EKSTRAKSI RNA

DEFINISI
Ekstraksi biomolekul, DNA, RNA, dan protein, adalah
metode yang paling penting yang digunakan dalam
biologi molekuler
Ekstraksi/isolasi RNA dari sel atau jaringan adalah
langkah pertama dalam sejumlah percobaan
laboratorium rutin yang digunakan untuk menilai tingkat
ekspresi gen dan pengujian termasuk PCR kuantitatif,
analisis microarray, ataupun Nothern blots
Perawatan khusus dan tindakan pencegahan diperlukan
untuk isolasi RNA karena rentan terhadap degradasi.
Seringkali sulit untuk mengisolasi RNA utuh. Sebab,
RNase, sekelompok enzim yang mendegradasi molekul
RNA, berlimpah di lingkungan kita, termasuk di tangan
dan di permukaan kulit, apalagi sulit untuk menghilangkan
atau menghancurkan RNase sepenuhnya.
Ekstraksi RNA bergantung pada teknik laboratorium yang
baik dan teknik bebas RNase, protein, dan DNA
Prosedur ekstraksi dan pemurnian juga harus bebas dari
inhibitor RT dan PCR, serta tanpa zat seperti Mg2+ dan
Mn2+ yang merupakan kofaktor reaksi esensial.genom.
Dengan sel-sel hewan, jaringan dan garis sel tertentu
menghasilkan jumlah, kualitas, dan integritas RNA yang
berbeda.
Misalnya, RIN rata-rata yang terkait dengan jaringan
jantung sapi adalah 6.03, sedangkan sel darah putih sapi
memiliki RIN rata-rata 9,36. RIN (RNA Integrity
Number) mengalokasikan skor 1 hingga 10, di mana 10
adalah RNA yang sepenuhnya utuh dan 1 mewakili RNA
yang sangat terdegradasi.
Metode Ekstraksi RNA
Pengambilan dan penanganan sampel sebelum
ekstraksi RNA total berpotensi memberikan variasi
pada hasil akhir, sehingga harus dilakukan pemilihan
metode yang tepat untuk melakukan ektraksi RNA
sesuai dengan jenis selnya.
Total sampel RNA yang akan digunakan dalam
analisis ekspresi gen harus: 1) bebas dari protein dan
kontaminan yang dapat menghambat analisis molekul
hilir, 2) utuh dan bebas dari nuklease (yang dapat
menyebabkan degradasi berikutnya) dan 3) bebas dari
kontaminasi gDNA.
LANGKAH-LANGKAH
EKSTRAKSI RNA
Lisis & Peleburan/Pemutusan Sel
Lisis sel dapat dilakukan dengan menggunakan buffer
atau pereaksi yang mengandung agen chaotropic
seperti guanidinium isothiocyanate, guanidinium
chloride, sodium dodecyl sulphate (SDS), sarkosil,
urea, fenol atau kloroform. TRIzol, RNAlater, ataupun
Qiazol dapat digunakan untuk menjaga kualitas RNA
selama lisis.
Sebagian besar kit mengharuskan jaringan
dihomogenisasi dalam buffer yang mengandung
deterjen untuk melisiskan sel.
Denaturasi DNA & Protein
DNase dapat digunakan untuk mendegradasi DNA,
sedangkan proteinase K dapat ditambahkan untuk mencerna
protein.
Cara lain untuk menghilangkan protein dapat dilakukan
ekstraksi organik berulang menggunakan fenol dan
kloroform, atau melarutkan sampel dalam buffer yang
mengandung garam guanidinium.
Penghapusan DNA genomik (gDNA) paling sering
melibatkan pengobatan sampel dengan enzim DNase I;
namun, beberapa kit menggunakan metode non-enzimatik,
termasuk ekstraksi cair-cair (mis., solusi eliminator gDNA)
dan ekstraksi fase padat (mis., kolom spin eliminator gDNA).
Denaturasi dan Inaktifasi RNase
Dapat dilakukan dengan menggunakan agen
chaotropic yang disebutkan di atas, seperti fenol dan
kloroform.
Penghapusan/pemisahan Komponen Sel
RNA dapat dipisahkan dari komponen seluler lainnya
dengan menambahkan kloroform dan mensentrifugasi
larutan. Proses ini akan membagi larutan menjadi dua
fase yaitu fase organik dan fase berair (fase aqueous).
Fase aqueous mengandung RNA.
Presipitasi (Pengendapan)
RNA sering pulih dari fase aqueous menggunakan
alkohol isopropil. RNA juga dapat diendapkan secara
selektif dari DNA melalui penggunaan amonium
asetat. Sebagai alternatif, litium klorida dapat
digunakan untuk mengendapkan RNA dari DNA dan
protein.
Isolasi dari total RNA (yang 1-5% adalah mRNA)
Beberapa metode tersedia untuk isolasi RNA; yang paling
umum digunakan oleh kit yang tersedia secara komersial
termasuk ekstraksi cair-cair (mis., fenol-kloroform,
TRIzol, dll.) atau ekstraksi fase padat menggunakan
membran berbasis silika atau teknologi manik
paramagnetik
PENYIMPANAN RNA
Larutan RNAlater dari Thermo Fisher dan QIAGEN
digunakan oleh banyak peneliti selama isolasi RNA, baik
untuk menstabilkan RNA sel dalam sampel jaringan, juga
untuk menstabilkan RNA akhir yang dimurnikan.
RNAlater menghambat RNA menggunakan garam sulfat
seperti amonium sulfat pada pH tertentu. Kualitas RNA
dapat diperiksa menggunakan elektroforesis gel agarose.
Jaringan dapat dibekukan dalam nitrogen cair,
selanjutnya disimpan pada suhu -80°C sampai isolasi
RNA.
Untuk mencegah degradasi RNA dan menjaga profil
RNA, disarankan untuk melakukan penanganan sampel
dengan cepat, sehingga kontaminasi sel berkurang.
Sampel kemudian harus dibekukan dalam nitrogen cair
segera dan tetap beku sampai dilakukan ekstraksi RNA
dengan manipulasi sesedikit mungkin.
PENENTUAN KUANTITAS &
KUALITAS RNA
Penilaian konsentrasi dan kemurnian RNA yang
diekstraksi dapat dilakukan menggunakan
spektrofotometer UV/VIS (ultraviolet visible).
Untuk menentukan kualitas dan kuantitas RNA dapat
ditentukan dengan dengan menggunakan spektrofotometri
UV. Ditentukan rasio penyerapan pada 260 nm dan 280
nm dengan spektrofotometri UV.
Untuk RNA berkualitas tinggi, rasio A260/A280 harus
dalam kisaran 1,9-2,1. RNA dapat diukur dengan
mengukur penyerapan pada 260 nm, di mana 1 unit
absorbansi sama dengan 40 μg/ml, pada pH ±7,5.
Selain itu, penentuan kualitas RNA total harus
diperiksa melalui elektroforesis. Tes Qubit, yang
disediakan oleh ThermoFisher Scientific, juga dapat
menilai kuantitas sampel RNA dan menilai
kualitasnya.
 DAFTAR PUSTAKA
S. C. Tan and B. C. Yiap (2009) DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of
Biomedicine and Biotechnology Volume 2009 Article ID 574398, 10 pages. doi:10.1155/2009/574398 .
Hindawi Publishing Corporation.
Kuang J, Yan X, Genders AJ, Granata C, Bishop DJ (2018) An Overview Of Technical Considerations
When Using Quantitative Real-Time PCR Analysis Of Gene Expression In Human Exercise Research.
Plos ONE 13(5): E0196438.
Johnson Mary (2012) RNA Extraction. Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States.
DOI//dx.doi.org/10.13070/mm.en.2.201.
Burgmann H, Widmer F, Sigler WV, Zeyer J (2003) mRNA Extraction And Reverse Transcription-PCR
Protocol For Detection Of Nifh Gene Expression By Azotobacter Vinelandii In Soil. Applied And
Environmental Microbiology, Apr. 2003, P. 1928–1935. Vol. 9 No. 4. American Society for Microbiology.
C.E. Jahn et al. (2008). Evaluation of isolation methods and RNA integrity for bacterial RNA quantitation.
Journal of Microbiological Methods 75 (2008) 318–324.
Rodríguez, A., Duyvejonck, H., Van Belleghem, J. D., Gryp, T., Van Simaey, L., Vermeulen, S., Van
Mechelen, E., & Vaneechoutte, M. (2020). Comparison of procedures for RNA-extraction from peripheral
blood mononuclear cells. PloS one, 15(2), e0229423. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0229423 .
Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., & Oris, J. T. (2014). A comparison of commercially-
available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue
samples. BMC biotechnology, 14, 94. https://doi.org/10.1186/s12896-014-0094-8.
Terima Kasih