Subscribe to DeepL Pro to translate larger documents.

Visit www.DeepL.com/pro for more information.

Bab 2
Metodologi PCR

Ian Carter, Catriona Halliday, Theo P. Sloots, Todd M. Pryce, Ian D. Kay,
Gerald B. Harnett, Glenys R. Chidlow, dan Philip M. Giffard

Abstrak Metodologi PCR telah tertanam kuat di banyak laboratorium klinis untuk
mendeteksi berbagai macam organisme, karena metodologi ini menawarkan
keuntungan utama berupa peningkatan sensitivitas dan kecepatan dibandingkan
metode diagnostik tradisional. Namun, banyak variabel yang perlu
dipertimbangkan dalam melakukan pengujian PCR yang andal, mulai dari
ekstraksi asam nukleat, penyimpanan, komposisi campuran reaksi PCR yang
digunakan, hingga dinamika reaksi amplifikasi. Untuk mengontrol variabel-
variabel ini, ada kebutuhan yang jelas untuk reagen standar dan program jaminan
kualitas untuk mendapatkan hasil yang dapat direproduksi dan signifikan secara
klinis. Potensi diagnostik teknologi PCR telah sangat ditingkatkan dengan
pengembangan metode PCR multipleks, real-time, dan kuantitatif, dan ini
sekarang secara rutin dilakukan di banyak laboratorium diagnostik. Baru-baru ini,
PCR telah diterapkan pada pengetikan bakteri, dan prediksi yang masuk akal
adalah bahwa dalam waktu dekat, pengetikan bakteri akan dilakukan dengan
beberapa varian pengurutan generasi mendatang, atau dengan analisis HRM dari
penanda yang dipilih, tergantung pada jumlah informasi yang diperlukan.

Kata kunci Ekstraksi - Penyimpanan - DNA - RNA - PCR Konvensional -

Komponen PCR - Amplifikasi - Deteksi - Keterbatasan - PCR waktu nyata - Probe
- Instrumentasi - PCR Kuantitatif - Kontrol internal - PCR Multipleks - Aplikasi -
Pengetikan molekuler

2.1 Ekstraksi, Pemurnian, dan Penyimpanan Asam Nukleat

Ian Carter

Penerapan PCR dan metode lain dalam biologi molekuler memerlukan ekstraksi
asam nukleat dari sampel biologis dan sejumlah pendekatan telah dilakukan.

I. Carter (✉)
Divisi Mikrobiologi SEALS, Rumah Sakit Prince of Wales, Randwick, NSW 2031,
Australia e-mail: ian.carter@sesiahs.health.nsw.gov.au
M. Schuller dkk. (eds.), PCR untuk Mikrobiologi Klinis, 11
DOI 10.1007/978-90-481-9039-3_2, ∗C Springer Science+Business Media B.V. 2010
12 I. Carter et al.

dirancang untuk melakukan ekstraksi ini. Asam nukleat umumnya tidak terdapat
sebagai molekul bebas, melainkan di dalam bakteri, sel, partikel virus, jamur,
protozoa, dan lain-lain, karena asam nukleat ditutupi oleh membran dan dinding
sel yang tersusun atas protein, lipid, dan gula. Asam nukleat itu sendiri
membentuk kompleks dengan histon dan protein lain dan untuk mengekstrak asam
nukleat yang ada dengan cara ini, membran sel dan dinding yang menutupinya
harus terganggu dan protein dari kompleks yang disebutkan di atas terdenaturasi
atau terdegradasi sehingga menjadi larut, sehingga asam nukleat dibebaskan dan
kemudian diekstraksi.
Dalam hal mengisolasi asam nukleat, kompleks asam nukleat-protein perlu
didenaturasi atau didegradasi untuk membebaskan asam nukleat yang diinginkan
dari kompleks tersebut sehingga dapat dilarutkan dan diekstraksi.
Dalam beberapa tahun terakhir, sejumlah pendekatan telah dikembangkan
untuk ekstraksi cepat asam nukleat dari berbagai bahan, termasuk darah, darah,
serum, feses, urin, jaringan (termasuk yang tertanam dalam parafin), kultur sel,
DNA plasmid dari lisat basil dan DNA genom dan RNA total dari darah, jaringan
hewan dan manusia atau tumbuhan dan kultur sel.
Metode-metode ini tidak hanya memberikan kemudahan dan kenyamanan
dalam pemrosesan, tetapi juga memungkinkan pemrosesan sampel dalam jumlah
besar [70]. Banyak situs web yang tersedia untuk membantu para ilmuwan - salah
satu situs web yang sangat baik yang menggabungkan banyak tautan ke protokol
dapat ditemukan di http://www.molecularstation.com/.
Asam nukleat telah diekstraksi secara konvensional dengan salah satu atau
kombinasi dari metode berikut:

• Ekstraksi dengan fenol dan campuran fenol/kloroform untuk pemurnian DNA

dan RNA. Protein dan enzim restriksi dihilangkan dengan fenol dan kloroform.
roform dalam mengganggu struktur sekunder protein yang menyebabkan
protein berubah sifat dan mengendap dari larutan. Meskipun masing-masing
pelarut ini mampu melakukan fungsi ini sendiri, kedua bahan ini bersama-sama
menghilangkan protein dari larutan dengan jauh lebih efektif. Asam nukleat
dipulihkan dalam fase cair.
• Asam nukleat dilepaskan dengan menggunakan zat denaturasi dan pereduksi
yang kuat, termasuk enzim hidrolitik (misalnya protease, lisozim, litikase), dari
sel dan
jaringan dan kemudian diekstraksi dan dimurnikan dengan campuran kloroform
dan fenol. Asam nukleat akhirnya diperoleh dari fase air dengan pengendapan
etanol atau penyempitan melalui dialisis [63] atau penangkapan melalui resin
silikon atau partikel magnetik.
• Proteinase K1/Metode fenol, di mana enzim proteolitik seperti proteinase K atau
surfaktan ditambahkan untuk mengganggu membran atau dinding sel dan
protein

1Proteinase K adalah protease yang umum digunakan yang tersedia secara komersial sebagai
bubuk terliofilisasi atau dalam larutan atau suspensi air (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Aktivitas khas sediaan proteinase K adalah sekitar 30 Unit / mg. Konsentrasi proteinase K dalam
komposisi ekstraksi lebih disukai setidaknya sekitar 25 unit / ml atau lebih besar, setidaknya
sekitar 50 unit / ml atau lebih besar atau setidaknya sekitar 100 unit / ml atau lebih besar.
Konsentrasi maksimum dipengaruhi oleh kelarutan enzim serta kemampuan untuk mendenaturasi
enzim secara memadai pada akhir ekstraksi sehingga
2 Metodologi PCR 13

kompleks yang diminati didegradasi menjadi asam nukleat bebas; kemudian

fenol/kloroform ditambahkan dan campuran disentrifugasi agar asam nukleat
ditransfer ke dalam fase air; fase air dipulihkan dengan pemisahan dan etanol,
isopropanol, atau sejenisnya ditambahkan ke dalam fase air yang dipulihkan,
sehingga membuat asam nukleat tidak dapat larut [63].
• Metode AGPC, di mana campuran cairan guanidinium isothiocyanate dan fenol
ditambahkan ke sampel yang diinginkan untuk mengganggu membran sel dan
dinding, sehingga protein kompleks terdenaturasi menjadi larut; asam nukleat
kemudian dibebaskan dan kloroform ditambahkan untuk memindahkan asam
nukleat ke fase berair; fase berair dipulihkan dengan pemisahan dan setelah itu,
etanol, isopropanol, atau sejenisnya ditambahkan ke fase berair yang
dipulihkan, sehingga membuat asam nukleat menjadi tidak larut [15]. Metode
ini sering menggunakan formulasi eksklusif dari reagen yang disebut Trizol
(Trizol adalah larutan kimia yang digunakan dalam ekstraksi RNA / DNA /
protein dan merupakan merek produk dari Invitrogen).
• Metode guanidinium, di mana guanidinium hidroklorida atau guanidinium
tiosianat ditambahkan ke sampel yang diinginkan untuk mengganggu membran
sel dan
dinding, sehingga protein kompleks terdenaturasi menjadi larut dan untuk
menghilangkan pengotor terlarut; asam nukleat kemudian dibebaskan dan
etanol atau iso-propanol ditambahkan untuk membuat asam nukleat bebas tidak
larut. Elusi asam nukleat yang terikat dari bahan pendukung menggunakan air
atau buffer rendah garam seperti 10 mmol/l Tris atau TE (10 mmol/l Tris, 1
mmol/l EDTA). Keuntungan dari metode ini adalah garam chaotropik
memastikan denaturasi yang tidak dapat diubah dan dengan demikian inaktivasi
nuklease. Kerugian penting dari metode ini adalah bahwa konsentrasi garam
chaotropik sampai batas tertentu harus sangat disesuaikan dengan bahan yang
digunakan, dan juga lisis bahan biologis, seperti jaringan jamur atau tanaman,
kadang-kadang hanya sangat tidak efisien (ini mungkin memerlukan inklusi
protease awal untuk melarutkan dinding sel yang lebih tebal). Jika enzim
(proteinase, RNase) digunakan dalam metode pemurnian, konsentrasi agen
chaotropik harus dikurangi di bawah nilai yang jika tidak akan menyebabkan
inaktivasi nuklease [15, 63].
• Metode natrium iodida, di mana natrium iodida yang mengandung glikogen
yang memiliki afinitas terhadap asam nukleat yang akan diekstraksi
ditambahkan ke dalam sampel yang diinginkan,
dimana membran dan dinding sel terganggu dan protein kompleks
terdenaturasi, sehingga menjadi larut; asam nukleat kemudian dibebaskan dan
isopropanol ditambahkan untuk membuat asam nukleat bebas dan glikogen
tidak larut [32].

Larutan yang mengandung asam nukleat juga dapat diperoleh dengan inkubasi
bahan yang mengandung asam nukleat dengan buffer lisis, yang mengandung (i)
garam chaotropik seperti garam guadinin, (ii) senyawa basa seperti NaOH, (iii)
detergen netral, anionik, atau kationik seperti natrium dodesil sulfat (SDS), Triton

bahwa tidak akan ada penurunan aktivitas DNA polimerase selama amplifikasi PCR selanjutnya dari
asam nukleat yang diekstraksi.
14 I. Carter et al.

X- 0, TWEEN-20 atau heksadesil trimetil amonium bromida CTAB atau (iv)

enzim seperti proteinase K atau lisozim pada bakteri, litikase pada ragi, kitinase
pada jamur, atau protease pada jaringan. Semua pendekatan tersebut bertujuan
untuk melisiskan sel dan melepaskan asam nukleat dan dapat diikuti dengan
ekstraksi menggunakan fenol dan/atau kloroform [63].
Metode ini digantikan oleh metode yang lebih cepat dan lebih mudah yang
dirancang oleh Boom dkk. [10]. Metode ini didasarkan pada sifat melisiskan dan
menonaktifkan nuklease dari agen chaotropik guanidinium tiosianat bersama
dengan sifat pengikatan asam nukleat dari partikel silika atau diatom dengan
adanya agen ini. Dengan menggunakan partikel silika yang difraksinasi
ukurannya, asam nukleat (DNA untai ganda melingkar tertutup kovalen,
melingkar rileks, dan linier; DNA untai tunggal; dan rRNA) dapat dimurnikan dari
12 spesimen yang berbeda dalam waktu kurang dari 1 jam dan diperoleh kembali
di dalam bejana reaksi awal.
Metode "klasik" ini sangat memakan waktu (terkadang memakan waktu hingga
48 jam), membutuhkan peralatan yang cukup banyak, dan bahan biologis dalam
jumlah yang relatif besar dan, sebagai tambahan, melibatkan risiko kesehatan yang
cukup besar (di antaranya karena penggunaan kloroform dan fenol).
Metode-metode yang lebih baru dipasarkan secara komersial dalam bentuk kit
ekstraksi yang mudah digunakan (beberapa dalam format ekstraksi asam nukleat
total yang luas) lihat Tabel 2.1, dan didasarkan pada prinsip bahwa asam nukleat
berikatan dengan mineral pendukung dengan adanya kekuatan ionik yang tinggi,
terutama garam-garam chaotropik. Serbuk kaca yang ditumbuk halus (misalnya
Promega, MoBio), tanah diatom (Sigma), gel silika (Qiagen) atau bahan yang
dimodifikasi secara kimiawi seperti silika karbida juga dapat digunakan dan telah
terbukti berhasil sebagai bahan pendukung. Ambion, Applied Biosystems,
Epicentre Technologies, Invitrogen, MO BIO Laboratories, Inc, QIAGEN, Roche
Diagnostics, dan Sigma Aldrich, adalah beberapa Perusahaan besar dengan kit dan
metode ekstraksi manual dan masih banyak lagi perusahaan-perusahaan kecil yang
berlomba-lomba dalam bisnis ini. Namun banyak perusahaan kecil yang dibeli oleh
perusahaan besar.

Tabel 2.1 Perusahaan "Besar" dengan kit ekstraksi DNA dan RNA manual

Ambion http://www.ambion.com/
Bioline http://www.bioline.com
Episentrum http://www.epibio.com/main.asp
Bioteknologi
Invitec http://www.invitek.eu/
Invitrogen http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-
Services/Applications/Nucleic-Acid-Purification-and-Analysis.html
Machery Nagelhttp://www.mn-net.com/tabid/1293/Default.aspx
MO BIO http://www.mobio.com/nucleic-acid-purification/
Laboratorium Inc
Promega http://www.promega.com/applications/dna_rna/gdna.htm
Roche Highpure Kit https://www.roche-applied-science.com/sis/napure/index.jsp
Rangkaian produk Qiagen
http://www1.qiagen.com/Products/GenomicDnaStabilizationPurification/
ClinicalSamples.aspx
Sigma Aldrichhttp://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-
and-rna- pemurnian.html
2 Metodologi PCR 15

perusahaan dan hal ini kemungkinan besar akan terus berlanjut selama beberapa
tahun ke depan. Selain itu, banyak metode yang telah menjadi subjek kekayaan
intelektual dan paten kerang dan hal ini juga membatasi pengembangan lebih
lanjut dengan beberapa metodologi.
Beberapa kit komersial ini dapat digunakan pada berbagai bentuk pelat
ekstraksi robotik - yang membuat sistem robotik ini lebih menarik karena kit yang
lebih cepat, lebih baik, dan lebih murah tersedia. Lihat Tabel 2.2 untuk sistem
utama yang tersedia di Australia. Sistem otomatis memungkinkan Anda untuk
menjalankan 1 hingga 96 sampel sekaligus dengan waktu yang singkat. DNA
dan/atau RNA dapat diekstraksi dalam jangka waktu sekitar 10 menit hingga 2
jam. Beberapa sistem yang lebih besar juga merupakan "Sistem Terbuka" yang
memungkinkan untuk menyesuaikan metode sendiri dan/atau kit komersial pada
mesin. Sistem lainnya bersifat tertutup tanpa ada perubahan dalam prosedur
tertentu. Pemasok utama adalah Roche, Qiagen, Abbott, Biomerieux, Thermo
Scientific, Promega, Invitrogen, Ambion, dan Epicentre Biotechnologies dengan
kemajuan yang berkelanjutan dari sebagian besar - apa yang ada hari ini dapat
berubah besok yang membuat spesifikasinya menjadi sedikit lebih menantang!
Namun sistem otomatis tidak cocok untuk semua laboratorium karena harganya
tidak murah dan tergantung pada target dan metode PCR yang digunakan, asam
nukleat "berkualitas" seperti itu mungkin tidak diperlukan.
Metode berdasarkan silika tidak melibatkan penggunaan garam chaotropik.
Keuntungan dari metode yang tersedia secara komersial adalah asam nukleat dapat
diekstraksi bahkan dari bahan dengan kandungan asam nukleat yang sangat kecil
dengan protokol universal. Kerugiannya adalah bahwa sediaan asam nukleat
mungkin tidak memenuhi standar kualitas yang tinggi (termasuk rasio
pengukuran-penyerapan fotometrik kurang dari 1,70 pada 260 nm hingga 280 nm)
dan hal ini dapat meningkatkan potensi penghambatan dalam reaksi PCR. Ada
kemungkinan bahwa penghambat PCR (protein heme, surfaktan anionik, surfaktan
kationik, surfaktan non-ionik, dan surfaktan zwitterionik) terkadang dapat
mengganggu amplifikasi PCR berikutnya. Oleh karena itu, penghambat ini
mungkin ada dalam larutan ekstraksi atau diperoleh sebagai bagian dari proses
ekstraksi dari sampel biologis atau dari sumber lain. Kehadiran penghambat PCR
dalam larutan ekstraksi akan menghasilkan sedikit atau tidak ada amplifikasi asam
nukleat dan ini akan dianggap sebagai tidak adanya ekstraksi yang efektif dari
sampel. Di situlah pentingnya penyertaan beberapa bentuk kontrol internal dalam
PCR dan mengapa standar mendorong penyertaannya.
Oleh karena itu, metode yang dipilih untuk membuat DNA total dan RNA total
dengan kemurnian tinggi (termasuk tRNA, mRNA, rRNA, RNA mitokondria, dan
hnRNA (RNA nuklir heterogen - berbagai RNA yang terdapat dalam nukleus,
termasuk skrip transkrip primer), yang dapat digunakan secara universal
sehubungan dengan bahan sumber yang mengandung asam nukleat dan cepat serta
mudah ditangani, akan memerlukan evaluasi untuk mengoptimalkan metode untuk
setiap aplikasi ekstraksi dan kombinasi PCR untuk jenis dan metode spesimen
yang dipilih.
Oleh karena itu, sangat penting untuk memulai dengan apa sebenarnya target
Anda untuk PCR. Hal i n i tercermin dalam premis dasar bahwa PCR itu sendiri
hanya dapat mengamplifikasi DNA melalui aksi enzim DNA polimerase. Banyak
target mungkin merupakan bentuk RNA yang kurang stabil, baik itu RNA
pembawa pesan, transfer, atau virus, dan fitur RNA yang lebih labil inilah yang
16 I. Carter et al.
membuat ekstraksi, pemurnian, dan penanganan RNA menjadi prosedur yang
lebih ketat. Idealnya proses yang digunakan harus cepat, sederhana, dapat
direproduksi dan ini memiliki
2 Metodologi PCR 17

16
Tabel 2.2 Sistem otomatis untuk ekstraksi asam nukleat
Perusahaan Unit Tidak ada Situs web perusahaan
sampel
Abbott Molecular m24sp 1-24 http://international.abbottmolecular.com/m2000_1602.aspx
m2000sp 96 http://international.abbottmolecular.com/m2000_1602.aspx
MagMAXTM Express-96 https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&
Biosistem Terapan 96 catID=605139&tab=DetailInfo
ABI PRISMTM 6700 96 https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&
catID=600647&tab=DetailInfo
Biomerieux NucliSENS easyMAG 24 http://www.biomerieux-usa.com/servlet/srt/bio/usa/dynPage?doc=USA_PRD_LST_G_
PRD_USA_12
NucliSENS miniMAG 12 http://www.biomerieux-usa.com/servlet/srt/bio/usa/dynPage?open=USA_PRD_LST&
doc=USA_PRD_LST_G_PRD_USA_14&lang=en
Invitrogen Iprep 12 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/
Pemurnian-Asam-Nukleat-Dan-Analisis/Pemurnian-Asam-Nukleat-Otomatis/iPrep-
Instrumen-Pemurnian.html
PromegaMaxwel l 1616 http://www.promega.com/maxwell16/default.htm
QiagenQIASymphony SP96 www1.qiagen.com/Products/QIAsymphonySP.aspx
BioSprint 9696 www1.qiagen.com/Products/Automation/BioSprint96.aspx EZY1 advanced
XL 1-14 http://www1.qiagen.com/Products/EZ1AdvancedXL.aspx
EZY1 1-6 http://www1.qiagen.com/Products/EZ1Advanced.aspx
QIAcube 12 http://www1.qiagen.com/products/automation/qiacube.aspx?r=7249#Tabs=t5
BioRobot MDx24-96 http://www1.qiagen.com/Products/Automation/BioRobotMDxSystem.aspx
BioRobot MDx DSP96 http://www1.qiagen.com/Products/Automation/BioRobotMDxDSP.aspx Sistem
universal BioRobot96 http://www1.qiagen.com/products/automation/BioRobotUniversalSystem.aspx
AutopureLS atau 16 http://www1.qiagen.com/Products/Automation/AutopureLS.aspx
QIAxtractor 8-96 http://www1.qiagen.com/Products/QIAxtractor.aspx
RocheDiagnostik MagNA pure LC 2.0 System 32 https://www.roche-applied-science.com/sis/automated/index.jsp
Magna Pure Compact 1-8 https://www.roche-applied-science.com/sis/automated/index.jsp
Thermo ScientificKingfisher 24 http://www.thermo.com/com/cda/product/detail/1"11598,00.html
Kingfisher flex96 http://www.thermo.com/com/cda/product/detail/1"10136240,00.html Kingfisher mL15

I. Carter et al.
http://www.thermo.com/com/cda/product/detail/1"12616,00.html
Teknologi Diagnostik Tiagen LabTurbo 36 1-36 http://www.labturbo.com/index.php?op=products&item=overview&itemLevel=
lab36_compact
Tiagen LabTurbo 96 12-96 http://www.labturbo.com/index.php?op=products&item=overview&itemLevel=lab96
2 Metodologi PCR 17

telah ditingkatkan dengan berbagai metode komersial yang tersedia. Sederhananya

- asam nukleat harus diekstraksi sedemikian rupa sehingga dapat diamplifikasi
dengan PCR.
Ditambah dengan kemajuan ini adalah sistem ekstraksi robotik komersial yang
semakin banyak tersedia yang meningkatkan hasil dan mengurangi kebosanan dari
beberapa ekstraksi skala yang lebih kecil. Sistem ini dapat menggunakan ekstraksi
berbasis partikel magnetik (sebagian besar sistem through-put tinggi) atau sistem
ekstraksi berbasis resin silika. Sistem ini dapat mengekstraksi hingga 96 sampel
per proses, tetapi beberapa menggunakan lebih banyak bahan sekali pakai plastik
daripada yang lain dan beberapa dapat digunakan bersama dengan sistem
penanganan cairan untuk hasil yang lebih tinggi dari pengujian PCR. Hal ini
kemudian juga menjadi keputusan anggaran.
Dengan melihat metode-metode dalam teks ini, akan terlihat bahwa variasi
metode ekstraksi asam nukleat sangat luas. Banyak yang bersifat komersial,
banyak yang dilakukan pada platform robotik dan banyak yang merupakan
prosedur ekstraksi sederhana tanpa prosedur lisis dan pencucian ekstensif yang
diperlukan untuk asam nukleat berkualitas tinggi.
Prosedur sederhana lainnya untuk ekstraksi asam nukleat terdiri dari melisiskan
membran mikroorganisme dengan kombinasi tiga mode lisis alternatif: lisis
kimiawi menggunakan deterjen, lisis mekanis dengan agitasi dengan adanya
manik-manik (baik untuk gangguan dinding sel), dan lisis kejut panas dengan
pembekuan berulang dan inkubasi pada suhu
suhu yang sangat tinggi (sekitar 95-100◦ C). Semuanya memakan waktu.
Prosedur paling sederhana yang dapat digunakan dalam beberapa pengujian
adalah "rebus selama 10 menit
metode". Metode ini secara efektif melisiskan sel dan dapat menonaktifkan
mikroorganisme berisiko tinggi. Metode ini masih digunakan di beberapa
laboratorium dan untuk tes tertentu yang dievaluasi sepenuhnya untuk penggunaan
prosedur tersebut. Namun, ada potensi keberadaan faktor lain dalam sampel itu
sendiri yang dapat menghambat metode PCR yang sebenarnya digunakan. Ini
mungkin protein seluler atau histon, lipid, komponen dinding sel atau protein
heme yang berasal dari darah yang telah terbukti menghambat beberapa metode
PCR. Penghambatan ini paling sering terlihat pada ekstraksi DNA dari sampel
feses. Ekstraksi RNA yang lebih labil dari tinja juga membutuhkan metode yang
lebih sesuai untuk ekstraksi, stabilitas, dan penghindaran penghambatan. Beberapa
kit komersial telah dirancang dengan buffer atau tablet penghilang inhibitor untuk
aplikasi spesifik ini.
Tiga prosedur ekstraksi cepat utama tersedia dalam bentuk solusi siap pakai.
Hal ini dapat menghilangkan proses deproteinasi, ekstraksi organik, dialisis, dan
protokol pengendapan alkohol yang memakan waktu dan tenaga kerja yang
diperlukan dalam prosedur pemurnian DNA tradisional. Selain itu, dalam banyak
kasus, mereka dapat menggantikan prosedur ekstraksi robotik dan menghemat
waktu yang berharga:

1. Bio-Rad Laboratories memiliki larutan resin berbasis Chelex 20 ml untuk

pemurnian DNA siap PCR dari darah, sel yang dikultur, atau bakteri.
Prosedurnya cepat:
inkubasi sampel dengan matriks I n s t a G e n e ⃝ R pada suhu 56◦ C selama 15-30 menit,
kemudian rebus selama
8 menit. dan mikrosentrifus selama 2 menit untuk membuat pelet resin. DNA
18 I. Carter et al.

dalam supernatan
siap untuk PCR. Matriks I n s t a G e n e ⃝ R dibuat dengan 6% yang diformulasikan secara
khusus
Resin Chelex w/v dan membuat persiapan sampel DNA menjadi cepat, mudah,
dan hemat biaya. Matriks Chelex berikatan dengan penghambat PCR dan
menyerap lisis sel
2 Metodologi PCR 19

daripada DNA, mencegah hilangnya DNA karena pengikatan DNA yang tidak
dapat dipulihkan dan menghasilkan substrat yang lebih baik untuk amplifikasi
PCR.
http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&
productID=111001
2. Applied Biosystems memiliki reagen P r e p M a n ⃝ R Ultra Preparation 20 ml dan
dapat digunakan untuk berbagai aplikasi persiapan sampel yang berbeda. Telah
berhasil digunakan untuk menyiapkan template DNA dari bakteri, ragi, jamur
berserabut, baik dari piring atau dari apusan jaringan, sel manusia (usap bukal),
darah lengkap mamalia dan dari patogen yang ditularkan melalui makanan
Gram negatif untuk digunakan dalam reaksi amplifikasi PCR. Dengan
menggunakan protokol rebus dan putar sederhana, P r e p M a n ⃝ R Ultra Reagent secara
efisien menonaktifkan penghambat PCR dan secara signifikan mengurangi
kebutuhan untuk mengulangi langkah persiapan templat. P r e p M a n ⃝ R Ultra
Reagen adalah formulasi baru, yang dikembangkan sepenuhnya di Applied
Biosystems, dan merupakan larutan homogen yang tidak mengandung Chelex
atau jenis resin atau matriks lainnya. Reagen ini berbahan dasar etil glikol
monobutil eter dengan organoamina terhidroksilasi. Protokolnya cepat dan
mudah: resuspensi sampel dalam 200 μl
PrepMan⃝R
Reagen ultra atau tambahkan sampel secara langsung ke Ultra
dalam 200 μl PrepMan ⃝R
reagen, didihkan selama 10 menit, dinginkan selama 2 menit, sentrifugasi mikro
selama 2 menit, pindahkan 5 μl supernatan ke dalam alat uji.
https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=
catNavigate2&catID=602362&tab=Overview
3. EPICENTRE Bioteknologi memiliki serangkaian prosedur ekstraksi cepat
tergantung pada jenis sampel dan "target" ekstraksi - baik itu DNA atau RNA.
http://www.epibio.com/main.asp

RNA yang telah dimurnikan harus disimpan pada suhu -20◦ C atau -70◦ C
dalam air bebas RNase. Kita harus memastikan bahwa ketika RNA dimurnikan
menggunakan kit atau metode yang dipilih, tidak ada degradasi yang akan terjadi
selama penyimpanan. DNA yang telah dimurnikan harus disimpan pada suhu -20◦
C atau -70◦ C dalam kondisi yang sedikit basa (misalnya, Tris-HCl, pH 8.0) karena
asam akan merusak DNA.
dapat menyebabkan hidrolisis DNA. Lebih baik menyimpan larutan yang diencerkan
asam nukleat dalam alikuot dan mencairkannya sekali saja. Juga disarankan untuk
menyimpan alikuot dalam tabung silikon atau tabung dengan daya serap rendah
untuk menghindari adsorpsi asam nukleat pada dinding tabung, yang akan
mengurangi konsentrasi asam nukleat dalam larutan.
Teknologi stabilisasi asam nukleat yang baru memungkinkan penyimpanan
DNA dan RNA pada suhu kamar dengan cara yang hemat biaya dan ramah
lingkungan. Beberapa produk yang saat ini tersedia termasuk Biomatrica,
GenVault dan Qiagen QIAsafe DNA Tubes dan 96-well Plates. Teknologi inovatif
ini memberikan penyimpanan suhu ruangan yang menghemat biaya pendinginan
dan memudahkan transportasi. Pemulihan sampel semudah "cukup tambahkan
air"!
Sebuah penelitian terbaru [83] mengevaluasi dua produk baru untuk
penyimpanan DNA pada suhu ruangan: Teknologi DNA SampleMatrix dari
Biomatrica dan teknologi DNA GenTegra dari GenVault. Penelitian ini
membandingkan integritas dan kualitas DNA yang disimpan menggunakan
20 I. Carter et al.
produk-produk ini dengan DNA yang disimpan di dalam freezer dengan
melakukan pengujian hilir
2 Metodologi PCR 21

dengan PCR jarak pendek, PCR jarak jauh, pengurutan DNA, dan microarray
SNP. Selain itu, para peneliti menguji produk RNAstable Biomatrica untuk
kemampuannya mengawetkan RNA pada suhu kamar untuk digunakan dalam
transkripsi balik kuantitatif uji PCR.

2.2 PCR konvensional

Catriona Halliday

2.2.1 Pendahuluan
Penemuan polymerase chain reaction (PCR) pada tahun 1985 merevolusi
diagnosis penyakit menular di laboratorium klinis dengan memungkinkan deteksi
dan identifikasi patogen yang cepat, sensitif dan spesifik secara langsung dari
spesimen klinis, tanpa memerlukan kultur. Pengujian berbasis PCR
memungkinkan amplifikasi beberapa molekul target (secara teoritis satu sel) ke
tingkat yang dapat dideteksi, baik dari sel yang dapat hidup maupun yang tidak
dapat hidup. Aplikasi ini secara bertahap melengkapi atau menggantikan tes
berbasis kultur, biokimia dan imunologi di laboratorium diagnostik rutin [84].

2.2.2 Komponen PCR

Campuran reaksi PCR konvensional terdiri dari DNA target, dua primer, DNA
polimerase yang stabil terhadap panas, deoksinukleotida trifosfat (dNTP, termasuk
dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP), dan penyangga yang biasanya mengandung Mg2+
. Primer berukuran pendek (20-
30 pasang basa) oligonukleotida dengan urutan yang diketahui yang saling
melengkapi dengan kedua× ujung DNA target [54]. Kekhususan primer
menentukan keakuratan uji PCR sebagai asam nukleat berkualitas buruk atau latar
belakang non-target
DNA dapat mempengaruhi annealing spesifik dari primer. Hal ini dapat
mengakibatkan amplifikasi yang tidak spesifik dan kemungkinan salah tafsir hasil
[84].
Ketika asam nukleat target adalah RNA, reverse transcriptase disertakan dalam
reaksi PCR untuk mengubah RNA menjadi cDNA. Prosedur ini dikenal sebagai
PCR transkripsi balik (RT-PCR).
Uji PCR bersarang adalah jenis PCR konvensional yang menggunakan dua
pasang primer dalam dua reaksi yang terpisah dan berurutan. Reaksi awal
mengamplifikasi daerah target DNA dengan pasangan primer luar. Produk PCR
yang dihasilkan digunakan sebagai templat

C. Halliday (✉)
Pusat Penyakit Menular dan Mikrobiologi, Rumah Sakit Westmead,
Westmead, NSW 2145, Australia
e-mail: Catriona.Halliday@swahs.health.nsw.gov.au
22 I. Carter et al.

DNA untuk reaksi kedua, yang menggunakan set primer kedua yang terletak
secara internal dengan yang digunakan dalam reaksi pertama. Tes ini memiliki
sensitivitas dan spesifisitas yang lebih baik daripada tes amplifikasi tunggal dan
berguna untuk mendeteksi patogen dalam spesimen klinis. Namun, mereka lebih
rentan terhadap kontaminasi dari sisa produk PCR dari reaksi pertama ke reaksi
kedua [52].

2.2.3 Amplifikasi PCR dan Deteksi Produk

Amplifikasi PCR dilakukan secara otomatis dan dilakukan pada termosliter yang
diprogram untuk memanaskan dan mendinginkan ke suhu yang berbeda untuk
waktu yang berbeda-beda.
Setiap siklus PCR melibatkan tiga langkah: (i) denaturasi, (ii) anil, dan
(iii) ekstensi, dan siklus ini diulang 20-40 kali. Langkah-langkah untuk RT-PCR
pada dasarnya sama, setelah RNA ditranskripsi menjadi cDNA pada suhu 40-50◦
C. Selama denaturasi, templat DNA dipanaskan (94-96◦ C) untuk memisahkan
keduanya
Untaian DNA. Suhu kemudian didinginkan (50-65◦ C) selama langkah annealing
untuk memungkinkan primer spesifik menghibridisasi ke 3× ujung DNA yang
terpisah
helai. Suhu annealing tergantung pada panjang dan komposisi primer. Akhirnya,
selama perpanjangan (72◦ C), Taq DNA polimerase yang stabil terhadap panas
mengkatalisis pemanjangan primer dengan memasukkan dNTP gratis
yang berikatan dengan DNA target. Primer yang diperpanjang membentuk dua
untai baru DNA target untuk siklus PCR berikutnya. Secara teori, jumlah DNA
target harus berlipat ganda setelah setiap siklus PCR [54].
PCR "Hot-start" dikembangkan untuk meningkatkan amplifikasi dan
spesifisitas PCR dengan mengurangi amplifikasi non-spesifik selama penyiapan
PCR. Enzim Taq DNA polimerase Hot-start tidak aktif pada suhu sekitar,
mencegah perpanjangan primer yang tidak dianil secara spesifik atau
pembentukan dimer primer. Fungsional
Aktivitas enzim dipulihkan selama inkubasi pada suhu 95◦ C selama 5-10 menit
[17].
Setelah menyelesaikan tes PCR konvensional, produk yang diamplifikasi biasanya
adalah
dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa menggunakan pewarna fluoresen
pengikat DNA (misalnya etidium bromida) di bawah pencahayaan UV dan
panjang fragmen sebagai indikator untuk identifikasi [52].

2.2.4 PCR Konvensional di Laboratorium Diagnostik

Tes berbasis PCR sekarang diterima sebagai metode standar untuk mendeteksi
banyak virus dan bakteri di laboratorium mikrobiologi diagnostik, namun,
penggunaannya tertinggal untuk diagnosis jamur dan parasit karena tidak adanya
kit komersial dengan kontrol kualitas. Pengembangan teknologi PCR real-time
dan sistem ekstraksi DNA yang dikawinkan secara otomatis diharapkan dapat
meningkatkan keandalan pengujian konvensional [11].
2 Metodologi PCR 23

Umumnya, tes berbasis PCR konvensional hanya dapat mendeteksi satu

parameter, yang dapat membatasi cakupannya kecuali jika dicurigai adanya
patogen tertentu. Uji PCR rentang luas, yang menargetkan wilayah universal
seperti 16S-23S rRNA dan protein heat-shock, telah dikembangkan untuk
memungkinkan pengujian simultan untuk lebih dari satu organisme atau untuk
menyaring spesimen klinis untuk patogen. Jika tes PCR menghasilkan amplikon,
agen etiologi harus diidentifikasi dengan pengurutan DNA [52]. Tes PCR
multipleks, yang menggabungkan beberapa set primer dalam satu reaksi untuk
secara bersamaan mendeteksi banyak patogen juga telah dikembangkan, tetapi
mereka lebih cocok untuk teknologi PCR real-time.

2.2.5 Keterbatasan PCR Konvensional

Peningkatan yang cukup besar dalam sensitivitas dan spesifisitas analitik dari tes
berbasis PCR dibandingkan dengan tes diagnostik konvensional adalah
keuntungan utamanya, namun ada juga keterbatasannya. Setiap tes PCR
memerlukan optimasi reagen (Mg2+ dan primer) dan kondisi amplifikasi yang
cermat. Desain primer sangat penting untuk amplifikasi PCR yang efektif karena
reaksi silang dengan DNA non-target dapat menghasilkan produk yang tidak
spesifik. Biaya untuk melakukan tes molekuler tinggi dibandingkan dengan tes
diagnostik tradisional dan penggantian biaya sering kali rendah, terutama untuk tes
yang dikembangkan "di rumah" [54]. Selain itu, laboratorium yang melakukan tes
ini perlu menginvestasikan biaya yang cukup besar untuk ruang dan peralatan
laboratorium khusus "bebas DNA". Hal ini penting untuk meminimalkan
kontaminasi spesimen selanjutnya oleh amplikon PCR yang dapat menyebabkan
hasil positif palsu. Hal ini harus dipantau dengan memasukkan kontrol non-
template atau air di setiap PCR. Pengembangan teknologi PCR tabung tertutup,
real-time dan analisis kurva leleh telah sangat mengurangi risiko kontaminasi dan
hasil positif palsu. Degradasi DNA atau penghambat PCR dalam spesimen klinis
dapat menyebabkan hasil negatif palsu dan ini harus dipantau dengan memasukkan
kontrol positif internal.

2.2.6 Ringkasan
Tidak diragukan lagi bahwa pengembangan PCR telah merevolusi diagnosis
penyakit menular di laboratorium mikrobiologi rutin. Namun, banyak tes PCR
konvensional generasi pertama yang digantikan oleh platform PCR real-time yang
menawarkan peningkatan sensitivitas, spesifisitas, dan kecepatan, mengurangi
kontaminasi, serta potensi yang lebih besar untuk otomatisasi [52]. Terlepas dari
keterbatasannya, tes PCR konvensional akan terus memiliki peran di laboratorium
diagnostik regional yang lebih kecil yang mungkin tidak mampu membayar biaya
reagen dan instrumentasi yang lebih tinggi yang diperlukan untuk tes PCR real-
time.