See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/352291658

Spektofotometer Prinsip dan Cara Kerjanya

Article · June 2021

CITATIONS READS

0 33,308

1 author:

Fithrul Mubarok
Universitas Surabaya
6 PUBLICATIONS   2 CITATIONS   

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Iam doing research project with minitab, we need to calculate multi linear regression using minitab View project

Kimia Farmasi View project

All content following this page was uploaded by Fithrul Mubarok on 10 June 2021.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

Farmasiindustri.com

Spektofotometer Prinsip dan Cara Kerjanya

Pengertian

Spektrofotometer adalah metode untuk mengukur berapa banyak substansi kimia, ini diukur
dengan mengukur banyaknya absorbsi dari cahaya yang dilewatkan pada sampel larutan.
Cahaya yang dilewatkan disebut juga beam. Cahaya ini dilewatkan dengan panjang
gelombang (lamda) tertentu. Spektrofotometer terdiri dari dua alat yaitu spektrometer dan
fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dengan panjang gelombang tertentu dan
fotometer alat untuk mengukur intensitas cahaya yang diabsobrsi. Ilmu spektrofotometri
merupakan salah satu metode analisis kuantitatif yang penggunaanya sangat luas seperti
kimia, fisika, biokimia, teknik material, teknik kimia dan penggunaan klinis.

Unit Spektrofotometer Double Beam

Keuntungan utama metode spektrofotometri adalah metode ini memberikan cara sederhana
untuk menetapkan kuantitas zat yang kecil. Selain itu, hasil yangdiperoleh cukup akurat,
dimana angka yang terbaca langsung dicatat oleh detektor dan tercetak dalam bentuk
angka digital ataupun grafik yang sudah diregresikan.

Prinsip Kerja Spektrofotometer

Setiap komponen kimia bersifat mengabsorbsi cahaya, atau memantulkan cahaya (bisa juga
radiasi elektromagnetik) pada panjang gelombang tertentu. Nilai absorbansi dari cahaya
yang diserap sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet. Jadi larutan dimasukkan
ke dalam kuvet, cahaya dilewatkan ke dalam kuvet. Kuvet ini biasanya terbuat dari kaca
dengan sifat sedikit mengabsorbsi cahaya. Kuvet terbuat dari kaca kuarsa yang sedikit
mengabsorbsi cahaya. Kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa mempunyai kualitas yang lebih
baik dari pada kuvet yang terbuat dari gelas. Kualitas kuvet dilihat dari banyak sedikitnya
sinar yang diserap oleh kuvet tersebut. Semakin sedikit sinar yang diserap oleh kuvet
tersebut. Kualitas kuvet semakin baik. Kuvet harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:
Farmasiindustri.com

Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya. Permukaannya secara

optis harus benar-benar sejajar.

Kuvet Kuarsa

Kuvet ini harganya sangat mahal dan mudah pecah sehingga pengunaanya dalam
spektrofotometer perlu sangat hati-hati.

Terdapat berbagai variasi spektrofotometri seperti spektrofotometri absorbsi atom dan

spektrofotometri emisi atom. Spektrofotometer adalah instrument alat yang mengukur jumlah
foton (intensitas cahaya) yang terabsorbsi setelah melewati sampel cairan di dalam kuvet.
Dengan spektrofotometer konsentrasi kimia larutan dapat ditentukan dengan mengukur
intensitas cahaya yang terdeteksi.

Skematik Alur Kerja Spektrofotometer

Cahaya yang berasal dari lampu diteruskan melalui lensa menuju ke monokromator,
kemudian cahaya akan diubah cahaya yang awalnya polikromatis menjadi cahaya
monokromatis (tunggal). Berkas cahaya dilewatkan pada sampel yang mengandung zat
konsentrasi dengan tertentu. Cahaya yang terbentuk ada yang diserap (diabsorbsi) dan ada
pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan kemudian diterima oleh detektor. Cahaya
yang diterima dihitung dan untuk mengetahui cahaya yang diserap sampel. Cahaya yang
diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel, sehingga akan
diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif. Berikut skemanya:

Skematik Kerja Spektrofotometer

Jenis Spektrofotometer Berdasarkan Sumber Cahaya

Farmasiindustri.com

Berdasarkan range/kisaran dari panjang gelombang dari sumber cahaya, dapat dibedakan
menjadi :

• Spektrofotometer UV-Visible adalah menggunakan cahaya dengan kisaran ultraviolet

(185-400 nm) dan kisaran cahaya visible (terlihat) (400-700 nm). Spektrofotometri
UV-Vis merupakan salah satu teknik analisis spektroskopi yang memakai sumber
radiasi eleltromagnetik ultraviolet dekat (185-400 nm) dan sinar tampak (400-700
nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis
melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis,
sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif
ketimbang kualitatif.
• Spektrofotometer IR (infra Red) adalah menggunakan cahaya pada kisaran (700-
15000 nm). Spektrofotometri Infra Red adalah pengukuran dari interaksi dari radiasi
infra red dengan material yang diabsorbsi, diemisikan atau refleksi. Spektrofotometer
infra red digunakan secara luas untuk identifikasi subtansi kimia atau grup fungsional
pada padatan, cairan atau gas.

Pada spektrofotometer visible, absorbsi dan trasnmisi dari subtansi kimia dapat ditentukan
dengan warnanya. Misalnya, larutan yang mengabsorbsi cahaya pada kisaran cahaya
visible akan terlihat hitam dan jika semua terlewati maka terlihat putih.

Jenis Spektrofotometer Berdasarkan Kelasnya

Terdapat dua kelas spektrofotometer yaitu single (tunggal) beam dan double (ganda) beam.

• Single Beam
Pada spektrofotometer single beam, komponen disusun tunggal, pada jenis ini lebih
murah dan lebih mudah pemeliharaannya. Pada spektrofotometer single beam
dibutuhkan standar referensi untuk mengukur internsitas cahaya sebelum dan
sesudah sampel dimasukkan.
• Double Beam
Pada spektrofotometer double beam, sumber cahaya dibagi menjadi dua berkas
cahaya setelah melewati monokrometor. Berkas cahaya yang satu digunakan untuk
sampel dan berkas cahaya lainnya digunakan untuk reference standar. Konfigurasi
double beam ini sangat menguntungkan karena pembacaan sampel dan standar
dapat dilakukan simultan (bersamaan) sehingga pengukuran menjadi independen
dari variasi intensitas sumber cahaya.
Farmasiindustri.com

Skematik Layout
Spektrofotometer (A) Single Beam (B) Double Beam

Bagian-bagian dari Spektrofotometer

• Sumber cahaya
Sumber cahaya yang sering digunakan adalah lampu wolfram, yang mempunyai
keunggulan energi radiasi tidak bervariasi pada berbagai panjang gelombang. Pada
spektrofotometer UV-Visible biasanya digunakan lampu deuterium dan lampu
tungsten halogen.
• Monokromator
Monokromator alat yang berfungsi menguraikan cahaya polikromatis menjadi
beberapa panjang gelombang yang berbeda-beda (monokromatis). Biasanya
penguraian cahaya ini menggunakan sebuah prisma untuk mendifraksi cahaya.

Sebuah
Prisma digunakan untuk menguraikan cahaya polikromatis menjadi monokromatis

• Kuvet
Kuvet terbuat dari kaca kuarsa yang sedikit mengabsorbsi cahaya. Kuvet yang
terbuat dari bahan kuarsa mempunyai kualitas yang lebih baik dari pada kuvet yang
terbuat dari gelas. Kuvet merupakan alat yang digunakan untuk mengukur
konsentrasi reagen yang dibaca pada spektrofotometer. Berbagai jenis bahan kuvet
yang sering digunakan di laboratorium yaitu kuvet gelas dan kuvet plastik. Kuvet
gelas adalah kuvet yang terbuat dari kaca dan dapat digunakan berulang-ulang,
namun pada pengukuran di daerah UV hanya dapat digunakan kuvet yang terbuat
Farmasiindustri.com

dari bahan kuarsa, karena kuvet yang terbuat dari kaca tidak dapat mengabsorbsi
sinar UV sehingga tidak dapat digunakan pada saat pengukuran di daerah UV

• Detektor
Detektor spektrofotometer mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang besarnya
sebanding dengan intensitas cahaya. Peranan detektor penerma adalah memberikan
respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan
mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh
penampil data dalam bentuk jarum atau angka digital.

Syarat detektor yang baik diantaranya:

• Kepekaan yang tinggi terhadap radiasi yang diteriama, dengan derau yang minimal.
• Mampu memberikan respon terhadap radiasi pada rentang panjang
gelombang yang lebar (UV-Vis).
• Respon terhadap radiasi harus serempak.
• Respon harus kuantitatif dan sinyal elektronik yang keluar berbanding lurus dengan
radiasi elektromagnetik yang diterima.
• Sinyal elektronik yang dihasilkan harus dapat diamplifikasikan oleh penguat
(amplifier) ke rekorder (pencatat).

Hukum Lambert-Beer

Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa terdapat hubungan linear antara absorbansi dan
konsentrasi sampel. Dengan alasan ini hukum ini dapat diaplikasikan ketika ada hubungan
linear titik-titik konsentrasi versus absorban. Rumusnya adalah sebagai berikut :

A=ϵlc

Dimana

• A adalah nilai absorban (tanpa satuan unit)

• ϵ adalah koefisien molar atau absortivitas molar
• l adalah panajng jalur (satuan cm)
• c adalah konsentrasi

Panjang jalur satuannya adalah centimeter, karena spektrofotometer menggunakan kuvet

dengan lebar 1 cm, sehingga l= 1 cm. Absorban dan panjang jalur diketahui maka dapat kita
hitung konsentrasi (c) dari sampel.

Contoh perhitungan:

Sampel yang berisi Guanosine mempunyai absorban maksimum pada panjang gelombang
275 nm. ϵ275=8400M−1cm−1 dan panjang jalur 1 cm. Menggunakan spektrofotometer diukur
sampel guanoseine tersebut pada panjang gelombang 275 nm didapatkan nilai 0,70
( A275=0,70). Berapa konsentrasi dari sampel Guanosine ?

Jawaban:

Untuk menghitung soal diatas maka gunakan rumus Lambert-Beer.

A=ϵlc
Farmasiindustri.com

0,70 = (8400 M-1 cm-1)x (1 cm) x c

c= 0,7/[(8400 M-1 cm-1)(1 cm)]

c = 8,33x10-5 mol/L

Maka konsentrasi sampel Guanosine (c) adalah 8,33x10-5 mol/L.

Biasanya dalam praktikum kimia akan dibuat seri larutan sampel yang sudah diketahui
konsentrasinya. Masing-masing larutan sampel dengan konsentrasi tertentu diukur
absorbansinya dengan spektrofotometer. Akan didapat nilai konsentrasi versus absorban,
nilai ini kemudian dibuat regresi linearnya sehingga didapat persamaan yang
menghubungkan konsentrasi dengan absorban. Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan
dianalisis dengan berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi dengan berbagai
konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi.
Misalnya sebagai berikut :

Nomor Konsentrasi (X) Absorban (Y)

1 0,4 0,118
2 0,8 0,228
3 1,2 0,327
4 1,6 0,441
5 2,0 0,512
6 2,4 0,611
Tabel Konsentrasi vs Absorban

Dibuat regresi linear antara konsentrasi versus absorban diatas dapat menggunakan
Microsoft Excell atau kalkukator Scientific, didapkan persamaan :

Y = 0,24507X + 0,02973

dengan R adalah 0,998.

Berikut grafiknya:
Farmasiindustri.com

Persamaan regresi

Setahu saya nilai absorbansi yang baik (Y) berada pada rentang 0,2-0,8 diluar rentang
tersebut hukum labert-beert sudah tidak linear lagi.

Note :

Perhitungan diatas saya menggunakan online calculator disini.

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara
langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap
konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan
tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan,
dan linearitas yang dapat diterima.

Brand Spektrofotometer

Di pasaran terdapat bermacam-macam merk brand Spektrofotometer seperti Hitachi,

Shimadzu, Agilent, thermofischer dan lain-lain. Berikut contoh merk spektrofotometer dan
tipenya :

• UV-Vis-NIR Spectrophotometer UV-3600 Plus - Shimadzu.

• NanoDrop™ 2000/c Spectrophotometer - Thermo Fisher Scientific.
• Cary 6000i UV-Vis-NIR Spectrophotometer - Agilent Technologies.
• LAMBDA 25, 35, & 45 UV/Vis Spectrophotometers - PerkinElmer.
• DR 6000™ UV-Vis Spectrophotometer - Hach Technology.

Referensi:

• https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Physical_and_Theoretical_Chemistry_Textb
ook_Maps/Supplemental_Modules_(Physical_and_Theoretical_Chemistry)/Kinetics/0
2%3A_Reaction_Rates/2.01%3A_Experimental_Determination_of_Kinetics/2.1.05%
3A_Spectrophotometry#:~:text=A%20spectrophotometer%20is%20an%20instrument
,the%20intensity%20of%20light%20detected.
 Farmasiindustri.com

• http://repository.unimus.ac.id/3183/4/BAB-II.pdf

Semoga Bermanfaat

Salam

M. Fithrul Mubarok, M. Farm.,Apt

View publication stats