Tim Dosen Pengampu Praktikum :

Prof. Dr. apt. Ratna Djamil M.Si

Dr. apt. Yesi Desmiaty M.Si

Apt. Dra. Wiwi Winarti M.Si

Apt. Greesty Finotory, M.Farm

Apt. Diah Kartika P., M.Farm

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PANCASILA

2021
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

F.1.1.3.4.8/R0

UNIVERSITAS PANCASILA

FAKULTAS FARMASI

JAKARTA

PERSETUJUAN MATERI

PRAKTIKUM

Mata Praktikum : Fitokimia

Semester :V

Beban SKS :2

Tahun Akademik : 2020 – 2021

Jakarta, 29 Agustus 2021

Mengetahui: Disetujui oleh :

Wakil Dekan 1 Dosen Koordinator

Dr. apt. Dian Ratih L, M.Biomed. Dr. apt. Yesi Desmiaty, S.Si., M.Si.
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan kekuatan kepada
penyusun, sehingga menyelesaikan penulisan penuntun praktikum fitokimia ini.

Praktikum fitokimia ini dilaksanakan dengan tujuan agar mahasiswa dapat:

1. Mengaplikasikan teori matakuliah fitokimia dengan cara pembuktian dalam skala
laboratorium.
2. Mengerti dan memahami konsep dan prosedur kerja dalam isolasi senyawa kimia dari
tumbuhan yang merupakan konsep dasar dari ilmu fitokimia.
3. Dapat menggunakan sarana dan prasarana dalam proses analisis fitokimia dengan
baik dan benar.
4. Melatih kemandirian mahasiswa dalam bekerja dan menganalisa persoalaan sehingga
dapat melaksanakan kegiataan kerja dengan mengutamakan pendekatan ilmiah.

Dalam melaksanakan praktikum, mahasiswa ditugaskan membuat persiapan praktikum yang

berisi tujuan percobaan, cara kerja, pengamataan, pembahasaan dan kesimpulan.
Pembuataan persiapaan praktikum ini bertujuan agar mahasiswa dapat memahami apa yang
dikerjakan di laboratorium, dan mempermudahkan untuk membuat laporan yang diserahkan
1 minggu kemudian setelah praktikum, pembahasaan tentunya tidak terpaku hanya pada
buku penuntun ini saja, tapi mahasiswa juga di tuntut untuk membaca beberapa literatur lain
yang ada kaitannya dengan topik yang di kerjakan.

Penyusun menyadari bahwa penuntun ini jauh dari sempurna, oleh karena itu, masukan dan
saran sangat diperlukan untuk perbaikan penuntun praktikum fitokimia ini agar dapat lebih
baik di tahun mendatang dan dapat mencapai tujuan kegiatan pengajaran fitokimia.

Penyusun
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

1. Sebelum melaksanakan praktikum, mahasiswa harus sudah mempersiapkan diri dan

mempelajari hal yang berhubungan dengan rencana praktikum.
2. Mahasiswa harus datang tepat waktu sesuai jadwal praktikum dan harus mengisi daftar
hadir mahasiswa yang datang terlambat 15 menit harus lapor kepada Dosen Pembimbing
Praktikum (DPP) sebelum mulai menjalankan praktikum.
3. Mahasiswa yang tidak hadir pada hari praktikum, diharuskan memberikan alasan /
keterangan yang sah selambat – lambatnya pada hari berikutnya.
4. Mahasiswa yang tidak ikut praktikum tanpa alasan atau keterangan yang sah, tidak
diperkenankan untuk melanjutkan praktikumnya.
5. Tas dan peralatan yang tidak berkaitan dengan praktikum harus di simpan di dalam loker
dan dikunci. Barang dan alat yang tidak diperlukan tidak boleh ada di atas meja praktikum.
6. Selama mengikuti praktikum, mahasiswa harus tertib dan memakai baju praktikum yang
bersih dengan nama masing – masing di baju praktikumnya.
7. Setiap selesai praktikum, hasil harus dikumpulkan dan dilaporkan kepada DPP atau Asisten
yang bertugas untuk disahkan.
8. Setiap kali praktikum harus membuat laporan hasil praktikum dan harus di kumpulkan
sebelum praktikum berikutnya.
9. Mahasiswa yang tidak menyerahkan laporan hasil praktikum yang telah dikerjakan pada
minggu berikutnya tidak diperbolehkan melanjutkan praktikumnya.
10. Sebelum meninggalkan laboratorium, di haruskan membersihkan peralataan yang
digunakan, mengembalikan pereaksi ke tempatnya semula dan diperhatikan peralatan
dalam keadaan siap untuk digunakan pada praktikum berikutnya.
11. Mahasiswa yang memecahkan atau menghilangkan alat praktikum harus segera
menggantinya paling lambat dalam waktu 1 minggu.
12. Bersama-sama menjaga protokol kesehatan di masa pandemi ini yaitu menerapkan 3M :
memakai masker, menjaga jarak dan menghindari kerumunan, serta mencuci tangan pakai
sabun.
13. Hal yang belum tercantum dalam tata tertib ini akan diatur sewaktu praktikum berjalan.
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

HALAMAN SAMPUL ……………………………………………………………………………………………………………… i

LEMBAR PENGESAHAN ………………………………………………………………………………………………………..ii

KATA PENGANTAR …………………………………………………………………………………………………………….. iii

TATA TERTIB PRAKTIKUM …………………………………………………………………………………………………… iv

DAFTAR ISI …………………………………………………………………………………………………………………………. v

PERCOBAAN I : Pemeriksaan kimia pendahuluan dari serbuk simplisia ….................. 1

PERCOBAAN II : Kromotografi Lapis Tipis (KLT) ……..…………………………………................ 5
PERCOBAAN III : Ekstrasi / Isolasi dan identifikasi senyawa alkaloida piperin dari
Piper nigri / albi fructus…………………………………………........................... 8
PERCOBAAN IV : Ekstraksi / Isolasi dan identifikasi senyawa kafein dari daun
teh/biji kopi …………………………………………………………………………………. 11
PERCOBAAN V : Ekstraksi dan identifikasi senyawa flavanoid dari simplisia
tumbuhan…………………………………………………………………………….………. 15
PERCOBAAN VI : Ekstraksi / isolasi dan identifikasi minyak atsiri dari simplisia tanaman
secara kromotografi lapis tipis dan kromotografi gas…………………… 19
LAMPIRAN …………………………………………………………………………………………………………………….…. 20
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

Setelah praktikum mahasiswa diharapkan:

1. Dapat melakukan uji identifikasi pendahuluan terhadap kandungan metabolit
sekunder yang terdapat dalam simplisia tumbuhan.
2. Dapat mengenal golongan senyawa – senyawa metabolit sekunder yang terkandung
di dalam tumbuhan.

Penapisan fitokimia dilakukan sebagai pemeriksaan kimia pendahuluan pada simplisia

sebelum dilakukan tahap isolasi lebih lanjut. Pemeriksaan terhadap kandungan kimia yang
terdapat dalam tumbuhan tergantung pada sensitifitas prosedur analisis dan banyaknya
kandungan kimia senyawa pada bahan yang diidentifikasi. Hasil yang negatif dari skrining
fitokimia belum dapat dipastikan bahwa dalam simplisia terdapat tidak terdapat kandungan
senyawa kimia yang diperiksa. Hal ini dapat terjadi kemungkinan disebabkan karena
persentasenya yang sedikit dalam tumbuhan atau karena uji identifikasinya kurang sensitif
untuk golongan senyawa tertentu. Senyawa metabolit sekunder yang biasa terkandung di
dalam tumbuhan adalah golongan senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, saponin,
tanin, minyak atsiri, kuinon, dan kumarin.

BAHAN
• Serbuk simplisia • HCl pekat • Etanol 96 %
• NaOH 1 N • Amil alkohol • Lempeng Mg
• NH4OH 30 % • Ferri (III) klorida 1 % • Pereaksi Mayer
• Natrium Asetat • Eter • Pereaksi Dragendorff
• Kloroform • Asam asetat anhidrat • Pereaksi Steasny
• HCL encer • H2SO4 98 % (pekat)
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

ALAT
• Kertas saring • Kapas
• Tabung reaksi • Corong
• Water bath (penangas air) • Rak tabung reaksi
• Cawan penguap

1. Identifikasi golongan Alkaloid

Sebanyak 2 gram serbuk simplisia dibasakan dengan 5 ml ammonia 30% (pekat), di
gerus dalam mortir, kemudian ditambahkan 20 ml kloroform dan digerus kembali
dengan kuat, campuran tersebut disaring dengan kertas saring, diperoleh filtrat
berupa larutan organik (sebagai larutan A), sebagian dari larutan A (10 ml) diekstraksi
dengan 10 ml larutan HCL 1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, ambil larutan
bagian atasnya (sebagai larutan B).
Larutan A di teteskan beberapa tetes pada kertas saring dan disemprot atau ditetesi
dengan pereaksi Dragendorff, terbentuk warna merah / jingga pada kertas saring
menunjukan dugaan awal adanya senyawa alkaloid.
Larutan B di bagi dalam 2 tabung reaksi, ditambahkan masing – masing pereaksi
Dragendorff dan Mayer, terbentuk endapan merah bata dengan pereaksi Dragendorff
dan endapan putih dengan pereaksi Meyer menunjukkan adanya senyawa golongan
alkaloid.

2. Identifikasi golongan Flavonoid

2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air panas, didihkan selama 5 menit,
saring dengan kertas saring, diperoleh filtrat yang akan digunakan sebagai larutan
percobaan. Kedalam 5 ml larutan percobaan (dalam tabung reaksi), ditambahkan
serbuk atau lempeng magnesium secukupnya dan 1 ml HCL pekat, tambahkan 5 ml
amilalkohol, dikocok dengan kuat, Biarkan hingga memisah, terbentuk warna dalam
larutan amilalkohol menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

3. Identifikasi golongan Saponin

Sebanyak 10 ml larutan percobaan yang diperoleh dari percobaan No.2, Dimasukkan
kedalam tabung reaksi dan dikocok secara vertical selama 10 detik, kemudian

2
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

dibiarkan selama 10 menit, terbentuk busa yang stabil dalam tabung reaksi
menunjukkan adanya senyawa golongan saponin, Bila ditambahkan 1 tetes HCL 1 %
(encer) busa tetap stabil.

4. Identifikasi golongan Tanin

2 gram serbuk simplisia (dalam gelas piala kecil) ditambahkan 100 ml air, didihkan
selama 15 menit, dinginkan dan disaring dengan kertas saring dan filtrat yang
diperoleh dibagi 2 bagian. Kedalam masing – masing 5 ml filtrat (dalam tabung reaksi):
a. Ditambahkan beberapa tetes larutan Ferri (III) klorida 1 %, terbentuk warna biru
hijau violet.
b. Ditambahkan beberapa tetes larutan Gelatin 1 % terbentuk endapan putih
menunjukkan adanya senyawa golongan tanin.
Kedalam 50 ml filtrat yang kedua ditambahkan 15 ml Pereaksi Stiasny (Formaldehide
30% - HCL pekat = 2:1), Dipanaskan diatas penangas air, Terbentuk endapan warna
merah muda menunjukkan adanya Tanin Katekuat. Endapan disaring, Filtrat yang
diperoleh dijenuhkan dengan serbuk Natrium Asetat, Ditambahkan beberapa tetes
larutan Ferri (III) klorida 1% terbentuk warna biru tinta menunjukkan adanya Tanin
Galat.

5. Identifikasi golongan Kuinon

Diambil 5 ml larutan percobaan dari No.2, Masukkan kedalam tabung reaksi,
Ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH 1 N terbentuk warna merah intensif
menunjukkan adanya senyawa golongan Kuinon.

6. Identifikasi golongan Steroid dan Triterpernoid

1 gram serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam (dalam wadah
dengan penutup rapat), Disaring dan diambil filtratnya, 5 ml dari filtrat tersebut
diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu / sisa, Kedalam residu
ditambahkan 2 tetes Asam asetat anhidrat dan 1 tetes Asam sulfat (pekat) (Pereaksi
Liebermann – Burchard), Terbentuk warna hijau atau merah menunjukkan adanya
senyawa golongan Steroid atau Triterpenoid.

3
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

7. Identifikasi golongan Minyak Atsiri

Sejumlah 2 gram serbuk simplisia dalam tabung reaksi (volume 20 ml), Ditambahkan
10 ml pelarut Petroleum eter dan pasang corong (yang diberi lapisan kapas yang telah
dibasahi dengan air) pada mulut tabung, Panaskan selama 10 menit di atas penangas
air dan dinginkan, Saring dengan kertas saring, Filtrat diuapkan pada cawan penguap,
Residu dilarutkan dengan pelarut alkohol sebanyak 5 ml lalu saring dengan kertas
saring, Filtratnya diuapkan pada cawan penguap, residu berbau aromatik /
menyenangkan, menunjukkan adanya senyawa golongan Minyak Atsiri.

8. Identifikasi golongan Kumarin

2 gram simplisia dimasukkan dalam tabung reaksi (volume 20 ml) ditambahkan 10 ml
pelarut kloroform dan pasang corong (yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi
dengan air ) pada mulut tabung, Panaskan selama 20 menit diatas penangas air dan
dinginkan, Saring dengan kertas saring, Filtrat diuapkan pada cawan penguap sampai
kering, Sisa ditambahkan air panas sebanyak 10 ml, Dinginkan, Larutan dimasukkan
kedalam tabung reaksi, Tambahkan 0,5 ml larutan Ammonia (NH4OH) 10 %, Amati
dibawah sinar lampu ultraviolet pada panjang gelombang 365 nm, maka terjadi
flourensensi warna biru atau hijau, biru kehijauan, Menunjukkan adanya golongan
Kumarin.

1. Lakukan pemeriksaan kimia pendahuluan dari serbuk simplisia yang ditugaskan

dengan prosedur yang telah diberikan.
2. Berikan tanda (+) dan (-) untuk menunjukkan ada atau tidaknya kandungan kimia
yang diperiksa dari simplisia yang diberikan.

1. Bouquet, Travaux et Document, de I’Orston, “Plantes Medicine du Congo

Brazaville “, 1972.
2. Ciulei, T., “Methodology for Analysis of vegetable Drug “, Bucharest, 1981.
3. Farnsworth, N.R., Biological and Phytochemical screening of plant “,
J.Pharm.Sel.,55,3,1966.

4
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

Setelah praktikum ini mahasiswa diharapkan :

1. Memahami fungsi penggunaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dalam bidang fitokimia.
2. Mampu mengaplikasikan acara analisis kandungan kimia dari simplisia menggunakan
metode KLT.

Teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan metode yang paling cocok untuk analisis
obat di laboratorium farmasi. Metode ini dapat dilakukan dengan investasi yang kecil untuk
perlengkapaannya, waktu yang singkat untuk penyelesaian analisis (15 – 60 menit), dan
memerlukan jumlah cuplikan yang sangat sedikit (kira – kira 0.1 gr).

Definisi dan prinsip KLT (Kromatografi Lapis Tipis)

Kromatografi Lapis Tipis merupakan suatu metode pemisahaan fisikokimia. Lapisan yang
memisahkan terdiri dari fase diam berupa bahan berbutir – butir, ditempatkan pada
penyangga berupa pelat glass, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan
dipisahkan berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal). Kemudian pelat atau
lapisan ditaruh di dalam bejana tertutup rapat (chamber) yang berisi larutan pengembang
yang cocok (fase gerak). Pemisahaan terjadi selama perambataan kapiler (pengembangan),
Selanjutnya yang tidak berwarna harus ditampakkan (dideteksi).

Kondisi baku fase diam (lapisan penyerap)

Lapisan dibuat dari salah satu penyerap yang khusus digunakan untuk KLT diproduksi oleh
berbagai perusahaan. Ukuran lapisan tersebut adalah panjang 20 cm, lebar 20 cm atau 10 cm,
dengan tebal 0,1 – 0,3 mm (biasanya 0,2 mm). Sebelum digunakan, lapisan disimpan dalam

5
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

lingkungan yang tidak lembab dan bebas dari uap laboratorium. Penyerap yang umum ialah
silika gel, alumunium oksida, kieselgur, selulosa dan turunanya, poliamida dan lain – lain.
Fase gerak (larutan pengembang / larutan eluasi )
Fase gerak adalah media angkut dan terdiri dari satu atau beberapa pelarut. Larutan
pengembang / eluasi tersebut bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori.
Dengan adanya gaya kapiler, angka banding campuran sederhana atau multikomponen
pelarut dinyatakan dalam bagian volume sedemikian rupa sehingga volume total 100.

BAHAN
• Serbuk simplisia • Etil asetat • Metanol
• Air suling • Anilsadehide • Lempeng silica gel
• n-heksan • Asam sulfat GF254
ALAT
• Oven • Penyemprot KLT • Lampu UV
• Erlenmeyer • Pipa kapiler
• Vial • Chamber (bejana)

1. Kromatografi Lapis Tipis Piper nigri Fructus

I. Lempeng KLT
a. Lapisan fase diam silica gel GF254
b. Plat KLT siap pakai dengan fase diam silica gel GF254
II. Pengembang (fase gerak) :
Penjenuhan Bejana : n-heksana – etil asetat (60:40)
III. Deteksi
Dengan pereaksi anilsadehide – Asam sulfat (pereaksi no.22) atau disemprot
dengan pereaksi H2SO4 P 10% dalam metanol (cukup 2-3 kali semprot). Panaskan
5 menit pada suhu 1100C. Diperiksa dibawah sinar biasa dan sinar UV365.
IV. Larutan Cuplikan
a. Ekstrak : 0.1 gram serbuk simplisia didalam tabung reaksi. Tambahkan 1,0 ml
metanol, kocok agak kuat, diamkan sebentar. Ambil filtrat, totolkan dengan
pipa kapiler 5 µl (pada titik A).

6
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

b. Larutan pembanding : Senyawa piperin sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 1,0

ml metanol dan ditotolkan 1 µl (pada titik B).
2. Kromatografi Lapis Tipis Curcuma domesticae Rhizoma (Rimpang kunyit)
I. Lempeng KLT
a. Lapisan fase diam silica gel GF254
b. Plat KLT siap pakai dengan fase diam silica gel GF254
II. Pengembang (fase gerak)
Penjenuhan Bejana : n-heksana – kloroform – etanol 96% (40:40:20)
III. Deteksi
Dengan pereaksi asam borat – metanol (Pereaksi No.26), Diperiksa dibawah sinar
biasa dan sinar UV 365
IV. Larutan Cuplikan
a. Ekstrak : 0.1 gram serbuk simplsia di dalam tabung reaksi. Tambahkan 1,0
ml etanol 96 % kocok agak kuat selama 5 – 10 menit. Diamkan sebentar,
totolkan filtrat dengan pipa kapiler 5 µl (pada titik A).
b. Larutan pembanding : Senyawa kurkumin sebanyak 10 mg dilarutkan
dalam 1,0 ml etanol 96 % dan ditotolkan 1 µl (pada titik B).

1. Lakukan identifikasi kandungan piperin Piper nigri fructus secara KLT dan pembanding.
2. Identifikasi kandungan kurkumin pada Curcuma domesticae rhizoma secara KLT dan
pembanding.

Jarak rambat

15 cm

Jarak bawah

2 cm A B

Stahl, E.,” Drug analysis by Chromatograph and microscopy “ Ann Arbor, Michigan, 1973.

7
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

Setelah praktikum mahasiswa diharapkan :

1. Memahami cara mengekstraksi menggunakan ekstraktor soxhletasi
2. Dapat menghitung rendemen hasil isolasi.
3. Mampu melakukan proses isolasi senyawa piperin dari Piper nigri / albi fructus
4. Mampu melakukan identifikasi senyawa hasil isolasi secara Kromatografi Lapis Tipis.

Alkaloid telah diketahui sesjak 5500 tahun yang lalu merupakan golongan zat tumbuhan
sekunder terbesar. Tidak ada satu pun istilah alkaloid yang memuaskan, tetapi pada
umumnya alkaloid mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom
nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dari sitem siklik. Alkaloid sering kali
beracun bagi manusia dan banyak yang mempunyai kegiatan fisiologi yang menonjol, jadi
digunakan secara luas dalam bidang pengobatan. Prazat alkaloid yang paling umum adalah
asam amino. Meskipun sebenarnya, biosintesis kebanyakan alkaloid lebih rumit.

Alkaloid sebagai golongan dibedakan dari sebagian besar komponen tumbuhan lain
berdasarkan sifat basanya (kation). Oleh karena itu senyawa ini biasanya terdapat dalam
tumbuhan sebagai garam dengan berbagai asam organik dan sering ditangani di laboratorium
sebagai garam dengan asam hidroklorida dan asam sulfat. Bila alkaloid berada dalam bentuk
garamnya, maka alkaloid dibebaskan dengan mereaksikannya dengan penambahan basa
(NH4OH, Ca(OH)2, dsb) terlebih dahulu untuk mengekstraksinya. Alkaloid bebas biasanya
dapat diekstraksi dengan pelarut kloroform dan dipisahkan dari campuran senyawa yang
kompleks dengan menggunakan berbagai metode kromotografi.

8
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

BAHAN
• Serbuk simplisia Piper nigri / albi fructus
• Etanol 96 % • Anilsadehid
• KOH – etanol 10 % • Asam sulfat
ALAT
• Seperangkat extractor soxhlet (volume ± 250 ml)
• Kompor listrik dan panic almunium
• Batang pengaduk • Rotary evaporator vakum
• Cawan penguap 50 ml • Gelas piala 100 ml
• Kertas saring • Almunium foil
• Botol flakon • Plat KLT
• Corong • Lampu UV

1. Timbang lebih kurang 40 gram serbuk simplisia, masukkan ke dalam alat ekstraktor
soxhlet yang bagian dalamnya dilapisi kertas saring.
2. Tambahkan 400 ml etanol 96 % melalui mulut soxhlet, yang sebelumnya sudah
terpasang tegak lurus, sehingga terjadi pengaliran ke dalam labu pemanas (dengan 2
kali sirkulasi), Bila perlu dapat ditambahkan etanol lagi secukupnya.
3. Lakukan soxhletasi selama 2.5 jam (minimal 4-5 kali sirkulasi) kemudian ekstrak hasil
soxhletasi (dalam labu) dinginkan dengan air mengalir dan saring ekstraknya dengan
kertas saring (terpasang dengan corong).
4. Ambil ekstrak jernih yang diperoleh sebanyak 3 ml (masukkan kedalam botol flakon
kecil untuk pembanding), sisanya diuapkan dengan rotary evaporator vakum sampai
konsistensi kental (± 20 ml), Hasilnya dipindahkan ke dalam gelas piala kecil (volume
100 ml ), kemudian ditambahkan 10 ml KOH 10 % dalam etanol (1 gr dalam 10 ml
etanol 96%) sambil diaduk – aduk sehingga timbul endapan yang menggumpal.

9
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

5. Setelah mengendap, Pisahkan larutan ekstrak dari bagian yang tidak larut melalui
penyaringan glass wool sambil ditekan – tekan, Sehingga larutannya sampai habis
tersaring.
6. Larutan ekstrak jernih yang diperoleh, Tempatkan dalam gelas kecil dan tutup dengan
kertas almunium foil yang dilubangi beberapa buah lubang. Didiamkan dalam lemari
pendingin / es selama semalam.
7. Kristal isolat yang timbul dipisahkan dengan disaring dengan kertas saring dan
dikeringkan diatas kaca arloji dalam oven pada suhu 400C sehingga kering, Jika Kristal
belum murni atau kristalnya masih kotor (pemurniaan kristal dapat di lakukann
dengan metode rekristalisasi).

1. Tentukan / hitung rendemen hasil isolasi yang diperoleh.

2. Lakukan identifikasi secara Kromatografi Lapis Tipis
I. Lempeng Kromatografi Lapis Tipis
Plat KLT dengan lapisan (fase diam) silica gel GF 254
II. Pengembang (fase gerak )
Penjenuhan bejana : n-heksan – etil asetat ( 60 : 40 )
III. Deteksi
Dengan pereaksi anilsadehide – asam sulfat, setelah disemprot dengan pereaksi
(2-3 kali penyemprotan) panaskan 5 menit pada suhu 1100C, diperiksa dibawah
sinar UV.
IV. Larutan Cuplikan
a. Larutan ekstrak : totolkan dengan pipa kapiler 10 µl (pada titik A)
b. Larutan isolat : 15 mg isolat dilarutkan dalam 1,0 ml metanol dan totolkan 1
µl pada titik B
c. Larutan pembanding : Piperina sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 1,0 ml
metanol dan di totolkan 1 µl pada titik C.
3. Pembuataan spektrum UV, Tentukan puncak serapan maksimum
4. Pembuataan spektrum infra merah, Tentukan gugus fungsi yang penting.

CATATAN :
1. Untuk spectrum UV : Gunakan pelarut etanol atau kloroform
2. Untuk spectrum IR : menggunakan cakram KBr.

Ikan,R.,” Natural Product “, Academic Press, New York, 1976.

10
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

Setelah praktikum mahasiswa diharapkan :

1. Memahami cara mengekstraksi menggunakan ekstraktor soxhletasi
2. Dapat menghitung rendemen hasil isolasi
3. Mampu melakukan proses isolasi senyawa kafein dari daun teh / biji kopi.
4. Mampu melakukan identifikasi senyawa hasil isolasi menggunakan metode KLT

Kofein merupakan senyawa kimia alkaloid terkandung secara alami pada tanaman teh (1-
4,8%) dan kopi (1-1,5%). Kofein diproduksi secara komersial dengan cara ekstraksi dan
tanaman tertentu dan di produksi secara sintesis. Kafein adalah suatu senyawa organik yang
mempunyai nama lain 1,3,7-trimetil xanthin.

BAHAN
• Serbuk simplisia daun teh / biji kopi
• Etanol 96 % • HCl
• Asam sulfat 10 % • Metanol
• Magnesium Oksida ( Mg O) • Ammonia
• Natrium Hidroksida 5 % • Iodin
• Kloroform • Aquadest

ALAT
• Seperangkat alat ekstraktor soxhlet ( volume 250 ml )
• Kertas saring • Penangas air
• Corong • Batang pengaduk
• Kompor listrik dan panic almunium • Cawan penguap 50 ml

11
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

• Corong Buchner dan alat vacuum • Almunium foil

• Kertas pH Universal • Kaca arloji
• Corong pisah volume 500 ml • Oven
• Gelas piala kecil • Rotari Evaporator Vakum

1. Timbang lebih kurang 50 gram serbuk simplisia, masukkan ke dalam alat ekstraktor
soxhlet yang bagian dalamnya dilapisi kertas saring
2. Tambahkan 400 ml etanol 96 % melalui mulut soxhlet, yang sebelumnya sudah
terpasang tegak lurus, sehingga terjadi pengaliran kedalam labu pemanas (cukup
dengan 2 kali sirkulasi), bila perlu dapat ditambahkan etanol 96 % lagi secukupnya.
3. Lakukan soxhletasi selama 2,5 jam, kemudian hasil soxhletasi dinginkan sebentar dan
saring dengan kertas saring (terpasang dengan corong).
4. Uapkan larutan ekstrak dengan vakum rotavapor sampai konsistensi kental (± 20 – 30
ml), hasilnya pindahkan kedalam gelas piala volume 500 ml
5. Tambahkan 25 gram Mg O sambil di aduk dengan batang pengaduk, Tambahkan 200
ml aquadest panas sambil diaduk, didihkan selama 10 menit dan disaring dalam
keadaan panas – panas dengan corong Buchner dan bilas penyaring Buchner dengan
50 ml aquadesr panas.
6. Filtrat yang diperoleh kumpulkan dan ditempatkan dalam gelas piala, tambahkan 25
ml asam sulfat 5 % sambil diaduk, larutan filtrat dipanaskan lagi diatas penangas air
selama 10 menit, larutan disaring panas kembali, filtrat yang diperoleh didinginkan.
7. Larutan filtrat tersebut netralkan dengan Ammonia pekat (NH4OH) yang ditambahkan
tetes demi tetes sampai pH netral ( pH = 6-7)
8. Larutan yang sudah dinetralkan pindahkan kedalam corong pisah (volume 500 ml), lalu
diekstraksi sebanyak 5 kali dengan 25 ml kloroform, hasil ekstrak kloroform
dikumpulkan dan diuapkan dengan vakum rotavapor sampai menjadi kira – kira ± 10
ml dan tambahkan 15 ml etanol 96 %, dipindahkan ke gelas piala kecil, tutup dengan
kertas almunium foil yang dilubangi beberapa buah lubang, didiamkan dalam lemari
pendingin / es ( bukan di dalam frezzer ) selama semalam ( 24 jam ).
9. Kristal kofeina yang timbul dipisahkan dengan disaring dengan kertas saring dan
dikeringkan diatas kaca arloji dalam oven pada suhu 400C.

12
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

1. Tentukan / hitung rendemen hasil isolasi yang diperoleh.

2. Lakukan identifikasi secara KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
I. Metode standar
Sebelum di eluasi, lapisan fase diam lempeng KLT dimantapkan dengan uap
amoniak yang lembab, untuk keperluan ini digunakan gelas piala kecil berisi 20 ml
larutan ammonia 10 % ditempatkan didalam bejana kering berisi plat KLT,
kedalam bejana ditambahkan larutan pengembang (pengeluasi)
II. Lapisan (fase diam)
Silika gel GF254
III. Pengembang (fase gerak)
Penjenuhan bejana : kloroform – etanol (99:1)
IV. Deteksi
Disemprotkan dengan larutan iodin – alkohol lalu dengan asam hidroklorida –
alkohol.
V. Larutan Cuplikan
Kristal isolat kofeina 1 mg, dilarutkan kedalam 2 ml pelarut campuran kloroform
– metanol dengan perbandingan 9 : 4 (1.4 ml : 0.6 ml) , untuk menotolkan bercak
digunakan 5 µl.
3. Pembuatan spectrum UV dan spectrum Infra red (IR)

Ikan, R., “Natural Product”, Academic Press, New York, 1976.

13
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

Setelah praktikum mahasiswa diharapkan :

1. Memahami proses ekstraksi simplisia tumbuhan menggunakan pelarut yang
mempunyai tungkat kepolaran berbeda.
2. Mampu melakukan pemisahan senyawa polar dengan menggunakan Kromatografi
kertas preparatif

Flavonoid adalah merupakan senyawa glikosida dan bila dihidrolisis terurai menjadi aglikon
flavonoid dan gula.
Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran, jarang sekali dijumpai hanya
flavonoid tunggal dalam jaringan tumbuhan.
Cara ekstraksi / isolasi dapat dilakukan dengan metode:
a. Maserasi dan perkolasi (tanpa pemanasan)
b. Soxhletasi yaitu ekstraksi secara sinambung (ekstraksi cara panas)
c. Refluks

BAHAN
• Serbuk simplisia • Petroleum eter • Metanol
• Etanol 70 % • Etil asetat • Asam asetat
• Aquadest • N-Butanol

14
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

ALAT
• Erlenmeyer • Corong pisah
• Corong • Hair dryer
• Kapas • Kertas whatman no.3
• Kertas saring • Gunting
• Rotari evaporator vakum • Chamber
• Gelas piala

1. Serbuk simplisia 20 gram dimasukkan kedalam Erlenmeyer (volume 250 ml pakai

tutup), tambahkan 125 ml etanol 70 % pasang corong pada mulut Erlenmeyer yang
diberi kapas yang telah dibasahi dengan air, panaskan diatas penangas air selama 30
menit, sambil diaduk 5 menit (Refluks sederhana).
2. Setelah selesai pemanasan, dinginkan Erlenmeyernya dengan bantuan air mengalir,
saring dengan kain kasar, lalu saring lagi dengan kertas saring, filtrat yang diperoleh
diuapkan dengan vakum rotavapor sampai kental sampai volume kira – kira ± 10 ml,
dan tempatkan dalam gelas piala.
3. Ditambahkan air hangat lebih kurang 100 ml sambil diaduk – aduk dan tuang kedalam
corong pisah, ditambahkan eter minyak bumi (petroleum eter) atau n heksana 25 ml,
kocok (pengocokan 3 kali 25 ml), kumpulkan fase petroleum eter dan dibuang.
4. Lapisan air (sisa) dikocok dengan etil asetat 3 kali 25 ml, kumpulkan fase etil asetat
dan dibuang.
5. Lapisan air (sisa) diambil, ditempatkan dalam corong pisah lalu dikocok dengan pelarut
n – butanol (3 kali masing – masing 25 ml), kumpulkan fase n – butanol dan diuapkan
dengan rotary evaporator sampai pelarut n – butanol habis, sisa (residu) masih dalam
labu larutkan dengan 5 ml metanol dan dipindahkan ke dalam cawan penguap, larutan
metanol yang diperoleh (mengandung senyawa glikosida flavonoid).
6. Larutan ekstrak metanol tersebut uapkan dengan hembusan dingin hair dryer sampai
volumenya setengah bagian (2,5 ml).

15
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

7. Larutan ekstrak metanol tersebut ditotolkan berbentuk pita dengan ketebalan

maksimum 1 cm pada kertas Whatman no.3, eluasi dengan jarak rambat 10 cm.
(Fase gerak BAA (n-butanol – Asam asetat – Air) – ( 40 : 10 : 50 ) campur baik – baik
dengan corong pisah, diamkan sebentar dan yang dipakai fase atasnya ).
8. Hasil kromatogram kertas berupa bentuk pita (I), digunting salah satu pita tertentu,
dan pita tersebut digunting kecil (pengguntingan pita kromatogram kertas harus
dalam keadaan kering), dilarutkan dalam metanol 5 ml.
9. Larutan metanol tersebut diuapkan hembusan hair dryer dingin sampai 2 ml, lalu
ditotolkan kembali pada kertas whatman no.3 berbentuk pita seperti diatas, eluasi
dengan jarak rambat 10 cm.
( Fase gerak II : Asam asetat 15 %)
10. Hasil kromatogram kertas bentuk 1 (satu) pita, digunting setelah kering, pita tersebut
digunting kecil – kecil dan dilarutkan dalam metanol 5 ml, ambil filtrat metanol dan
akan digunakan pada pembuatan spectrum UV/Vis.

1. Pembuatan spectrum UV dengan spektrofotometer UV/Vis.

2. Tentukan puncak serapan maksimum I dan serapan maksimum II pada panjang
gelombang tertentu dari senyawa glikosida flavonoid tersebut.

Markam, K.R., “ Technique of flavonoid identification”, Academic Press Inc, London, 1982.

16
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

Setelah praktikum mahasiswa diharapkan:

1. Mampu mengekstraksi dan mengisolasi minyak atsiri menggunakan metode destilasi air.
2. Mampu melakukan identifikasi minyak atsiri dengan menggunakan metode Kromatografi
Lapis Tipis dan Kromatografi gas.

Minyak atsiri dikenal juga dengan nama minyak eteris atau minyak terbang (essensial oil,
volatile air) dihasilkan oleh tanaman, mempunyai rasa getir, berbau wangi sesuai dengan
tanaman penghasilnya, umumnya larut dalam pelarut organik dan tidak larut dengan air.
Senyawa organik dalam minyak atsiri termasuk golongan terpenoid, umumnya terbatas pada
monoterpen dan seskuiterpen. Minyak atsiri dapat bersumber dari setiap bagian tanaman
seperti daun, bunga, biji, batang, kulit batang akar ataupun rimpang.

Untuk memperoleh minyak atsiri dari tanaman dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu:
1. Penyulingan (destilasi)
2. Ekstraksi dengan pelarut yang mudah menguap
3. Penyaringan dengan lemak padat.
4. Pemerasan
5. Penyarian dengan CO2

Cara yang paling umum digunakan untuk mendapatkan minyak atsiri yaitu dengan
penyulingan. Penyulingan adalah proses pemisahan komponen yang berdasarkan perbedaan
titik didihnya, prinsip dasar penyulingan adalah cairan diubah menjadi uap pada titik didihnya,
kemudian uap tersebut dikondensasi lagi kedalam bentuk cairan dengan proses pendinginan.

17
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

Penyulingan dapat dilakukan dengan beberapa cara:

1. Penyulingan dengan air
2. Penyulingan dengan air dan uap
3. Penyulingan dengan uap

BAHAN
• Serbuk simplisia • Eter
• Aquadest • Natrium sulfat anhidrat
ALAT
• Perangkat alat destilasi • Erlenmeyer

A. DESTILASI AIR
CARA KERJA
1. Timbang serbuk simplisia 100 gram, masukkan dalam labu destilasi, tambahkan
aquadest sampai menjadi 2/3 volumenya, lalu pasangkan dengan seperangkat alat
destilasi yang telah disiapkan sebelumnya.
2. Pemanasan labu menggunakan penangas udara (cara destilasi dengan air) destilasi
lebih kurang 3,5 - 4 jam.
3. Tampung semua destilat dan disatukan, pemisahan minyak dan air dilakukan
dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut eter 4 x 30 ml dan keringkan dengan
natrium sulfat anhidrat, pelarut eternya diuapkan sehingga diperoleh minyak
atsiri.
IDENTIFIKASI
a. Dengan cara kromatografi Lapis Tipis (KLT)
1. Lapisan (fase diam) : silica gel GF 254
2. Pengembang (fase gerak) : Penjenuhan bejana kromatografi dengan n-heksan-
etilasetat (94:4), eluasi 2 kali setinggi 10 cm, pengeringan antara 2 pengembangan
5 menit pada suhu kamar.
3. Deteksi dengan lampu UV, penampak bercak dengan pereaksi anilsadehide – asam
sulfat, panaskan 5 menit pada 100 – 110 0C

18
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

4. Larutan Cuplikan : Minyak atsiri dilarutkan dalam toluen dengan konsentrasi 1 % (

1 tetes minyak atsiri dilarutkan ad 5 ml toluene ).

b. Dengan Kromatografi Gas-Cair (KGC)

Fase diam untuk kolom adalah silicon SE 30, mampu memisahkan komponen
monoterpen dan seskuiterpen dari minyak atsiri.

B. PENETAPAN KADAR MINYAK ATSIRI DENGAN ALAT DESTILASI STAHL

Bahan :
• Cengkeh = 2.5 gr ( bentuk serbuk )
• Kemukus = 2 gr ( bentuk serbuk )

CARA PENETAPAN
a. Cara 1
Campur bahan yang diperiksa dalam labu dengan cairan penyuling, pasang alat, isi
buret dengan air hingga penuh, panaskan dengan tangas udara, sehingga
penyulingan berlangsung dengan lambat tetapi teratur, setelah penyulingan
selesai, biarkan selama tidak kurang dari 15 menit, catat volume minyak atsiri pada
buret.
Hitung kadar minyak atsiri dalam % v/b.
b. Cara 2
Dilakukan menurut cara yang tertera pada Cara 1, sebelum buret diisi penuh
dengan air, lebih dahulu diisi dengan 0.2 ml xilena P yang diukur seksama.
Volume minyak atsiri dihitung dengan mengurangkan volume yang dibaca dengan
volume xilena.

1. Miller, J.M, Separation Methods in Chemical Analysis, Wiley Interscience, New York,
1975.
2. Dep.Kes R.I,Materia Medika Indonesia, Jilid II,Dit.Jend.POM,Jakarta,1978.
3. Gritter RJ, Robbitt JM, Schwarting AE, Pengantar Kromatografi, Edisi kedua, Bandung,
Penerbit ITB, 1991.

19
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

1. Dragendroff
Pereaksi ini biasa digunakan untuk uji identifikasi alkaloid dan senyawa yang
mengandung nitrogen lain.
• Larutan A : 0.85 gr Bismuth Nitrat basa, larutkan dalam campuran ( 10 ml asam
asetat glacial dan 40 ml air )
• Larutan B : 8 gr KI dilarutkan dalam 20 ml air
• Larutan stok : volume yang sama dari larutan A dan B disimpan dalam botol
gelap.
Reagen penyemprot :
1 ml dari larutan stock dicampur dengan 2 ml asam asetat glacial dan 10 ml air sebelum
digunakan.

2. Pereaksi Mayer
Pereaksi mengendap yang digunakan untuk uji identifikasi alkaloid
Cara pembuatan reagent :
Sejumlah 1.35 gr HgCl2 dan 5.0 gr KI dilarutkan dalam 30 ml air, kemudian
ditambahkan air lagi sampai menjadi 100 ml

3. Anisaldehide – asam sulfat pekat

Pereaksi untuk berbagai bahan alam, terutama untuk turunan terpena.
Sejumlah 0.5 ml anilsadehide dicampur berturut – turut dengan 10 ml asam asetat
glacial, 85 ml metanol dan 5 ml asam sulfat pekat, semprotkan 10 ml larutan itu pada
plat, lalu plat dipanaskan pada 100 – 110 0C selama 10 menit. Deteksi dilakukan di
bawah sinar matahari.

4. Asam borat – metanol

Pereaksi untuk memeriksa kurkumin.
Sejumlah 3.0 gram asam borat dilarutkan dalam 10 ml metanol, dan ditambahkan 0.5
ml HCl 25 %. Semprotkan 10 ml larutan ini pada plat, lalu warna yang timbul diamati
di bawah sinar matahari dan sinar UV 365

20
 MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA

SELAMAT BELAJAR

"Bukan ilmu yang seharusnya mendatangimu, tapi kamu yang seharusnya

mendatangi ilmu." – (Imam Malik)

“Pendidikan adalah kunci untuk membuka dunia, paspor menuju kebebasan.”

– (Oprah Winfrey)

21