BAKTERIOLOGI III

LAPORAN PRAKTIKUM

IDENTIFIKASI BAKTERI GRAM (-) PENYEBAB PENYAKIT SALURAN

PENCERNAAN

(E.coli)

Disusun oleh :

PINDI LESTARI

NPM : 411118012

PROGRAM STUDI ANALIS KESEHATAN (D-3)

STIKES JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI

2020
 A. Hari dan Tanggal Praktikum : 9-03-2019 Sampai 12-03-2019

B. Tujuan Praktikum

Untuk mengidentifikasi bakteri Gram negatif E.coli pada air sumur.

C. Dasar Teori

Escherichia coli adalah anggota flora normal usus. Escherichia coli

berperan penting dalam sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu,

asam-asam empedu dan penyerapan zat-zat makanan. Escherichia coli

termasuk ke dalam bakteri heterotrof yang memperoleh makanan berupa zat

oganik dari lingkungannya karena tidak dapat menyusun sendiri zat organik

yang dibutuhkannya. Zat organik diperoleh dari sisa organisme lain. Bakteri ini

menguraikan zat organik dalam makanan menjadi zat anorganik, yaitu CO2,

H2O, energi, dan mineral. Di dalam lingkungan, bakteri pembusuk ini berfungsi

sebagai pengurai dan penyedia nutrisi bagi tumbuhan (Sri, 2010).

E. coli  adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tidak

membentukspora yang merupakan flora normal di usus. Meskipun

demikian, beberapa jenisE.coli dapat bersifat patogen, yaitu serotipe-

serotipe yang masuk dalam golongan E.coli Enteropatogenik, E.coli

Enteroinvasif, E. Coli Enterotoksigenik dan E.coli  Enterohemoragik . Jadi

adanya E. coli

dalam air minum menunjukkan bahwa airminum tersebut pernah

terkontaminasi kotoran manusia dan mungkin dapatmengandung patogen

usus. Oleh karenanya standar air minum mensyaratkan E. Coli harus

absen dalam 100 ml. Berbagai cara pengujian E. Coli telah

dikembangkan, tetapi analisiskonvensional yang masih banyak

dipraktekkan adalah dengan 4 tahap analisis yangmemerlukan waktu 5-7

hari. Empat tahap analisis tersebut adalah Uji Pendugaandengan metode

MPN ( most probable number ), Uji penguat pada medium selektif,Uji

lengkap dengan medium lactose broth, serta Uji Identifikasi dengan

melakukanreaksi IMViC (indol, methyl red, Vogues-Praskauer, dan

citrate). Jadi untuk dapatmenyimpulkan E. coli berada pada air atau

makanan diperlukan seluruh

tahapan pengujian di atas. Apabila dikehendaki untuk mengetahui serotip

e dari E. coli yangdiperoleh untuk memastikan apakah E.coli tersebut

patogen atau bukan maka dapatdilakukan uji serologi. Meskipun

demikian, beberapa serotipe patogen tertentu sepertiO157:H7 yang

ganas tidak dapat diuji langsung dengan pengujian 4 tahap ini

danmemerlukan pendekatan analisis khusus sejak awal Escherichia coli

adalah spesies yang paling penting dari genus Escherichiadan

merupakan flora normal yang dapat menyebabkan infeksi pada saluran

kencing,luka, bakterimia, septisemia dan meningitis serta infeksi

gastrointestinal. Sehubungan dengan infeksi pada usus dikenal lima jenis

Escherichia coli, yaitu:

1. Enteropathogenik Escherichia coli (EPEC) EPEC menyebabkan

diare pada bayi atau anakanak kurang dari 1 tahun

dan jarang pada orang dewasa dengan gejala berupa demam tida

k tinggi, muntah,malaise dan diare

2. Enterotoxigenik Escherichia coli (ETEC)ETEC menyebabkan diare

pada anak
 anak dan dewasa di daerah tropis dansubtropics pada Negara

yang sedang berkembang. Infeksi ETEC ditandai dengangejala

demam rendah dan tinja encer

3. Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC)EIEC menyebabkan diare

mirip dengan yang disebabkan oleh shigella, baik pada anak anak

maupun orang dewasa. Tinja agak encer bahkan seperti

air,mengandung nanah, lender dan darah dengan gejala panas

dan malaise

4. Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) EHEC dikenal

sebagai penyebab diare hemorhagik dan colitis serta

hemolyticuremic syndrome (HUS) yang ditandai dengan jumlah

trombosit berkurang,anemia hemolitik dan kegagalan ginjal. Tinja

encer berair, mengandung darah danabdomen terasa sakit, kram

serta demam rendah atau tanpa demam

5. Enterodherant Escherichia coli (EAEC)EAEC menyebabkan diare

dengfan cara menempel kuat pada permukaan mukosausus

dengan gejala tinja encer berair, muntah, dehidrasi, dan biasanya

sakit padaabdomen.

Escherichia coli membentuk asam dan gas dari glukosa,

laktosa, fruktosa, galaktosa, arabinosa, xylosa, ramnosa, dan

manitol, kadangkdang dapat mengurai sukrosa, rafinosa, salisin,

eskulin, dulsitol, dan gliserol. Jarang mengurai pectin dan adonitol,

tidak mengurai dekstrin, pati, glikogen dan inositol. Methyl red test

positif, voges Preskauer negative, kalatase postif, tidak mencerna

 atau mencairkan gelatin, indol positif, mereduksi nitrat,

mengkoagulasikan serta mengasamkan susu tanpa peptonasi,

mengoksidasi kentang menjadi warna coklat tua dan tidak

membentuk H2S (Rosilawati dkk, 2011)

Menurut Rosilawati (2011) media selektif adalah media khusus

Bakteri E.Coli memproduksi kebih banyak asam di dalam medium

glukosa yang dapat dilihat dari indikator merah metal,memproduksi indol,tetapi

tidak memproduksi asetoin dan tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber

karbon.

Escherichia coli merupakan bakteri yang rentan terhadap suhu tinggi.

Escherichia coli mempunyai suhu maksimum pertumbuhan 40-45°C, di atas suhu

tersebut bakteri Escherichia coli mengalami inaktivasi (Budiarti, 2009)

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang

pendek yang memiliki panjang sekitar 2 μm, diameter 0,7 μm, lebar 0,4-0,7μm

dan bersifat anaerob fakultatif. Escherichia coli membentuk koloni yang bundar,

cembung, dan halus dengan tepi yang nyata.

Escherichia coli yang menyebabkan diare dapat dikelompokkan menjadi

tiga kategori, yaitu enteropatogenik, enteroinvasif, dan enterotoksigenik:

1.        Escherichia coli enteropatogenik menyebabkan gastroenteritis akut pada

bayi yang baru lahir sampai pada yang berumur dua tahun. Bagaimana

mekanisme kelompok Escherichia coli ini di dalam menyebabkan diare masih

belum diketahui, tetapi diketahui bahwa kolonisasi usus halus kosong dan ujung

usus bagian atas oleh galur enteropatogenik merupakan prasyarat.

2.        Echerichia coli enteroinfasif menyerang sel-sel epitel usus besar dan

menyebabkan sindrom klinis yang mirip sidrom yang disebabkan oleh Shingella.

Galur-galur bakteri ini dikenal sebagai enteroinvasif.

3.        Echerichia coli enterotoksigenik (yang menghasilkan enterotoksin)

menghasilkan salah satu atau kedua macam toksin yang berbeda. Beberapa

galur menghasilkan yang tahan panas (TP), sedangkan yang lain sebagai

tambahan mensintesis juga toksin yang tidak tahan panas (TTP). Beberapa galur

hanya menghasilkan TTP. Ke daua macam toksin tersebut menyebabkan diare

pada orang dewasa dan anak-anak (Adi, 2009).

C. Alat dan Bahan

C. Alat dan Bahan

a. Alat

No. Nama Alat Spesifikasi

1. Tabung Reaksi Uk 20 mL

2. Tabung Durham

3. Pipet Volume Uk 10 mL

4. Balp

5. Mikropipet Uk 100 uL dan 1000 uL

6. Tip Biru

7. Tip Kuning

8. Cawan Petri

9. Ose Bulat

10. Bunsen
11. Rak Tabung Reaksi

12. Erlenmayer Steril Uk 100 mL

13. Autoklaf Suhu 37°C

b. Bahan
No. Nama Bahan Spesifikasi

1. Sampel air keran

2. Lactose Broth (LB)

3. Brilliant Green Lactose Bilebroth

4. Eosin Methylene Blue Agar

5. Alkohol 70%

6. Kertas label

7. Korek api
Prosedur kerja

 Hari Pertama

Dilakukan pengambilan sampel air sumur dengan cara bersihkan

mulut keran dengan alkohol, kemudian disterilkan dengan dengan

cara membakar mulut keran dengan api. Dibuka penuh keran dan

dibiarkan mengalir selama 2-3 menit, lalu tampung airnya ¾ bagian

botol. Dilanjut dengan uji presumtif dengan ditanam pada 9 tabung

yang berisi media Lactose Broth double strain yang kemudian

dipipet sampel air sebanyak 10 mL dimasukan ke 3 tabung pertama,

sebanyak 1 mL sampel air ke 3 tabung kedua , sebanyak 0,1

sampel air ke 3 tabung ketiga. Dihomogenkan secara perlahan agar

tidak terdapat gelembung, kemudian inkubasi pada suhu 37°C

selama 24 jam.

 Hari Kedua

Dilakukan uji penegas dengan ditanamkan hasil positif (+) dari uji

presumtif sebanyak 1 ose ke dalam tabung, jumlah tabung sesuai

dengan hasil positif dari uji presumtif. Diinkubasi dengan suhu 37°C

selama 24 jam.

 Hari ketiga

Dilakukan perbandingan hasil uji penegas dengan tabel MPN untuk

menentukan perkiraan jumlah bakteri Escherichia coli pada sampel

air kemudian dilakukan uji pelengkap dengan ditanamkan dengan

ose hasil positif dari uji penegas kemedia Eosin Methylene Blue

Agar ( EMB). Kemudian inkubasi dengan suhu 37°C selama 24 jam.

 Hari keempat
 Dia mati hasil dari uji pelengkap.

D. Hasil pengamatan

Hari ketiga pengamatan uji biokimia

No Media Hasil Keterangan

1 Uji gula-gula

Glukosa Positif Fermenter glukosa (+)

gas

Sukrosa Positif Fermenter sukrosa (+)

gas

Laktosa Positif Fermenter laktosa (+)

gas

Manitol Positif Fermenter manitol (+)

gas

2 SIM Negatif/Positif/Positif Sulfur(-), Indol (+),

Motiliti (+)

3 MR Positif Fermenter glukosa

4 VP Negatif Nonfermenter glukosa

5 Simon Citrat Positif Hijau-> Biru

6 Urease Positif Terjadi perubahan

warna pink/kuning

7 TSIA

Lereng Positif Kuning/kuning

 Dasar Positif Kuning/kuning

Sulfur Negative Tidak terbentuk H2S

Gas Positif Terbentuk Gas

E. Pembahasan

Hari pertama dilakukan penanaman sampel urine pada media Mac Conkey.

Media Mac Conkey ini dapat menghambat bakteri Gram positif (+) karena

mengandung empedu, Mac Conkey juga mengandung indicator neutral red

yang dapat memberikan warna merah pada media Mac Conkey tersebut.

Setelah sampel urine tersebut ditanam pada media Mac Conkey kemudian

di inkubasi selama 24 jam  pada suhu 37°C kemudian didapatkan koloni

yang diduga merupakan bakteri Escherichia coli. karena mempunyai

morfologi koloni dengan cirri-ciri berbentuk  bulat, berwarna merah muda

atau pink, ukuran koloni 1-2 mm, elevasi cembung, dan  pinggiran rata.

Kemudian karena koloni yang didapat pada hari pertama terlalu menumpuk

dan koloni yang terpisah kurang dari sepuluh koloni, maka dilakukan

subkultur pada media yang sama untuk mendapat koloni murni yang

terpisah. Setelah didapatkan koloni murni yang terpisah pada hari kedua

dilakukan uji  biokimia pada gula-gula cair ( manitol, sukrosa, laktosa, dan

glukosa ), SIM, Simon Citrate, TSIA, MR, VP, dan Urease. Setelah

dilakukan penanaman pada uji biokimia dan di inkubasi selama 24 jam

pada suhu 37°C.

Pada saat dilakukan pengamatan pada MAC (Mc Conkey Agar) terlihat

media berwarna pink koloni berbentuk bulat diameter 1 mm, permukaan

basah, sifat hemolisis fermenter laktosa, kemudian dilakukan pewarnaan

Gram didapat bakteri Gram (-) berwarna merah lalu dilanjutkan pada media

uji biokimia.

Pengamatan pada hari selanjutnya pada media gula-gula, hasil dari

pengamatan untuk uji gula-gula adalah positif dengan adanya perubahan

warna disemua tabung, dan terbentuknya Gas.

Pada uji SIM didapat positif pada indol dan motility tetapi negative pada

sulfur artinya bakteri tidak menghasilkan indol dengan menggunakan enzim

tryptopan. Bakteri yang memiliki enzim tryptopanase menghidrolisis

menjadi indol. Piruvat dan amonia. Uji indol dilakukan dengan inokulasi

organisme uji kedalam tryptopan broth yang mengandung tryptopan indol

yang menghasilkan dideteksi dengan menambahkan reagen kovac’s ini

yang menghasilkan cincin berwarna merah.

Hasil uji indol pada isolat bakteri E. coli adalah positif yang ditunjukan

adanya cincin merah pada bagian atas. Hasil pengamatan uji motilitas E.

coli adalah positif, hal ini ditunjukan adanya pertumbuhan bakteri disekitar

area penusukan. Pergerakan dari bakteri tersebut karena media semisolid

(uji motilitas) dirancang dengan mengurangi konsentrasi agar pada media

yaitu sekitar 0,4% pada media yang hanya cukup untuk mempertahankan

bentuknya sementara memungkinkan pergerakan bakteri bergerak

(Leboffe, 2011)

Uji Simon Citrat didapat hasil positif yaitu perubahan warna dari hijau

menjadi biru . Uji ini bertujuan mendeteksi kemampuan suatu organisme

untuk memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan

energi. Bakteri diinokulasi pada medium yang mengandung natrium sitrat

dan indikator pH bromothymol biru. Media juga mengandung garam

amonium anorganik, yang digunakan sebagai satu-satunya sumber

nitrogen. Pemanfaatan sitrat melibatkan enzim citrat permease, yang

memecah sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat. Oksaloasetat lebih lanjut

dipecah menjadi piruvat dan CO2. Produksi Na2CO3 serta NH3 dari

pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium masing-masing

menghasilkan pH basa. Hal ini menyebabkan perubahan warna medium

dari hijau menjadi biru. Seharusnya pada identifikasi E. colihasil

pengamatan untuk uji Citrat adalah negatif yang ditunjukan tidak adanya

perubahan warna terhadap media uji citrat (Hemraj, 2013).

Hasil pengamatan dari uji urease yang telah dilakukan adalah positif , hal

ini ditunjukan karena terjadi perubahan warna pada media uji urea. Uji

Urease berguna untuk mengidentifikasi organisme yang mampu

menghidrolisis urea yang dapat menghasilkan amonia dan karbon dioksida

terutama untuk mengetahui mikrooeganisme tersebut mempunyai enzim

urease atau tidak. Urease merupakan enzim konstitutif yang menghidrolisis

urea menjadi karbon dioksida dan ammonia. Urea dihidrolisis menjadi

amonia oleh organisme positif urease akan mengatasi buffer dalam jangka

menengah dan mengubahnya dari kuning menjadi merah muda. Hasil dari

pengamatan untuk uji TSIA pada E. coli menunjukan hasi M/K dengan gas

positif dan H2S negatif. Pada identifikasi E. coli memberikan hasil K/K

dengan gas positif dan H2S negative karna Warna kuning pada

keseluruhan media tersebut dikarenakan E. coli pada media TSIA dapat

memfermentasikan glukosa, laktosa dan sukrosa. Gas positif dikarenakan

gas yang dihasilkan oleh fermentasi karbohidrat akan muncul sebagai celah

di media atau akan mengangkat agar-agar dari bagian bawah tabung

(Leboffe, 2011). Hasil pengamatan untuk Uji MR pada isolat bakteri E. coli

adalah positif yang ditunjukkan dengan larutan berwarna merah. Uji MR

bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme dalam memproduksi

dan mempertahankan produk akhir asam stabil dari fermentasi glukosa.

Beberapa bakteri menghasilkan sejumlah besar asam dari fermentasi.

Methyl Red adalah indikator pH, yang tetap berwarna merah pada pH 4,4

atau kurang. Setelah inkubasi, indikator pH Methyl Red ditambahkan ke

dalam kultur bakteri. Methyl Red berwarna merah pada pH di bawah 4,4

(hal ini menunjukkan hasil positif) dan kuning pada pH di atas 6,0. Warna

oranye menunjukkan pH menengah dan dianggap hasil negatif (Hemraj,

2013).

Hasil pengamatan uji VP negative karna tidak terjadi perubahan warna

menjadi ungu. Uji VP adalah tes yang digunakan untuk mendeteksi acetoin

dalam kultur cair bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan

alpha-naftol dan KOH 40%. Warna ungu menunjukkan hasil yang positif,

sedangkan hasil negative tidak terbentuk cincin ungu sampai kecoklatan.

Tes ini tergantung pada pencernaan glukosa menjadi acetylmethylcarbinol.

Jika glukosa pecah, maka akan bereaksi dengan alpha-naftol (VP reagen

1) dan kalium hidroksida (VP reagen 2) untuk membentuk warna merah.

Alpha-naftol dan kalium hidroksida adalah bahan kimia yang mendeteksi

acetoin. Berdasarkan uji-uji yang kami lakukan, sampel tersebut mengarah

ke bakteri Gram negatif E.Coli dan Citobacter sp, namun setelah dilakukan

uji derajat kemiripan bakeri tersebut lebih mengarah ke E.coli.

Kesamaan bakteri : (Jumlah parameter sesuai)/(Jumlah total parameter) X

100% = 13/15 X 100% = 86,6%

F. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum identifikasi E.coli pada sampel air sumur terebut

tidak terdapat bakteri E.coli.

G. Daftar Pustaka

- Rosilawati Erni, R. Ratnasari, H.E. Narumi, Suryani, W. Tyasnigsih,

S. Chusniati. 2011. Mikrobiologi Veteriner I. AUP Unair. Surabaya

- Sri. 2010. Penyakit Infeksius I. AUP Unair. Surabaya

- Budiarti, T. 2009. Fisiologi Mikroba. Bumi Aksara. Jakarta

I. Lampiran
H.