serogrup 2 –15, atau dapat membedakan lebih
jauh ke serogrup individual. Beberapa kit juga dapat mengidentifikasi
spesies Legionella lainnya tetapi kit tersebut mungkin tidak
mengidentifikasi semua spesies Legionella. Dalam beberapa kasus,
identitas koloni sebagai organisme Legionella tertentu dapat dipastikan.
Prosedur yang dijelaskan dalam manual pabrikan harus diikuti.
3. Spektrometri Massa - MALDI-ToF Desporasi Matrix-assisted laser dan metode ionisasi time-of-flight pada
spektrometri massa (MALDIToF) adalah metode konfirmasi yang cepat
(~10 menit) dan sangat sensitif.
Beberapa platform tersedia dari penyedia berbeda yang bekerja dengan
prinsip serupa. Sejumlah kecil biomassa (biasanya diambil dari koloni
murni yang diisolasi pada pelat agar) ditotolkan ke pelat target dan
dilapisi dengan matriks organik. Pea-treatment sampel tambahan
mungkin diperlukan sebelum ditotol pada plat. Laboratorium harus
mengacu pada protokol yang direkomendasikan pabrikan. Matrix-
assisted laser menyinari sampel, memicu desorpsi dan ionisasi. Molekul
dipisahkan oleh rasio massa terhadap muatan dan terdeteksi, target
utamanya adalah protein ribosom.
Dengan membandingkan informasi ini yang dikumpulkan di detektor
dengan standar kalibrasi, dimungkinkan untuk menghitung massa
molekul yang terkait dengan puncak tertentu, dan mengukur intensitas
relatif puncak tersebut. Data ini kemudian dibandingkan dengan basis
data spektrum (biasanya dari pabrik atau basis data internal yang
divalidasi oleh laboratorium penguji) dan identifikasi organisme serta
skor kepercayaan terkait dihasilkan.
MALDI-ToF telah berhasil digunakan untuk mengidentifikasi isolat
Legionella dari sampel lingkungan dan klinis . Keuntungan tambahan

18
 MALDI-ToF adalah dapat mengidentifikasi spesies Legionella yang saat
ini tidak dapat diidentifikasi ke tingkat spesies dengan teknik
konfirmasi tradisional.
Namun, laboratorium harus memperhatikan bahwa MALDI-ToF saat ini
tidak dapat membedakan serogrup Legionella yang berbeda,(mis.
Serogrup Legionella pneumophila vs. Serogrup Legionella pneumophila).
4. Amplifikasi DNA dengan polymerase chain reaction (PCR) Amplifikasi DNA dengan polymerase chain reaction (PCR) juga dapat
digunakan untuk konfirmasi cepat koloni Legionella pneumophila dan
Legionella spp. Hal ini dapat dicapai dengan PCR titik akhir konvensional
atau PCR kuantitatif waktu nyata (qPCR). Primer khusus (dan probe
untuk qPCR) memungkinkan konfirmasi yang jelas dicapai hanya dalam
beberapa jam. Resolusi dapat dilakukan dengan elektroforesis (PCR titik
akhir klasik) dan/atau sinyal neon (qPCR).
Prosedurnya terdiri dari menyiapkan larutan dari masing-masing dugaan
morfologi dalam larutan salin buffer fosfat (PBS) atau air suling steril
(SDW). Dari larutan ini DNA diekstraksi dan dimurnikan dengan teknik
yang berbeda, berdasarkan fisik (misalnya siklus pembekuan dan
pencairan, atau pemukulan manik), kimia (misalnya buffer guanidine
thiocyanate) atau pencernaan enzimatik.
Langkah selanjutnya terdiri dari persiapan campuran reaksi di mana DNA
yang diekstraksi dicampur dalam tabung atau pelat PCR dengan
campuran utama yang mengandung DNA24 polimerase, primer spesifik,
deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) dan pemeriksaan qPCR dalam
buffer reaksi yang dioptimalkan. Akhirnya campuran reaksi ini
dimasukkan ke dalam termosikler untuk menjalankan amplifikasi.
5. Direct fluorescent antibody (DFA) Antibodi fluoresen langsung (DFA) adalah teknologi imunologi di mana
antigen Legionella spesifik ditargetkan oleh antibodi berlabel pewarna
fluoresen. Kemudian kompleks antibodi-antigen dideteksi dengan
memaparkan sinar ultra violet atau biru violet, yang menyebabkan biru
kehijauan atau fluoresensi kuning-hijau.
Pilih koloni yang tumbuh pada agar ekstrak ragi arang dengan media L-
cysteine, tidak tumbuh pada agar tanpa L-cysteine dan dianggap sebagai
Legionella dan siapkan suspensi ringan (1 McFarland Standard) dari
setiap koloni untuk diuji, dalam 3 ml air suling steril, larutan garam

19
penyangga fosfat atau formalin netral 1%. Suspensi harus terlihat
dengan mata telanjang.
Tambahkan 10µl suspensi biakan ke dalam jumlah lubang yang sesuai
(bergantung pada jumlah reagen dalam kit yang digunakan) slide cetak
Polytetrafluoroethylene (PTFE) multi-well glass yang bersih. Tambahkan
kira-kira 10µl reagen kontrol positif ke satu sumur dan reagen kontrol
negatif ke sumur lainnya. Keringkan slide dengan udara (dapat
dihangatkan hingga suhu antara 35°C dan 45°C dalam inkubator).
Perbaiki slide yang telah disiapkan dengan pemanasan lembut dalam api
Bunsen atau perendaman dalam aseton selama 10 menit diikuti dengan
pengeringan di udara.
Tambahkan 5 µl dari setiap anti serum monoklonal ke masing-masing
sumur yang sesuai dan 5 µl reagen kontrol polivalen (termasuk anti
serum poliklonal) ke sumur dengan kontrol positif dan negatif dan
pindahkan kaca objek ke dalam wadah lembab yang sesuai, misalnya
kotak yang berisi cairan lembab. Tutupi wadah untuk menghindari
paparan cahaya dan inkubasi selama 20 hingga 30 menit pada suhu yang
ditentukan oleh produsen reagen.
Setelah inkubasi, cuci slide untuk menghilangkan kelebihan antibodi
dengan merendamnya dalam air atau larutan salin buffer fosfat. Buang
larutan dan ulangi proses ini dua kali lagi dengan air tawar atau larutan
garam buffer fosfat.
Terakhir, keringkan slide pada suhu antara 35° - 50 °C.
Setelah kering, tambahkan beberapa tetes reagen media pemasangan
ke slide uji untuk menahan spesimen di antara kaca penutup dan slide
dan pasang kaca penutup, pastikan tidak ada gelembung yang
terperangkap di bawahnya. Menggunakan mikroskop fluoresensi,
periksa kaca objek yang diolesi minyak imersi untuk tujuan daya tinggi
(100X). Periksa sumur kontrol positif dan negatif terlebih dahulu untuk
memastikan bahwa tes tersebut valid. Slide dapat disimpan dalam gelap
sebelum pemeriksaan selama maksimal 24 jam.

20
8. Perhitungan
pedoman Inggris saat ini(5,6,7,8) menetapkan batas kewaspadaan dan tindakan untuk keberadaan legionella dalam satuan unit
pembentuk koloni per liter (cfu/L). Dengan menggunakan persamaan berikut, perkirakan jumlah dari organisme Legionella
dinyatakan sebagai cfu per liter air asli atau per satuan massa sedimen, dengan mempertimbangkan faktor konsentrasi, proporsi
sampel terkonsentrasi yang dianalisis dan jumlah maksimum koloni (untuk setiap tipe koloni yang dikonfirmasi) yang dihitung pada
salah satu dari ketiganya. Cawan petri yang diinkubasi:

21
Sebagai contoh:

a) Jumlah maksimum koloni yang dihitung pada sampel yang tidak diberi perlakuan adalah 45, volume sampel yang diambil
untuk analisis adalah 1000 ml, dan volume ini dipekatkan menjadi 10 ml, dan 0,5 ml diinokulasikan ke cawan Petri, maka
hasilnya, x (dinyatakan sebagai cfu per liter) diberikan oleh:

b) Jumlah maksimum koloni yang dihitung pada sampel yang diberi perlakuan panas adalah 21, volume sampel yang diambil
untuk analisis adalah 500 ml, dan volume ini dipekatkan menjadi 10 ml, dan 0,1 ml diinokulasikan ke cawan Petri, maka
hasilnya, x (dinyatakan sebagai cfu per liter) diberikan oleh:

Jika diperlukan juga untuk melaporkan hasil dalam volume sampel yang awalnya dianalisis (misalnya volume yang disaring),
persamaan berikut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah organisme Legionella yang dinyatakan sebagai cfu per
volume air asli (cfu/vol), ambil memperhitungkan proporsi sampel pekat yang dianalisis dan jumlah maksimum koloni (untuk
setiap jenis koloni yang dikonfirmasi) yang dihitung pada salah satu dari tiga cawan Petri yang diinkubasi. Volume yang
dianalisis juga harus dilaporkan:

22
Sebagai contoh:
a) Jumlah maksimum koloni yang dihitung pada sampel yang diberi perlakuan panas adalah 21, volume sampel yang diambil
untuk analisis adalah 500 ml, dan volume ini dipekatkan menjadi 10 ml, dan 0,1 ml diinokulasikan ke cawan Petri, maka
hasilnya, x (dinyatakan sebagai cfu/vol) diberikan oleh:

b) Jumlah maksimum koloni yang dihitung pada sampel yang tidak diberi perlakuan adalah 73, volume sampel yang diambil
untuk analisis adalah 700 ml, dan volume ini dipekatkan menjadi 10 ml, dan 0,5 ml diinokulasikan ke cawan Petri, maka
hasilnya, x (dinyatakan sebagai cfu/vol) diberikan oleh:

9. Expression Result
Tidak tepat untuk menghitung rata-rata jumlah yang diperoleh dari masing-masing dari tiga cawan Petri dari bagian sampel yang
tidak diberi perlakuan, diberi perlakuan asam atau diberi perlakuan panas. Hitungan ini berbeda dan bukan penentuan ulangan dari
satu proses perawatan. Sebagai kriteria pelaporan minimum, kehadiran (atau ketidakhadiran) Legionella pneumophila yang
dikonfirmasi dan dugaan kehadiran (atau ketidakhadiran) spesies Legionella lainnya harus dicatat. Ketiadaan spesies Legionella harus

23
dilaporkan sebagai “tidak terdeteksi dalam volume sampel yang diperiksa”. Selain itu, serogroup dari semua isolat Legionella
pneumophila yang teridentifikasi pada lempeng yang berbeda, idealnya, harus dilaporkan.

10. Quality Assurance

 Media QC
Instruksi untuk persiapan media harus dipatuhi dengan ketat. Stabilitas beberapa komponen media, khususnya garam kalium
α-ketoglutarat, dapat bervariasi antar batch. Oleh karena itu penting bahwa setiap kumpulan media diperiksa
kemampuannya untuk mendukung pertumbuhan spesies Legionella, khususnya Legionella pneumophila dan
ketidakmampuannya untuk mendukung pertumbuhan beberapa organisme latar belakang yang representatif. Contoh
spesies yang digunakan adalah Legionella pneumophila serogroup 1 dan Legionella anisa. Bakteri non-target (misalnya
Pseudomonas aeruginosa, E. coli dan Enterococcus faecalis) harus diuji untuk memastikan penghambatan parsial atau total
dan presentasi koloni tidak menyerupai koloni Legionella. Cawan petri harus diinkubasi sebagaimana mestinya dan
pertumbuhan koloni harus dimulai dalam dua sampai lima hari inkubasi. Agar-agar ekstrak ragi arang yang disangga dengan
media L-sistein (A9.3) harus digunakan sebagai pelat pembanding ""non-selektif" untuk penilaian pencacahan (16, 20).
Rincian lebih lanjut tentang QC Media lihat Mikrobiologi Air Minum Bagian 3 - Praktik dan prosedur untuk laboratorium dan
di BS EN ISO 11133 2014
 Analytical Quality control
Petunjuk tentang Pengendalian Mutu Internal diberikan di tempat lain dalam seri ini (16). Larutan Pages saline (A9.1) atau
Ringer 1:40 (A9.2) harus digunakan saat menyusun kembali kultur spesies Legionella, atau menyiapkan suspensi dan
pengenceran.

24
References
 Schulze-Robbecke R, Rodder M, Exner M. 1987. Multiplication and killing temperatures of naturally occurring legionellas.
Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [B] 184:495-500.
 Fitzgeorge RB, Baskerville A, Featherstone ASR. 1987. Fine particle aerosols in experimental Legionnaires disease: Their role
in infection and treatment, p. 357-360.
 Advances in Aerobiology: Proceedings of the third international conference on aerobiology. Birkhauser Verlag, Basel.
 Bencini MA, Yzerman EP, Koornstra RH, Nolte CC, den Boer JW, Bruin JP. 2005. A case of Legionnaires' disease caused by
aspiration of ice water. Arch. Environ. Occup. Health 60:302-306.
 Correia AM, Ferreira JS, Borges V, Nunes A, Gomes B, Capucho R, Goncalves J, Antunes DM, Almeida S, Mendes A,
Guerreiro M, Sampaio DA, Vieira L, Machado J, Simoes MJ, Goncalves P, Gomes JP. 2016. Probable Person-to-Person
Transmission of Legionnaires' Disease. N. Engl. J. Med. 374:497-498.
 Anonymous. 2013. Legionnaires' disease. The control of legionella bacteria in water systems.
http://www.hse.gov.uk/pubns/books/l8.htm.
 Anonymous. 2013. Legionnaires’ disease. Part 3. The control of legionella bacteria in other risk systems.
http://www.hse.gov.uk/pubns/books/hsg274.htm.
 Anonymous. 2014. Legionnaires’ disease. Part 1. The control of legionella bacteria in evaporative cooling systems.
http://www.hse.gov.uk/pubns/priced/hsg274part1.pdf
 Anonymous. 2014. Legionnaires’ disease. Part 2. The control of legionella bacteria in hot and cold water systems
http://www.hse.gov.uk/pUbns/priced/hsg274part2.pdf.
 Brindle RJ, Stannett PJ, Cunliffe RN. 1987. Legionella pneumophila: comparison of isolation from water specimens by
centrifugation and filtration. Epidemiol. Infect. 99:241-247.
 Anonymous. 2008. BS 7592:2008 Sampling for Legionella bacteria in water systems. Code of practice
https://shop.bsigroup.com/ProductDetail/?pid=000000000030161148.
 Boulanger CA, Edelstein PH. 1995. Precision and accuracy of recovery of Legionella pneumophila from seeded tap water by
filtration and centrifugation. Appl. Environ. Microbiol. 61:1805-1809.
 Anonymous. 2013. The Approved List of biological agents http://www.hse.gov.uk/pubns/misc208.pdf HMSO.
 Giglio S, Monis PT, Saint CP. 2005. Legionella confirmation using real-time PCR and SYTO9 is an alternative to current
methodology. Appl. Environ. Microbiol. 71:8944- 8948.

25
B. Deteksi dan pencacahan spesies Legionella dengan penyaringan, dengan transfer langsung ke media selektif

1. Prinsip
Mikroorganisme, termasuk Legionella, dalam sampel air harus dipekatkan dengan filtrasi membran. Hal ini bertujuan untuk
mengurangi pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan yang dapat menghambat pertumbuhan Legionella. Spesimen yang
telah pekat harus diberi perlakuan dengan asam. Selaput bagian uji kemudian dipindahkan ke cawan Petri yang berisi media agar
selektif (media GVPC) dan diinkubasi. Sampel sedimen, biofilm, dan endapan permukaan lainnya tidak cocok untuk metode ini,
tetapi pendekatan yang dijelaskan dalam Metode A mungkin lebih cocok.
Tujuan Pengujian
Filtrasi membran dengan metode transfer media secara langsung dapat digunakan dalam sampel air yang ditujukan untuk
penggunaan sehari-hari (misalnya air panas dan dingin, air yang digunakan untuk mencuci), untuk konsumsi manusia dan untuk air
mandi yang diolah (misalnya kolam renang). Ini sangat cocok untuk perairan yang diperkirakan mengandung Legionella dan
mikroorganisme lain dalam jumlah rendah. Karena pertumbuhan Legionella dapat dihambat oleh pertumbuhan berlebih dari bakteri
lain pada membran, metode ini hanya sesuai untuk air yang mengandung jumlah bakteri rendah. Metode ini tidak cocok untuk air
keruh; sampel dengan jumlah bakteri tinggi seperti air Cooling Tower. Oleh karena itu, tidak diperlukan sentrifugasi atau tahap
konsentrasi lainnya sebelum penyaringan. Pendekatan yang dijelaskan dalam Metode A lebih sesuai untuk jenis sampel ini

2. Peralatan Kerja Pendukung

26
 No. Peralatan Deskripsi
1. Filter membran untuk transfer membran langsung Merupakan suatu selulosa nitrat atau ester selulosa campuran,
ukuran pori 0,22 μm atau 0,45 μm dan diameter 47 mm.
CATATAN Filter membran hitam mungkin lebih baik untuk
mengamati koloni Legionella putih daripada filter membran
berwarna lebih terang
2. Alat filtrasi membran berbantuan vakum Alat filtrasi membran berbantuan vakum dan pompa vakum cocok
untuk filter membran dengan diameter 47 mm dan menyaring
volume air hingga 1 liter
3. Inkubator Inkubator mampu dipertahankan pada suhu 36,0 ± 1,0 °C. Inkubator
yang dilembabkan lebih disukai, tetapi penggunaan karbon dioksida
adalah opsional.
4. Mikroskop binokular berdaya rendah Merupakan alat dengan pembesaran minimal 6 kali, dan diterangi
dari atas dengan cahaya insiden miring.
5. Lampu ultraviolet Lampu ultraviolet, memancarkan cahaya dengan panjang gelombang
360 ± 20 nm.
6. Tang berujung halus.

3. Prosedur Analisis
a) Preparasi Sample Air

Di sebagian besar skenario pengujian, jumlah legionella dalam sampel air tertentu tidak diketahui. Jika sampel diketahui
mengandung legionella tingkat tinggi, sampel mungkin dipecah menjadi volume yang lebih kecil sebelum disaring. Volume total
sampel yang digunakan dalam analisis harus dicatat sebelum pemekatan dengan filtrasi.

Sebelum analisis, sampel harus dicampur dengan inversi lembut untuk menghasilkan larutan atau suspensi yang homogen sambil
meminimalkan pembentukan aerosol. Tindakan ini dapat menghasilkan aerosol yang mengandung Legionella. Sampel kemudian

27
harus didiamkan selama periode waktu yang tepat untuk memungkinkan penyebaran aerosol yang terbentuk sebelum prosedur
pemekatan dilakukan. CATATAN: Jika terlihat adanya pemisahan atau sedimentasi dalam sampel, sebaiknya dicatat.

b) Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil metode

Volume sampel yang dianalisis tergantung pada batas deteksi yang diperlukan, dan tujuan penyelidikan. Pedoman saat ini di Inggris
menetapkan batas kewaspadaan dan tindakan berdasarkan jumlah Legionella yang disebutkan dari 100 unit pembentuk koloni (cfu)
per liter. Oleh karena itu, volume yang dianalisis harus memungkinkan setidaknya 100 cfu dalam satu liter sampel untuk dideteksi.
Fasilitas seperti tempat perawatan kesehatan pada dasarnya berisi pasien yang rentan yang dianggap berada dalam kategori risiko
tinggi untuk infeksi Legionella. Sampel dari jenis fasilitas ini mungkin memerlukan metode yang memberikan batas deteksi yang lebih
rendah . Filtrasi dan transfer membran langsung memperoleh batas deteksi yang lebih rendah sebesar 1 cfu unit pembentuk koloni
(cfu) per volume yang dianalisis.

Volume sampel yang diuji idealnya 1000 ml dan jika volume sampel yang dianalisis lebih rendah karena kesulitan menyaring sampel,
kemungkinan tingkat Legionella yang tinggi, atau volume yang lebih rendah disediakan, maka volume tersebut harus dicatat dalam
laporan. Jika diperlukan untuk mendeteksi sejumlah kecil organisme, hal ini dapat dicapai dengan menyaring sampel dalam volume
yang lebih kecil, biasanya 100 ml dan 900 ml dan memindahkan membran ke pelat agar yang dipilih secara terpisah (Media GVPC) .
Ini akan mengurangi risiko kemungkinan interferensi dari organisme background, dan mengurangi kemungkinan tingginya jumlah
organisme Legionella yang mencapai batas penghitungan atas. Hasil dapat dilaporkan dari volume yang paling cocok atau jika
dihitung adalah nol volume gabungan.

c) Filtrasi membran

28
Saring volume air hingga 1000 ml, menggunakan penyaringan vakum. Kadang-kadang, lebih dari satu filter mungkin diperlukan dan
semua filter membran harus dipindahkan ke pelat agar terpisah (Dilakukan metode analisi kultur).

d) Treatment dengan Asam

Untuk meminimalkan pertumbuhan bakteri non-Legionella, perlakukan sampel dengan buffer asam langsung di corong filter sebagai
berikut :

 Setelah penyaringan sampel, tambahkan (30 ± 5) ml buffer asam di atas membran dan biarkan selama 5 menit.
 Buang buffer asam dengan penyaringan melalui membran dan cuci membran dengan menambahkan (20 ± 5) ml larutan
buffer yang sesuai (larutan ringer’s atau larutan garam page’s) dan tarik melalui filter membran, berhati-hatilah agar tidak
ada larutan yang digunakan untuk siram membran bersentuhan dengan area alat filtrasi yang sebelumnya tidak pernah
bersentuhan dengan buffer asam.
Catatan: volume sampel duplikat juga dapat diproses tanpa perlakuan asam jika diperlukan.

e) Kultur
Setelah dilakukan treatment selanjutnya melakukan kultur bakteri pada media yang telah dipilih sebagai berikut :

 Lepaskan corong dan pindahkan filter membran secara hati-hati dengan forsep steril dan letakkan (terbalik) di atas pelat
media selektif Legionella (Media GVPC).
 Pastikan tidak ada gelembung udara yang terperangkap di antara filter membran dan media.

29
  'Memutar' filter membran ke media meminimalkan kemungkinan gelembung udara terperangkap.
 Tutupi filter membran dengan tutup cawan Petri. Jika beberapa filtrasi dilakukan untuk sampel, filter membran harus
dipindahkan ke pelat agar terpisah.

f) Inkubasi
Cawan Petri kemudian harus dibalik dan diinkubasi pada suhu 36,0 ± 1,0 °C selama 10 hari. Sepanjang inkubasi, suasana lembab
harus dipertahankan. Hal ini dapat dicapai dengan berbagai cara, misalnya; inkubasi dalam wadah tertutup atau tas atau dengan
menempatkan wadah air di dalam inkubator. Wadah air dalam inkubator dapat terkontaminasi, misalnya dengan Legionella atau
jamur, dan karenanya harus dibuang secara berkala (dengan cara yang tepat) atau didesinfeksi.

g) Pemeriksaan plat hasil kultur

Pada interval yang sesuai, biasanya 2 - 3 hari (misalnya hari 3, 7 dan 10), selama masa inkubasi 10 hari, cawan Petri harus
dikeluarkan dari inkubator dan media diperiksa pertumbuhannya. Idealnya, mikroskop binokular dengan cahaya miring harus
digunakan karena sangat sulit untuk mengidentifikasi Legionella dengan mata telanjang. Koloni Legionella sering berwarna putih-
abu-abu-biru-ungu pada membran (Gambar1), tetapi mungkin berwarna coklat, merah muda, hijau atau merah tua. Koloni halus
dengan seluruh tepi dan sebagian besar akan menunjukkan penampilan kaca tanah yang khas di seluruh koloni saat ditanam di GVPC
secara langsung. Beberapa spesies Legionellae mungkin tidak menghasilkan koloni groundglass yang khas pada isolasi primer.

30
4. Perhitungan
Pedoman Inggris saat ini (5,6,7,8) menetapkan batas kewaspadaan dan tindakan untuk keberadaan legionella dalam satuan unit
pembentuk koloni per liter (cfu/L). Dengan menggunakan persamaan berikut, hitung jumlah organisme Legionella yang dinyatakan
sebagai cfu per liter air asli, dengan mempertimbangkan volume sampel yang dianalisis dan jumlah koloni (untuk setiap jenis koloni
yang dikonfirmasi) yang dihitung:

31
 Contoh :
a) 1 L sampel disaring ke cawan petri. Jumlah maksimum koloni dugaan yang dihitung pada sampel adalah 45, jumlah koloni
dugaan yang ditetapkan untuk konfirmasi adalah 5 dan jumlah koloni yang dikonfirmasi adalah 4. Maka hasilnya, 𝑥
(dinyatakan cfu per liter) diberikan oleh :

32
b) Sebanyak 100 ml sampel disaring ke dalam cawan petri. Jumlah maksimum koloni dugaan yang dihitung pada sampel adalah
37, jumlah koloni dugaan yang ditetapkan untuk konfirmasi adalah 5 dan jumlah koloni yang dikonfirmasi adalah 3. Maka
hasilnya, 𝑥 (dinyatakan cfu per liter) diberikan oleh :

Jika diharuskan juga untuk melaporkan hasil dalam volume sampel yang awalnya dianalisis (misalnya volume yang disaring),
hasilnya (𝑛) adalah jumlah total koloni yang terkonfirmasi dalam volume sampel air asli yang dianalisis. Ini dinyatakan
dalam satuan (cfu/vol) dan diwakili oleh persamaan berikut. Volume yang dianalisis juga harus dilaporkan:

Untuk contoh dengan menggunakan volume 100 ml seperti yang ditunjukan di atas, maka :

33
References
 Schulze-Robbecke R, Rodder M, Exner M. 1987. Multiplication and killing temperatures of naturally occurring legionellas.
Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [B] 184:495-500.
 Fitzgeorge RB, Baskerville A, Featherstone ASR. 1987. Fine particle aerosols in experimental Legionnaires disease: Their role
in infection and treatment, p. 357-360. In Thing A (ed.), Advances in Aerobiology: Proceedings of the third international
conference on aerobiology. Birkhauser Verlag, Basel.
 Bencini MA, Yzerman EP, Koornstra RH, Nolte CC, den Boer JW, Bruin JP. 2005. A case of Legionnaires' disease caused by
aspiration of ice water. Arch. Environ. Occup. Health 60:302-306.
 Correia AM, Ferreira JS, Borges V, Nunes A, Gomes B, Capucho R, Goncalves J, Antunes DM, Almeida S, Mendes A,
Guerreiro M, Sampaio DA, Vieira L, Machado J, Simoes MJ, Goncalves P, Gomes JP. 2016. Probable Person-to-Person
Transmission of Legionnaires' Disease. N. Engl. J. Med. 374:497-498.
 Anonymous. 2013. Legionnaires' disease. The control of legionella bacteria in water systems.
http://www.hse.gov.uk/pubns/books/l8.htm.

34
  Anonymous. 2013. Legionnaires’ disease. Part 3. The control of legionella bacteria in other
risk systems. http://www.hse.gov.uk/pubns/books/hsg274.htm

C. Deteksi dan pencacahan Legionella pneumophila dengan substrat diagnostik teknik nomor yang paling mungkin

1. Prinsip
Organisme ditumbuhkan dalam media biakan cair yang mengandung substrat untuk deteksi spesifik L. pneumophila. Sampel air
minum dievaluasi untuk nilai kekerasan total menggunakan strip celup. Kekerasan kemudian dinetralkan dengan suplemen yang
disediakan. Media dehidrasi dilarutkan dalam 100 ml sampel yang dinetralkan kekerasannya, atau pengenceran sampel, yang
kemudian ditambahkan ke kantong reaksi 96 sumur. Ini kemudian disegel dan diinkubasi pada suhu 39 ° C selama 7 hari dengan
adanya kelembaban. Jika, di dalam kantong, beberapa lubang tidak menunjukkan pertumbuhan pada media setelah inkubasi,
sedangkan lubang lainnya menunjukkan beberapa pertumbuhan yang ditandai dengan pewarnaan coklat dan/atau kekeruhan, maka

35
jumlah Legionella pneumophila yang paling mungkin dalam 100 ml sampel adalah diperkirakan dari tabel probabilitas yang sesuai,
(Terdapat di bagian lampiran rangkuman ini ) dan tiidak diperlukan konfirmasi lebih lanjut.

2. Batasan Pengukuran
Metode ini hanya untuk mendeteksi Legionella pneumophila. Tidak semua biosida mengenali zat penetral dan jika ada, mereka akan
terus mengerahkan efek bakterisidalnya setelah pengambilan sampel. Kegagalan untuk menetralkan biosida dapat mengakibatkan
hasil negatif palsu atau perkiraan jumlah L. pneumophila yang ada dalam sampel terlalu rendah. Oleh karena itu, wadah sampel
harus berisi penetral yang sesuai jika tersedia dan catatan biosida dan bahan penetral yang disimpan disimpan untuk
mengontekstualisasikan hasil pemeriksaan yang dilakukan.
Secara umum dapat diasumsikan bahwa jumlah sebenarnya mungkin lebih tinggi secara signifikan karena rumpun sel L.
pneumophila akan menghasilkan reaksi positif dengan baik, seperti halnya sel tunggal. Bila dilihat dalam konteks persentase
pemulihan yang dicapai dengan metode mikrobiologi, jumlah Legionella pneumophila yang sebenarnya dalam sampel air biasanya
lebih tinggi daripada yang terdeteksi menggunakan metode kultur.
3. Peralatan Kerja Pendukung
Peralatan laboratorium standar harus digunakan yang sesuai dengan kriteria kinerja yang diuraikan. Beberapa peralatan tercantum
khusus untuk metode ini dan peralatan lain yang mungkin diperlukan diantaranya:

No. Peralatan Deskripsi

1. Botol sample Steril Botol sampel steril dengan volume yang sesuai, terbuat dari bahan
yang sesuai, mengandung zat penetral natrium tiosulfat pentahidrat
yang cukup untuk memberikan konsentrasi akhir dalam sampel tidak
kurang dari 18 mg/l (misalnya, 0,1 ml larutan 1,8 % m/v
Na2S2O3.5H2O per 100 ml sampel, atau setara).
2. Inkubator Inkubator dengan bantuan non-kipas, mampu mempertahankan
suhu 39,0 ±0,5°C
3. Botol plastik steril Botol plastik 100 ml steril seperti yang dipasok oleh produsen sistem

36
 uji atau setara yang sesuai.
4. Kantong Reaksi MPN Kantong reaksi MPN seperti yang dipasok oleh pabrikan (misalnya,
sistem 96-sumur) dan peralatan penyekat panas terkait.
5. Komparator warna dan fluoresensi Komparator warna dan fluoresensi seperti yang disediakan oleh
pabrikan.

4. Media dan Reagent

Berbagai formulasi media dan reagen untuk metode ini mungkin tersedia secara komersial, tetapi formulasinya belum dimasukkan
dalam data publikasi yang dirujuk sehingga belum ada rujukan yang valid untuk cara pembuatan reagent dan media ini secara
mandiri. Formulasi komersial harus digunakan dan disimpan sesuai dengan instruksi pabriknya. Kinerja semua media dan reagen
harus diverifikasi sebelum digunakan . Variasi dalam penyiapan dan penyimpanan media juga harus diverifikasi. Air harus disuling,
dideionisasi atau kualitas serupa. Kecuali dinyatakan lain, konstituen kimia harus ditambahkan sebagai garam anhidrat.

No. Nama Reagen Deskripsi

1. Reagen Legiolert™ Reagen ini adalah formulasi yang tersedia secara komersial yang

37
 tersedia dalam format kemasan blister dan cocok untuk sampel
tunggal. Reagen adalah formulasi yang ditentukan secara nutrisional
dengan substrat kromogenik untuk deteksi spesifik diagnostik enzim
untuk Legionella pneumophila. Untuk penghitungan MPN, reagen
harus digunakan bersamaan dengan kantong reaksi 96 sumur
QuantiTray®/Legiolert™ karena kantong Quanti-Tray® lainnya tidak
memungkinkan transfer oksigen yang diperlukan
2. Suplemen Legiolert™ Suplemen Legiolert adalah kit yang tersedia secara komersial yang
berisi dua item. Item pertama adalah tabung uji dalam format strip
celup yang dirancang untuk menentukan dengan cepat kekerasan
total kalsium/magnesium dalam sampel air minum. Item kedua
disediakan sebagai bubuk dalam bejana 100 ml, yang dilarutkan
dalam air deionisasi steril dan merupakan unit multidosis. Strip
kekerasan digunakan untuk mengklasifikasikan kekerasan total
sampel sebagai rendah atau tinggi, dan larutan suplemen
ditambahkan pada salah satu dari dua tingkat berdasarkan kekerasan
yang ditentukan.

5. Prosedur Analisis
a) Preparasi Sampel
 Volume, dan setiap pengenceran, sampel harus dipilih sehingga jumlah Legionella pneumophila per sampel berada dalam
kisaran penghitungan kantong reaksi MPN - jika memungkinkan, antara 1 dan 2273.
 Untuk air olahan, proses 100 ml sampel . Saat menyiapkan pengenceran, gunakan pengencer steril (misalnya, air deionisasi,
buffer fosfat/Butterfield, atau pepton 0,1%).

38
 Menggunakan strip celup kekerasan (misalnya, Aquadur®, Macherey-Nagel, Durën, Jerman) menentukan apakah sampel
memiliki kekerasan rendah atau tinggi (skor 0 – 2, yaitu ≤ 14°d, dianggap sebagai indikasi kekerasan rendah dan skor 3 – 4,
yaitu > 14°d, sebagai indikasi kekerasan tinggi).
 Untuk air dengan kesadahan rendah, tambahkan 0,33 ml suplemen Legiolert™ per 100 ml sampel
 Untuk air dengan kesadahan tinggi, tambahkan 1,0 ml suplemen Legiolert™ per 100 ml sampel.
 Untuk semua pengenceran 10 kali lipat atau lebih, uji kekerasan dan langkah netralisasi kekerasan dihilangkan, karena
kekerasan sampel secara efektif diencerkan.

b) Pengolahan sampel
 Sampel (biasanya 100 ml), atau pengenceran yang sesuai, dituang ke dalam botol steril. Saat membuat pengenceran,
pengencer steril (misalnya air deionisasi, buffer fosfat/Butterfield, atau pepton 0,1%) harus ditambahkan ke bejana steril
tanpa natrium tiosulfat.
 Mengikuti instruksi pabriknya, isi dari satu kemasan blister media kemudian ditambahkan secara aseptik.
 Setelah menutup botol, isinya diaduk untuk memastikan pembubaran media.
 Isi botol kemudian ditambahkan ke kantong reaksi MPN, yang kemudian diketuk atau dijentikkan perlahan untuk
mengeluarkan gelembung udara.
 Kantung tersebut kemudian disegel dalam peralatan yang disediakan oleh pabrikan untuk menghasilkan kantung reaksi 96
sumur. Waktu antara inokulasi kantong reaksi dan awal tahap inkubasi harus sesingkat mungkin dan tidak lebih dari 2 jam.
Setiap batch tes harus disertai dengan kantong yang diinokulasi dengan air steril yang dicampur dengan reagen Legiolert.
 Kantung reaksi MPN tersegel kemudian diinkubasi dengan sisi kertas menghadap ke bawah/sisi tegak ke atas pada suhu 39 ±
0,5°C selama 7 hari. Kantung reaksi dapat ditumpuk dalam arah bolak-balik untuk stabilitas yang lebih baik. Inkubator harus

39
 dilembabkan, atau kantong reaksi diinkubasi dalam wadah yang sesuai untuk menjaga kelembapan. Baki dapat diperiksa
selama masa inkubasi tetapi tidak boleh dikeluarkan seluruhnya dari inkubator sebelum pembacaan akhir.

c) Pembacaan Hasil
Setelah inkubasi, kantong diperiksa dan jumlah lubang yang menghasilkan warna coklat pada berbagai tingkat (seperti yang
ditunjukan pada Gambar 2 ) dicatat sebagai reaksi positif. Selain itu, setiap sumur yang menunjukkan kekeruhan dengan atau tanpa
pewarnaan coklat dicatat sebagai positif. Kantong dapat dibandingkan dengan kantong kontrol kosong negatif saat memastikan
pewarnaan atau kekeruhan. Berikut merupakan contoh kantong reaksi 96 sumur MPN Quanti-Tray®/Legiolert™ 96 sumur dengan
Legiolert™ dengan 6 sumur besar dan 24 sumur kecil yang menunjukkan pewarnaan coklat untuk Legionella pneumophila

6. Konfirmasi Pengujian
Metode ini dilaporkan sangat spesifik untuk L. pneumophila. Oleh karena itu, tes konfirmasi tidak diperlukan. Jika diinginkan, sumur
positif mengandung Legionella pneumophila yang layak dari mana pengetikan molekuler dengan aglutinasi lateks, atau serupa,
dapat dilakukan.

40
7. Perhitungan
Konfirmasi Legionella pneumophila
MPN L. pneumophila ditentukan dengan mengacu pada tabel probabilitas yang sesuai, (lihat misalnya Lampiran) atau dengan
menggunakan perangkat lunak yang disediakan oleh produsen. Penentuan Ini berasal dari jumlah sumur yang menunjukkan warna
coklat dan/atau kekeruhan yang positif. Misalnya, jika terdapat 6 sumur besar dan 24 sumur kecil yang menunjukkan pewarnaan
coklat pada kantong reaksi (seperti yang ditunjukkan pada Gambar diatas), maka dari Lampiran C1, MPN L. pneumophila adalah 157
per 100 ml sampel, atau sampel encer. , diperiksa. Setiap pengenceran perlu diperhitungkan untuk penentuan konsentrasi L.
pneumophila dalam sampel asli. Jumlah L. pneumophila yang dikonfirmasi dinyatakan sebagai jumlah MPN per volume sampel.
Untuk air minum dan air serupa yang menggunakan metode ini, volume biasanya 100 ml.

41
42
43
References
 Sartory DP, Spies K, Lange B, Schneider S, Langer B. 2017. Evaluation of a most probable number method for the
enumeration of Legionella pneumophila from potable and related water samples. Lett. Appl. Microbiol. 64:271–274.
 Spies K, Pleischl S, Lange B, Langer B, Hubner I, Jurzik L, Luden K, Exner M. 2018. Comparison of the Legiolert/Quanti-
Tray MPN test for the enumeration of Legionella pneumophila from potable water samples with the German regulatory
requirements methods ISO 11731-2 and ISO 11731. Int. J. Hyg. Environ. Health 221(7):1047-1053.
 Schulze-Robbecke R, Rodder M, Exner M. 1987. Multiplication and killing temperatures of naturally occurring legionellas.
Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [B] 184:495-500.
 Anonymous. 2017. Legionnaires’ disease in residents of England and Wales: 2016 - Official statistics. Public Health
England.https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachm
ent_data/file/670640/Legionnaires_disease_in_England_and_Wales_2016.pdf.
 Fitzgeorge RB, Baskerville A, Featherstone ASR. 1987. Fine particle aerosols in
experimental Legionnaires disease: Their role in infection and treatment, p. 357-360. In Thing A (ed.), Advances in
Aerobiology: Proceedings of the third internatinal conference on aerocbiology. Birkhauser Verlag, Basel.
 Bencini MA, Yzerman EP, Koornstra RH, Nolte CC, den Boer JW, Bruin JP. 2005. A case of Legionnaires' disease caused by
aspiration of ice water. Arch. Environ. Occup. Health 60:302-306.
 Correia AM, Ferreira JS, Borges V, Nunes A, Gomes B, Capucho R, Goncalves J, Antunes DM, Almeida S, Mendes A,
Guerreiro M, Sampaio DA, Vieira L, Machado J, Simoes MJ, Goncalves P, Gomes JP. 2016. Probable Person-to Person
Transmission of Legionnaires' Disease. N. Engl. J. Med. 374:497-498.
 Anonymous. 2013. Legionnaires' disease. The control of legionella bacteria in water systems.
http://www.hse.gov.uk/pubns/books/l8.htm.
 Anonymous. 2013. Legionnaires’ disease. Part 3. The control of legionella bacteria in other risk systems.
http://www.hse.gov.uk/pubns/books/hsg274.htm.
 Anonymous. 2014. Legionnaires’ disease. Part 1. The control of legionella bacteria in
evaporative cooling systems. http://www.hse.gov.uk/pubns/priced/hsg274part1.pdf.

44