Machine Translated by Google

Diterima 29 Juli 2002

Diterima 30 September 2002
Diterbitkan online 8 Januari 2003

Identifikasi biologis melalui barcode DNA

Paul DN Hebert* dan , Alina Cywinska, Shelley L. Ball
Jeremy R. deWaard
Departemen Zoologi, Universitas Guelph, Guelph, Ontario N1G 2W1, Kanada

Meskipun banyak penelitian biologi bergantung pada diagnosis spesies, keahlian taksonomi sedang runtuh.
Kami yakin bahwa satu-satunya prospek untuk kemampuan identifikasi yang berkelanjutan terletak pada konstruksi
sistem yang menggunakan urutan DNA sebagai 'barcode' takson. Kami menetapkan bahwa gen mitokondria
sitokrom c oksidase I (COI) dapat berfungsi sebagai inti dari sistem bioidentifikasi global untuk hewan. Pertama, kami menunjukkan
bahwa profil COI, yang berasal dari pengambilan sampel kepadatan rendah dari kategori taksonomi yang lebih tinggi,
biasanya menetapkan taksa yang baru dianalisis ke filum atau ordo yang sesuai. Kedua, kami menunjukkan bahwa
penugasan tingkat spesies dapat diperoleh dengan membuat profil COI yang komprehensif. Profil COI model,
berdasarkan analisis satu individu dari masing-masing 200 spesies lepidoptera yang berkerabat dekat, 100% berhasil dalam
mengidentifikasi spesimen berikutnya dengan benar. Ketika dikembangkan sepenuhnya, identifikasi COI
sistem akan memberikan solusi yang andal, hemat biaya, dan dapat diakses untuk masalah spesies saat ini
identifikasi. Perakitannya juga akan menghasilkan wawasan baru yang penting tentang diversifikasi kehidupan dan
aturan evolusi molekuler.

Kata kunci: taksonomi molekuler; DNA mitokondria; hewan; serangga; keragaman urutan; evolusi

1. PERKENALAN Allander dkk. 2001; Hamel dkk. 2001). Namun,

masalah yang melekat dalam taksonomi morfologi bersifat umum
Keanekaragaman kehidupan mendasari semua studi biologi, tetapi
cukup untuk mendapatkan perpanjangan dari pendekatan ini untuk semua kehidupan.
itu juga merupakan beban yang berat. Sedangkan fisikawan berurusan dengan
Faktanya, ada semakin banyak kasus di mana
kosmos dirakit dari 12 partikel dasar, ahli biologi menghadapi sebuah
Sistem identifikasi berbasis DNA telah diterapkan untuk
planet yang dihuni oleh jutaan spesies.
organisme yang lebih tinggi (Brown et al. 1999; Bucklin et al. 1999;
Diskriminasi mereka bukanlah tugas yang mudah. Bahkan, sejak beberapa
Trewick 2000; Vincent dkk. 2000).
ahli taksonomi secara kritis dapat mengidentifikasi lebih dari 0,01%
Pendekatan genomik untuk diagnosis takson mengeksploitasi keragaman
diperkirakan 10-15 juta spesies (Hammond 1992; Hawk sworth & Kalin-
di antara sekuens DNA untuk mengidentifikasi organisme (Kurtzman
Arroyo 1995), komunitas 15.000
1994; Wilson 1995). Dalam arti yang sangat nyata, urutan ini dapat dilihat
ahli taksonomi akan diminta, untuk selama-lamanya, untuk mengidentifikasi kehidupan
sebagai 'barcode' genetik yang tertanam di
jika ketergantungan kita pada diagnosis morfologis harus dipertahankan.
setiap sel. Ketika seseorang mempertimbangkan diskriminasi
Selain itu, pendekatan ini untuk tugas rutin
keanekaragaman kehidupan dari perspektif kombinatorial, itu adalah sederhana
identifikasi spesies memiliki empat keterbatasan yang signifikan. Pertama,
masalah. Kode Produk Universal, digunakan untuk mengidentifikasi
plastisitas fenotipik dan variabilitas genetik dalam
produk ritel, gunakan 10 angka alternatif pada 11 posisi untuk
karakter yang digunakan untuk pengenalan spesies dapat menyebabkan
menghasilkan 100 miliar pengenal unik. genomik
identifikasi yang salah. Kedua, pendekatan ini mengabaikan
barcode hanya memiliki empat nukleotida alternatif di setiap posisi, tetapi
taksa morfologis samar, yang umum di banyak
rangkaian situs yang tersedia untuk inspeksi sangat besar.
kelompok (Knowlton 1993; Jarman & Elliott 2000). Ketiga,
Survei hanya 15 dari posisi nukleotida ini menciptakan
karena kunci morfologi seringkali hanya efektif untuk tahap kehidupan 15
kemungkinan 4 (1 miliar) kode, 100 kali jumlah yang diperlukan
atau jenis kelamin tertentu, banyak individu tidak dapat
untuk membedakan kehidupan jika masing-masing
diidentifikasi. Akhirnya, meskipun versi interaktif modern
takson diberi merek unik. Namun, survei dari
merupakan kemajuan besar, penggunaan kunci sering menuntut
keragaman nukleotida perlu lebih komprehensif
tingkat keahlian yang tinggi sehingga kesalahan diagnosis sering terjadi.
karena kendala fungsional menahan beberapa posisi nukleotida konstan
mon
dan keragaman intraspesifik ada pada orang lain.
Keterbatasan yang melekat dalam sistem identifikasi berbasis
Dampak kendala fungsional dapat dikurangi dengan
morfologi dan kumpulan ahli taksonomi yang semakin berkurang
berfokus pada gen pengkode protein, mengingat sebagian besar pergeseran
menandakan perlunya pendekatan baru untuk pengenalan takson.
pada posisi nukleotida ketiga kodon dibatasi secara lemah oleh seleksi
Sistem identifikasi mikrogenomik, yang memungkinkan diskriminasi
karena degenerasi empat kali lipatnya. Oleh karena itu, dengan memeriksa
kehidupan melalui analisis segmen kecil
bentangan 45 nukleotida, seseorang memperoleh akses ke 15 situs yang
genom, mewakili satu pendekatan yang sangat menjanjikan
dipengaruhi secara lemah oleh seleksi
untuk diagnosis keanekaragaman hayati. Konsep ini memiliki
dan, oleh karena itu, 1 miliar kemungkinan label identifikasi. Di
sudah mendapatkan penerimaan luas di antara mereka yang bekerja
praktik, tidak perlu membatasi analisis seperti itu
dengan kelompok yang paling tidak mudah dikendalikan secara morfologis,
bentangan pendek DNA karena informasi urutan adalah
seperti virus, bakteri, dan protista (Nanney 1982; Pace 1997;
mudah diperoleh untuk fragmen DNA ratusan pasangan basa
(bp) panjang. Kemampuan untuk memeriksa urutan yang lebih panjang
ini signifikan, mengingat dua pertimbangan biologis lainnya. Pertama,
*Penulis untuk korespondensi (phebert@uoguelph.ca). komposisi nukleotida di situs posisi ketiga sering

Prok. R. Soc. London. B (2003) 270, 313–321 313 2003 The Royal Society
DOI 10.1098/rspb.2002.2218
Machine Translated by Google
314 PDN Hebert dan identifikasi berbasis DNA lainnya
sangat bias (A–T pada arthropoda, C–G pada chordata),
mengurangi isi informasi. Namun, bahkan jika A–T
atau proporsi C–G mencapai 1, pemeriksaan hanya 90 bp
akan memulihkan prospek 1 miliar alternatif
(23 0 = 4 1 5). Kendala kedua berasal dari yang terbatas
penggunaan kapasitas informasi potensial ini, karena sebagian besar
posisi nukleotida konstan dalam perbandingan
spesies terkait. Namun, mengingat tingkat sederhana (misalnya 2%
per Myr) dari perubahan urutan, seseorang mengharapkan 12 diagnostik
perbedaan nukleotida dalam perbandingan spesies 600 bp
dengan hanya satu juta tahun sejarah isolasi reproduksi.
Karena catatan fosil dan analisis molekuler sebelumnya menunjukkan
bahwa sebagian besar spesies bertahan selama jutaan tahun,
kemungkinan diagnosis takson yang serupa tinggi. Namun, tidak ada
rumus sederhana yang dapat memprediksi panjang urutan
yang harus dianalisis untuk memastikan diagnosis spesies, karena
tingkat evolusi molekuler bervariasi antara segmen genom yang
berbeda dan lintas taksa. Jelas,
analisis daerah gen atau taksa yang berkembang pesat akan membantu
diagnosis garis keturunan dengan sejarah singkat isolasi reproduktif,
sedangkan kebalikannya berlaku untuk gen atau spesies yang
mengalami perlambatan laju.
Meskipun belum pernah ada upaya untuk menerapkan sistem
identifikasi mikrogenomik secara besar-besaran,
cukup banyak pekerjaan yang telah dilakukan untuk menunjukkan desain utama
elemen. Jelas bahwa genom mitokondria hewan adalah target analisis
yang lebih baik daripada genom nuklir
karena kurangnya intron, paparannya yang terbatas terhadap
rekombinasi dan cara pewarisan haploidnya
(Saccone dkk. 1999). Primer yang kuat juga memungkinkan pemulihan
rutin segmen spesifik mitokondria
genom (Folmer et al. 1994; Simmons & Weller 2001).
Pekerjaan filogenetik masa lalu sering berfokus pada gen mitokondria
yang mengkode DNA ribosom (12S, 16S), tetapi penggunaannya dalam
analisis taksonomi yang luas dibatasi oleh
prevalensi penyisipan dan penghapusan (indels) yang sangat
memperumit keberpihakan urutan (Doyle & Gaut 2000).
13 gen pengkode protein dalam mitokondria hewan
genom adalah target yang lebih baik karena indel jarang terjadi karena
sebagian besar mengarah pada pergeseran kerangka baca. Tidak ada
alasan apriori yang memaksa untuk memfokuskan analisis pada gen tertentu,
tetapi gen sitokrom c oksidase I (COI) memang memiliki dua
keuntungan penting. Pertama, primer universal untuk ini
gen sangat kuat, memungkinkan pemulihan ujung 59-nya dari
perwakilan dari sebagian besar, jika tidak semua, filum hewan (Folmer
dkk. 1994; Zhang & Hewitt 1997). Kedua, COI muncul
memiliki jangkauan sinyal filogenetik yang lebih besar daripada
gen mitokondria lainnya. Sama dengan gen pengkode protein lainnya,
nukleotida posisi ketiga menunjukkan
insiden substitusi basa, yang mengarah ke tingkat evolusi molekuler
yang sekitar tiga kali lebih besar dari itu
dari 12S atau 16S rDNA (Knowlton & Weigt 1998). Faktanya,
evolusi gen ini cukup cepat untuk memungkinkan
diskriminasi tidak hanya spesies yang berkerabat dekat, tetapi juga
kelompok filogeografi dalam satu spesies (Cox &
Hebert 2001; Barang & Cunningham 2001). Meskipun
COI dapat dicocokkan dengan gen mitokondria lainnya dalam
menyelesaikan kasus divergensi baru-baru ini, gen ini lebih
cenderung memberikan wawasan filogenetik yang lebih dalam daripada
alternatif seperti sitokrom b (Simmons & Weller 2001)
karena perubahan urutan asam aminonya lebih banyak terjadi
lebih lambat daripada yang ada di ini, atau gen mitokondria lainnya
(Lynch & Jarrell 1993). Akibatnya, dengan memeriksa amino
Prok. R. Soc. London. B (2003)
substitusi asam, dimungkinkan untuk menetapkan
organisme tak dikenal ke kelompok taksonomi yang lebih tinggi (mis
filum, ordo), sebelum memeriksa substitusi nukleotida
untuk menentukan identitas spesiesnya.
Studi ini mengevaluasi potensi COI sebagai alat taksonomi. Kami
pertama kali membuat 'profil' COI untuk tujuh filum hewan paling
beragam, berdasarkan analisis 100
spesies perwakilan, dan kemudian menunjukkan bahwa
informasi dasar menetapkan 96% taksa yang baru dianalisis
untuk filum mereka yang tepat. Kami kemudian memeriksa kelas Hexa
poda, dipilih karena mewakili konsentrasi keanekaragaman hayati
terbesar di planet ini (Novotny et al. 2002).
Kami membuat 'profil' COI untuk delapan yang paling beragam
perintah serangga, berdasarkan satu perwakilan dari
masing-masing dari 100 keluarga yang berbeda, dan menunjukkan bahwa 'pro
file' ini menetapkan masing-masing dari 50 taksa yang baru dianalisis ke yang benar
memesan. Akhirnya, kami menguji kemampuan urutan COI untuk
mengidentifikasi spesies lepidoptera dengan benar, target kelompok
untuk analisis karena divergensi urutannya rendah
antara keluarga dalam urutan ini. Dengan demikian, lepidoptera
memberikan kasus yang menantang untuk diagnosis spesies, terutama
karena ini adalah salah satu ordo serangga yang paling spesifik.
Tes ini, yang melibatkan pembuatan 'profil' COI untuk 200
spesies yang terkait erat dan kemudian menggunakannya untuk menetapkan
150 individu baru dianalisis untuk spesies, adalah 100% berhasil dalam
identifikasi.
2. BAHAN DAN METODE
(a) Urutan
Sekitar seperempat dari urutan COI (172 dari
655) yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari GenBank. Sisanya
diperoleh dengan menyiapkan ekstrak DNA total 30 ml dari
sampel jaringan menggunakan Isoquick (Orca Research Inc,
Bothell, WA, 1997) protokol. Pasangan primer LCO1490
(59-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-39) dan HCO2198
(59-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-39) selanjutnya digunakan
untuk mengamplifikasi fragmen 658 bp dari gen COI
(Folmer dkk. 1994). Setiap PCR berisi 5 ml 10´ PCR
buffer, pH 8,3 (10 mM Tris–HCl, pH 8,3; 1,5 mM MgCl2 ;
dan 50 mM KCl; 0,01% NP-40), 35 ml air suling,
200 mM setiap dNTP, 1 unit Taq polimerase, 0,3 mM
masing-masing primer dan 1-4 ml template DNA. PCR termal
rezim terdiri dari satu siklus 1 menit pada 94 °C; lima siklus
1 menit pada 94 °C, 1,5 menit pada 45 °C dan 1,5 menit pada 72 °C; 35 siklus
1 menit pada 94 °C, 1,5 menit pada 50 °C dan 1 menit pada 72 °C dan a
siklus akhir 5 menit pada 72 °C. Setiap produk PCR dimurnikan secara
berurutan gel menggunakan kit Qiaex II (Qiagen) dan
diurutkan dalam satu arah pada sequencer otomatis ABI 377
(Biosistem Terapan) menggunakan kit sequencing Big Dye v. 3. Semua
sequence yang diperoleh dalam penelitian ini telah diserahkan ke Gen
Bank; nomor aksesi mereka disediakan di Electronic
Lampiran A–C, tersedia di Publikasi The Royal Society
Situs web.
(b) profil COI
Kami membuat tiga profil COI: satu untuk tujuh yang dominan
filum hewan, satu lagi untuk delapan ordo serangga terbesar
dan yang terakhir untuk 200 spesies lepidoptera yang berkerabat dekat. Ini
profil dirancang untuk memberikan gambaran tentang keragaman COI
dalam setiap kumpulan taksonomi dan kemudian digunakan
sebagai dasar untuk identifikasi filum, ordinal atau spesies
tingkat dengan menentukan kongruensi urutan antara masing-masing
takson 'tidak diketahui' dan spesies yang termasuk dalam profil tertentu.
Machine Translated by Google
Profil filum termasuk 100 urutan COI, semuanya diperoleh dari
GenBank (lihat Lampiran A elektronik yang tersedia di situs Web
Publikasi The Royal Society). Untuk memastikan cakupan taksonomi
yang luas, setiap urutan diturunkan dari keluarga yang berbeda dan
perwakilan dimasukkan dari semua kelas yang tersedia. Sepuluh
sekuens diperoleh untuk masing-masing dari lima filum (Annelida,
Chordata, Echinodermata, Nematoda, Platyhelminthes) yang
mencakup 5000–50 000 spesies, sedangkan 25 sekuens dikumpulkan
untuk masing-masing filum (Arthropoda, Mollusca) dengan lebih dari
100.000 spesies .
Profil ordinal dibuat dengan memperoleh urutan COI dari satu
perwakilan dari masing-masing 100 keluarga serangga (lihat Lampiran
B elektronik yang tersedia di situs Web Publikasi The Royal Society).
Empat ordo serangga yang paling beragam (lebih dari 100.000
spesies yang dijelaskan) dipilih untuk analisis, bersama dengan
empat ordo tambahan yang dipilih secara acak dari antara 15 ordo
serangga (Gaston & Hudson 1994) dengan keragaman sedang
(1000–15.000 spesies yang dijelaskan) . Antara sepuluh dan 25
keluarga diperiksa untuk masing-masing dari empat keluarga yang paling beragam
ordo (Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera), sedangkan
empat hingga sepuluh famili diperiksa untuk ordo lainnya.
(Blattaria, Ephemeroptera, Orthoptera, Plecoptera).
Profil spesies didasarkan pada data COI untuk satu individu dari
masing-masing 200 spesies lepidoptera paling umum dari situs dekat
Guelph, Ontario, Kanada (Lampiran C elektronik tersedia di situs
Web Publikasi The Royal Society). Profil ini memeriksa anggota
hanya tiga superfamili sekutu (Geometroidea, Noctuoidea,
Sphingoidea) untuk menentukan batas bawah divergensi COI dalam
kumpulan spesies yang terkait erat. Noctuoidea termasuk anggota
dari tiga famili (Arctiidae, Noctuidae, Notodontidae) sementara yang
lain termasuk perwakilan dari hanya satu famili (Geometridae dan
Sphingidae, masing-masing).
(c) Taksa uji
Urutan tambahan dikumpulkan untuk menguji kemampuan
setiap profil untuk menetapkan spesies yang baru dianalisis ke
dalam kategori taksonomi (Lampiran elektronik A–C). Urutan COI
diperoleh dari 55 taksa 'uji' untuk menilai keberhasilan profil filum
dalam menetapkan spesies yang baru dianalisis ke sebuah filum.
Taksa 'uji' ini mencakup lima perwakilan dari masing-masing lima
filum 'kecil', dan 15 perwakilan dari Mollusca dan Arthro poda.
Bila memungkinkan, taksa 'pengujian' milik keluarga yang tidak
termasuk dalam profil filum. Pendekatan serupa digunakan untuk
menguji kemampuan profil ordinal untuk mengklasifikasikan
serangga yang baru dianalisis ke suatu ordo. Lima puluh taksa
baru diperiksa, termasuk antara satu dan lima perwakilan dari
setiap ordo kecil dan lima hingga sepuluh perwakilan dari masing-
masing dari empat ordo besar. Bila memungkinkan, taksa
'pengujian' milik keluarga atau genera yang tidak termasuk dalam
profil ordinal. Pengujian profil spesies memerlukan pendekatan
yang sedikit berbeda, karena identifikasi hanya dimungkinkan
untuk spesies yang terwakili di dalamnya. Akibatnya, urutan
diperoleh dari 150 individu lain yang termasuk dalam spesies yang termasuk
(d) Analisis data
Urutan disejajarkan di editor urutan SeqApp 1.9.
Mereka kemudian dikurangi menjadi 669 bp untuk analisis filum, 624
bp untuk analisis ordinal dan 617 bp untuk analisis tingkat spesies.
Analisis pada tingkat ordinal dan filum memeriksa divergensi asam
amino, menggunakan jarak p terkoreksi Poisson untuk mengurangi
dampak homoplasy. Untuk analisis tingkat spesies, divergensi urutan
nukleotida dihitung
Prok. R. Soc. London. B (2003)
Identifikasi berbasis DNA PDN Hebert dan lainnya 315
menggunakan model Kimura-dua-parameter (K2P), metrik terbaik
ketika jarak rendah (Nei & Kumar 2000) seperti dalam penelitian ini.
Analisis Neighbour-joining (NJ), yang diterapkan di MEGA2.1
(Kumar et al. 2001), digunakan untuk menguji hubungan antar taksa
dalam profil dan untuk klasifikasi taksa 'pengujian' berikutnya karena
rekam jejaknya yang kuat dalam analisis kumpulan spesies besar
(Kumar & Gadagkar 2000).
Pendekatan ini memiliki keuntungan tambahan menghasilkan hasil
yang jauh lebih cepat daripada alternatif. Profil NJ untuk ordo dan
filum memiliki 100 simpul terminal, masing-masing mewakili spesies
dari famili yang berbeda, sedangkan profil spesies NJ memiliki 200
simpul, masing-masing mewakili spesies lepidop teran yang berbeda.
Anggota ordo serangga primitif Thysanura (famili Lepismatidae)
digunakan sebagai outgroup untuk profil serangga, sedangkan
anggota tunggal dari tiga famili lepidopteran primitif digunakan
sebagai outgroup untuk profil spesies.
Masing-masing dari tiga profil NJ (filum, ordo, spesies) selanjutnya
digunakan sebagai mesin klasifikasi, dengan menjalankan kembali
analisis dengan penambahan berulang dari takson 'pengujian' tunggal
ke kumpulan data. Setelah setiap analisis, spesies 'uji' ditugaskan
sebagai anggota kelompok taksonomi yang sama dengan simpul
tetangga terdekatnya. Misalnya, dalam analisis ordinal, takson 'tes'
diidentifikasi sebagai anggota ordo Lepidoptera jika dikelompokkan
paling dekat dengan salah satu dari 24 keluarga lepidoptera yang
termasuk dalam profil. Keberhasilan klasifikasi diukur baik untuk filum
dan analisis ordinal dengan menentukan proporsi taksa 'uji' yang
ditetapkan untuk filum/ordo yang tepat.
Dalam kasus spesies, kriteria yang lebih ketat digunakan. Takson
'pengujian' diakui sebagai yang diidentifikasi dengan benar hanya
jika urutannya dikelompokkan paling dekat dengan perwakilan tunggal
spesiesnya dalam profil.
Penskalaan multidimensi (MDS), yang diimplementasikan dalam
Systat 8.0, digunakan untuk memberikan ringkasan grafis dari hasil
tingkat spesies karena jumlah taksa yang sangat besar. MDS
mengeksplorasi hubungan kesamaan dalam ruang Euclidean dan
memiliki keuntungan memungkinkan taksa perantara genetik untuk
tetap perantara spasial, daripada memaksa mereka untuk
mengelompok menjadi pseudogroup seperti dalam metode hierarkis
(Lessa 1990). Dalam kasus ini, matriks kesamaan dibangun dengan
memperlakukan setiap posisi dalam keselarasan sebagai karakter
terpisah dan nukleotida ambigu sebagai karakter yang hilang.
Informasi urutan dikodekan menggunakan variabel dummy (A = 1, G
= 2, C = 3, T = 4). Namun, seperti disebutkan sebelumnya, profil NJ
juga dibangun untuk urutan lepidopteran menggunakan jarak K2P
dan ini disediakan dalam Lampiran D elektronik yang tersedia di situs
Web Publikasi The Royal Society.
3. HASIL
(a) Profil takson
Masing-masing dari 100 spesies yang termasuk dalam
filum dan profil ordinal memiliki urutan asam amino yang
berbeda pada COI. Profil filum menunjukkan resolusi yang
baik dari
kelompok
dalam profil ini.taksonomi utama (gambar 1). Kumpulan
monofiletik ditemukan untuk tiga filum (Annelida, Echinodermata,
Platyhelminthes) dan garis chordata membentuk kelompok
yang kohesif. Anggota Nema toda dipisahkan menjadi tiga
kelompok, tetapi masing-masing sesuai dengan salah satu
dari tiga subkelas yang membentuk filum ini. Dua puluh tiga
dari 25 artropoda untuk kelompok monofiletik, tetapi satu-
satunya perwakilan dari dua kelas krustasea (Cephalocarida,
Maxillopoda) berada di luar kelompok ini. Dua belas dari 25
garis moluska
Machine Translated by Google
316 PDN Hebert dan identifikasi berbasis DNA lainnya

AR 1
AR 2
AR 3
AR 4
AR 5
AR 6
AR 7
AR 8
AR 9
AR 10
AR 11 Arthropoda
AR 12
AR 13
AR 14AR 15
AR 16
AR 17
AR 18
AR 19
AR 20
AR 21
AR 22
AR 23
CH 1
CH 2
CH 3
CH 4
CH 5 Chordata
CH 6
CH 7
CH 8
CH 9
CH 10
EC 1
EC 2
EC 3
EC 4
EC 5 Echinodermata
EC 6
EC 7
EC 8
EC 9
EC 10
ML 1
ML 2 Moluska
ML 3
ML 4 Cephalopoda)
ML 5
AN 1
AN 2
AN 3
AN 4
AN 5 Annelida
AN 6
AN 7
AN 8
AN 9
AN 10
ML 6
ML 7
ML 8
ML 9
ML 10
ML 11 Moluska
ML 12
ML 13
ML 14
ML 15
ML 16
ML 17
AR 224
ML 18
ML 19 Moluska
ML 20
AR25
2 Pulmonata)
ML 221
NE 1
NE 2
NE 3 Nematoda
NE 4
NE 5 Rhabditoidea)
NE 6
NE 7
ML 22
ML 23 Moluska
ML 24
ML 25 Bivalvia)
NE 88
NE 9 Nematoda
NE 10
PL 1 Spirurida)
PL 2
PL 3
PL 4
PL 5 Platyhelminthes
PL 6
PL 7
PL 8
PL 9
PL 10

Gambar 1. Analisis NJ dari Poisson mengoreksi jarak-p berdasarkan analisis 223 asam amino gen COI dalam 100 taksa milik tujuh
filum hewan. Taksa di kotak abu-abu mewakili outlier. AR 24 dan AR 25 adalah satu-satunya perwakilan dari kelas arthropoda
Cephalocarida dan Maxillopoda. ML 21 merupakan anggota kelas molluscan Bivalvia, sedangkan NE 8 merupakan satu-satunya
anggota dari subkelas nematoda Enoplia. Bilah skala, 0,1.

Eages membentuk kumpulan monofiletik yang bersekutu dengan daripada konvergensi sekunder pada susunan asam amino dari
Annelida, tetapi yang lain dipisahkan menjadi kelompok- kelompok lain.
kelompok yang menunjukkan perbedaan genetik yang nyata. Profil ordinal menunjukkan kohesi kelompok taksonomi yang
Satu kelompok hanya terdiri dari cephalopoda, yang kedua tinggi dengan tujuh dari delapan ordo membentuk kumpulan
sebagian besar pulmonata dan sisanya adalah bivalvia. Perlu monofiletik (gambar 2). Satu-satunya pengecualian adalah
ditekankan bahwa urutan COI yang terluar ini selalu menunjukkan Coleoptera yang anggotanya dibagi menjadi tiga kelompok. Dua
perbedaan asam amino yang cukup besar dari urutan yang dari kelompok ini termasuk 21 famili yang termasuk dalam
dimiliki oleh kelompok taksonomi lainnya. Dengan demikian, subordo Polyphaga yang sangat beragam, sedangkan kelompok
percepatan laju dalam garis keturunan ini menghasilkan urutan asamlainnya
amino COI
termasuk
baru empat famili yang termasuk dalam subordo Polyphaga.

Prok. R. Soc. London. B (2003)

Machine Translated by Google
Identifikasi berbasis DNA PDN Hebert dan lainnya 317

Geometridae
Arctiidae
Tabel 1. Rata-rata Poisson mengoreksi jarak-p (d) untuk 208
Nolidae asam amino COI dalam 100 keluarga serangga milik delapan
Notodontidae
perintah.
Noctuidae
Lymantriidae (n menunjukkan jumlah famili yang dianalisis dalam setiap ordo. G/C
Lasiocampidae
Epiplemidae konten juga dilaporkan.)
Bombycidae
Drepanidae
Sphingidae memesan n d se G/C (%)
Nymphalidae
Lepidoptera
Lycaenidae
Saturniidae
Tiatiridae Hymenoptera 11 0.320 0,028 27.7
Riodinidae
Coleoptera 25 0,125 5 0,015 35.6
Ceratocampidae
Piralidae Orthoptera 0,119 0,019 35.4
Satyridae
Cossidae
Blattaria 4 0,076 15 0,014 35.7
Pieridae
Diptera 0,055 0,011 34.1
Papilionidae
Limacodidae Lepidoptera 24 0,054 10 0,009 31.0
Hepialidae
Pedilidae Ephemeroptera 0,036 0,008 40.5
Cerambycidae Plecoptera 6 0,031 0,008 39.5
Melandryidae
Tenebrionidae
Chrysomelidae Coleoptera
Melyridae polifaga)
Lampyridae
Cantharida

CurculionidaeScolytidae 2
Coccinellidae
Specidae
Gasteruptiidae
Ichneumonidae

Chrysididae
Formicidae

TiphiidaeBraconidae
1
Vespidae
Halictidae
Apidae
Anthophoridae
Silphidae
Dermestidae
Scarabaeidae
Lucanidae
Coleoptera 0
Staphylinidae
Elateridae polifaga)
Buprestidae
Heteroceridae
Elmidae
Psephenidae
Cicindellidae
Carabidae Coleoptera
_1
Dytiscidae Adefaga)
Gyrinidae
Ptychopteridae
Simuliidae

Bombyliidae
Tabanidae
Pelecorhynchidae
Athericidae

Rhagionidae
Diptera
Syrphidae
_2 _1 0 1 2
Tipulidae
Culicidae
dimensi 1
Asilidae

Tephritidae
Sphaeroceridae Gambar 3. Penskalaan multidimensi jarak Euclidian
Drosophilidae
Calliphoridae di antara gen COI dari 200 spesies lepidopteran
Gryllidae
milik tiga superfamilies: Geometroidea (bintang);
Tettigoniidae
Gryllotalpidae Orthoptera Sphingoidea (segitiga) dan Noctuoidea (lingkaran).
Eumastacidae
Acrididae
Lecutridae
Capniidae
Notonemouridae
Peltoperlidae
Plecoptera
Perlidae subordo Adephaga. Di antara empat ordo utama, spesies
Kloroperlidae
Blatelidae dari Diptera dan Lepidoptera menunjukkan variasi yang jauh lebih sedikit
Cryptocercidae
Blattidae
Blattaria dalam urutan asam amino mereka daripada Hymenoptera,
Blaberidae
Baetiscidae
sedangkan Coleoptera menunjukkan tingkat menengah
Caenidae divergensi (tabel 1).
Ameletidae
Ephemerellidae Masing-masing dari 200 lepidoptera termasuk dalam spesies
Ephemeridae
Leptophlebiidae
Ephemeroptera profil memiliki urutan COI yang berbeda. Selain itu, plot MDS menunjukkan
Siphlonuridae
Metretopodidae
bahwa spesies milik masing-masing
Heptageniidae tiga superfamilies jatuh ke dalam kelompok yang berbeda (gambar 3),
Isonychiidae

0,05
Tisanura menandakan divergensi genetik mereka. Sebuah pemeriksaan rinci dari
pohon NJ (Lampiran elektronik D) mengungkapkan bukti lebih lanjut
untuk pengelompokan spesies yang bersekutu secara taksonomi.
Misalnya, 23 genera diwakili oleh dua spesies,
Gambar 2. Analisis NJ dari Poisson mengoreksi p-jarak berdasarkan dan ini membentuk pasangan monofiletik dalam 18 kasus. Demikian
pada analisis 208 asam amino dalam 100 taksa milik pula, lima dari enam genera diwakili oleh tiga spesies
delapan ordo serangga. Bilah skala, 0,05. membentuk kumpulan monofiletik.

Prok. R. Soc. London. B (2003)

Machine Translated by Google
318 PDN Hebert dan identifikasi berbasis DNA lainnya
Tabel 2. Persentase keberhasilan dalam mengklasifikasikan spesies ke kapal
anggota kelompok taksonomi tertentu berdasarkan variasi urutan pada COI.
(n menunjukkan jumlah taksa yang diklasifikasikan menggunakan masing-masing
takson 'profil'.)
takson kelompok sasaran n % kesuksesan
kingdom Animalia kelas 7 filum 8 55 96.4
Hexapoda ordo memesan 50 100
150 100
Lepidoptera 200 spesies
(b) Menguji tugas taksonomi
Lima puluh tiga dari 55 spesies 'uji' (96,4%) ditugaskan ke filum yang
benar dalam analisis pada tingkat ini
(Meja 2). Pengecualiannya adalah annelid polychaete yang
dikelompokkan paling dekat dengan moluska dan bivalvia yang
dikelompokkan dengan salah satu outlier arthropoda. Namun, dalam
kedua kasus, ada perbedaan urutan yang substansial
(13% dan 25%, masing-masing) antara takson uji dan
garis keturunan dalam profil yang paling mirip dengannya. Keberhasilan
identifikasi di tingkat ordinal adalah 100% karena semua 50
spesies serangga ditugaskan ke urutan yang benar. Terlebih lagi, ketika
spesies 'uji' milik perwakilan keluarga yang dibenci dalam profil ordinal,
biasanya dikelompokkan paling
erat dengan itu. Keberhasilan identifikasi pada tingkat spesies juga 100%,
karena masing-masing dari 150 individu 'pengujian' dikelompokkan paling
dekat dengan spesies sejenis dalam profil. Itu
urutan dalam profil spesies kemudian digabungkan
dengan orang-orang dari taksa 'tes' untuk memungkinkan lebih detail
pemeriksaan faktor-faktor yang memungkinkan keberhasilan klasifikasi
(Lampiran E elektronik tersedia di The Royal
Situs Web Publikasi Masyarakat). Analisis MDS (gambar 4)
menunjukkan bahwa taksa 'pengujian' selalu baik secara genetik
identik dengan atau paling erat terkait dengan ciri khasnya dalam profil.
Pemeriksaan jarak genetik
matriks mengkuantifikasi fakta ini, menunjukkan bahwa divergensi
antara individu sejenis selalu kecil,
nilai keluarga rata-rata 0,25% (tabel 3). Sebaliknya,
divergensi urutan antar spesies jauh lebih besar,
rata-rata 6,8% untuk taksa kongenerik dan lebih tinggi untuk taksa yang
terkait lebih jauh (tabel 3). Beberapa pasangan spesies menunjukkan
nilai yang lebih rendah, tetapi hanya empat dari 19 900 berpasangan
perbandingan menunjukkan divergensi yang kurang dari 3%.
Gambar 4a menunjukkan salah satu kasus ini, yang melibatkan dua spesies
dari Hypoprepia, tetapi, bahkan dalam situasi ini, tidak ada
urutan bersama antara taksa.
4. DISKUSI
Studi ini menetapkan kelayakan pengembangan sistem identifikasi
berbasis COI untuk hewan pada umumnya.
Produk PCR ditemukan dari semua spesies dan tidak ada bukti pseudogen
nuklir yang memiliki
memperumit beberapa penelitian yang menggunakan primer COI yang
merosot (Williams & Knowlton 2001). Selain itu, penyelarasan urutan COI
sangat mudah, karena indel tidak umum, memperkuat hasil pekerjaan
sebelumnya
menunjukkan kelangkaan indel dalam gen ini (Mardulyn &
Whitfield 1999). Selain dari kemudahan akuisisi dan
keselarasan, urutan COI memiliki, seperti yang diharapkan, tingkat
keragaman yang tinggi.
Prok. R. Soc. London. B (2003)
Kami menunjukkan bahwa perbedaan asam amino COI
urutannya cukup untuk memungkinkan penugasan yang andal
organisme ke kategori taksonomi yang lebih tinggi. Ini berharga
menekankan bahwa taksa yang paling baru dianalisis ditempatkan di
urutan atau filum yang benar meskipun fakta bahwa file pro kami didasarkan
pada sebagian kecil spesies anggota.
Misalnya, profil ordinal kami, yang didasarkan pada just
0,002% dari total spesies dalam ordo ini, menyebabkan 100%
keberhasilan identifikasi. Dua kesalahan identifikasi di
tingkat filum tidak diragukan lagi merupakan konsekuensi dari ukuran dan
keragaman profil filum kami yang terbatas. Polychaete yang salah
ditempatkan adalah milik ordo yang tidak ada di
profil, sedangkan moluska yang salah diidentifikasi milik a
subclass yang diwakili dalam profil hanya dengan satu
jenis. Kesalahan identifikasi semacam itu tidak akan terjadi pada file pro
yang mensurvei keragaman COI secara lebih menyeluruh di antara
anggota kumpulan sasaran. Keberhasilan umum dari
COI dalam mengenali hubungan antar taksa dalam kasus ini
penting karena menandakan bahwa konvergensi karakter
dan transfer gen horizontal (yaitu melalui retrovirus) belum
mengganggu pemulihan afinitas takson yang diharapkan. Terlebih lagi, ini
menetapkan bahwa konten informasi COI adalah
cukup untuk memungkinkan penempatan organisme di
peringkat taksonomi terdalam.
Standar emas untuk sistem taksonomi apa pun adalah kemampuannya
untuk memberikan identifikasi spesies yang akurat. Profil spesifikasi COI
kami 100% berhasil mengidentifikasi lepidopteran
spesies, dan kami mengharapkan hasil yang sama pada kelompok lain,
karena Lepidoptera adalah salah satu yang paling taksonomi
beragam ordo hewan dan mereka menunjukkan urutan rendah
divergensi. Ada juga alasan untuk berharap sukses
diagnosis di tempat lain, karena kekayaan spesies lepi dopterans di lokasi
penelitian melebihi yang akan
ditemui dalam survei regional sebagian besar ordo hewan.
Keragaman yang lebih tinggi akan ditemui untuk beberapa pesanan di
pengaturan tropis (Godfray et al. 1999), tetapi diagnosis COI
tidak boleh gagal di lokasi ini kecuali spesies luar biasa
muda.
Sistem identifikasi berbasis COI juga dapat membantu
penggambaran spesies. Misalnya, pemeriksaan matriks jarak genetik untuk
lepidoptera menunjukkan bahwa nilai divergensi antar spesies biasanya
lebih besar dari
3%. Faktanya, ketika nilai ini digunakan sebagai ambang batas
untuk diagnosis spesies, itu mengarah pada pengakuan 196 out
dari 200 (98%) spesies yang dikenali melalui studi morfologi sebelumnya.
Pengecualiannya adalah empat congeneric
pasangan spesies yang secara genetik berbeda tetapi menunjukkan
(0.6-2.0%) divergensi, menunjukkan asal mereka baru-baru ini.
Kemudahan umum diagnosis spesies mengungkapkan salah satu
nilai-nilai besar dari pendekatan berbasis DNA untuk identifikasi.
Spesies yang baru ditemui biasanya akan memberi sinyal
kehadiran oleh perbedaan genetik mereka dari anggota kumpulan yang
diketahui.
Prospek menggunakan ambang batas COI standar untuk
panduan diagnosis spesies dalam situasi di mana pekerjaan taksonomi
sebelumnya terbatas menarik. Namun,
penting untuk memvalidasi pendekatan ini dengan menentukan
ambang batas yang membedakan spesies di wilayah geografis lain
wilayah dan kelompok taksonomi. Ambang batas khususnya perlu
ditetapkan untuk kelompok dengan perbedaan
dalam sifat-sifat, seperti panjang generasi atau rezim penyebaran,
yang cenderung mengubah tingkat evolusi molekuler atau
luasnya subdivisi populasi. Namun, perbedaan dalam
Machine Translated by Google
Identifikasi berbasis DNA PDN Hebert dan lainnya 319

2 2
sebuah) b)

Grammia virguncula
1 Hipoprepia fucosa
Grammia virgo
Hipoprepia miniata
Grammia arge
Furcula cinerea
Furcula borealis
Spilosoma congrua 1
Furcula sederhana
Peridea basitriens
Spilosoma virginica
Clostera albosigma
Datana ministra Notodonta simpliria

Haploa confusa Nadata gibbosa

0 0 Clostera apicalis Gluphisia lintneriSymmerista leucitys
Halysidota tessellaris Hyphantria cunea

Elang Euchaetes Pyrrharctia isabella Odontosia elegans

Elida caniplaga
Ctenucha virginica
Heterocampa guttivita
Lophocampa maculata Heterocampa umbrata Pheosia rimosa
Phragmatobia fuliginosa
Schizura badia
_1 Cycnia tenera _1 Heterocampa biundata
Schizura unicornis
Lochmaeus manteo
Cycnia oregonensis
Cisseps fulvicollis

_2 _1 1 2 _2 _1 0 1 2
0 dimensi 1
dimensi 1

2
c)

1
Bombycoides Lapara
Smerinthus cerisyi
Sphinx canadensis

Sphinx gordius
Ceratomia undulosa

0 Sphecodina abbottii Prasasti Deidamia

Smerinthus jamaicensis

_1 Paonias myops Paonias excaecatus

Pachysphinx sederhana

_2 _1 0 1 2

dimensi 1

Gambar 4. Penskalaan multidimensi jarak Euclidian antara gen COI dari (a) 18 spesies Arctiidae, (b) 20 spesies Notodontidae dan
(c) 11 spesies Sphingidae. Lingkaran mengidentifikasi perwakilan tunggal dari setiap spesies yang termasuk dalam profil, sedangkan tanda
silang menandai posisi individu 'uji'. Profil dan individu uji dari spesies yang sama selalu dikelompokkan bersama.

ambang batas mungkin lebih kecil dari yang diharapkan.
Sebagai contoh, spesies vertebrata yang berbeda biasanya
menunjukkan lebih dari 2% urutan divergensi pada sitokrom b
(Avise & Walker 1999), nilai yang mendekati 3% ambang batas
COI yang diadopsi untuk lepidoptera dalam penelitian ini.
Kemungkinan penerapan sistem identifikasi COI untuk
kelompok hewan baru dan pengaturan geografis menunjukkan
kelayakan untuk membuat sistem identifikasi untuk hewan
secara luas. Tentu saja, primer yang ada memungkinkan
pemulihan gen ini dari sebagian besar, jika tidak semua,
spesies hewan dan urutannya cukup berbeda untuk
memungkinkan pengenalan semua kecuali spesies termuda.
Tentu saja, mustahil bagi sistem identifikasi berbasis mitokondria spesimen museum tanpa penghancurannya, dimungkinkan
mana pun untuk menyelesaikan sepenuhnya kompleksitas kehidupan.
Aries dikaburkan oleh hibridisasi atau introgresi, analisis
tambahan dari satu atau lebih gen nuklir akan diperlukan.
Demikian pula, ketika spesies telah muncul melalui poliploidisasi,
penentuan ukuran genom mungkin diperlukan. Sementara
protokol akan diperlukan untuk menangani komplikasi tersebut,
sistem identifikasi berbasis COI tidak diragukan lagi akan
memberikan resolusi taksonomi yang melebihi apa yang dapat
dicapai melalui studi morfologi. Selain itu, pembuatan profil COI
akan memberikan solusi parsial untuk masalah penipisan
jajaran ahli taksonomi morfologi dengan memungkinkan
kristalisasi pengetahuan mereka sebelum mereka meninggalkan
lapangan. Juga, karena urutan COI dapat diperoleh dari
untuk
Dimana
mendapatkan
spesies terikat
kembali taksonomi.

Prok. R. Soc. London. B (2003)

Machine Translated by Google
320 PDN Hebert dan identifikasi berbasis DNA lainnya
Tabel 3. Persentase divergensi urutan nukleotida (jarak K2P) pada COI antara anggota lima famili lepidopteran di
tiga tingkat afinitas taksonomi.
(Pada tingkat spesies, n menunjukkan jumlah spesies yang dianalisis oleh dua atau lebih individu. Pada tingkat generik, n
mewakili jumlah genera dengan dua atau lebih spesies, sedangkan pada tingkat famili menunjukkan jumlah total spesies yang dianalisis.)
keluarga n dalam spesies
Arctiidae 13 0.33
Geometridae 30 0,23
Noctuidae 42 0,17
Notodontidae 14 0,36
Sphingidae 8 0,17
kemampuan ekonomi, meskipun dalam format baru, untuk kelompok yang
saat ini tidak memiliki otoritas.
Kami percaya bahwa database COI dapat dikembangkan di dalam
20 tahun untuk 5-10 juta spesies hewan di planet ini
(Hammond 1992; Novotny et al. 2002) untuk kira-kira
$ 1 miliar, jauh lebih sedikit daripada yang diarahkan ke sains utama lainnya
inisiatif seperti proyek Genom Manusia atau
Stasiun ruang angkasa Internasional. Apalagi upaya awal
bisa fokus pada spesies ekonomi, medis atau akademis
pentingnya. Akuisisi data sekarang cukup sederhana untuk
laboratorium individu untuk mengumpulkan, dalam satu tahun, file pro
COI untuk 1000 spesies, jumlah yang lebih besar dari itu di banyak
kelompok taksonomi utama pada skala benua. Satu kali
selesai, profil ini akan segera hemat biaya dalam banyak konteks
taksonomi, dan inovasi dalam
teknologi pengurutan menjanjikan pengurangan di masa depan dalam
biaya identifikasi berbasis DNA.
Jika dikembangkan secara komprehensif, database COI dapat
berfungsi sebagai dasar untuk sistem bioidentifikasi global
(GBS) untuk hewan. Implementasi pada skala ini akan
membutuhkan pembentukan database genomik baru.
Sementara GenBank bertujuan untuk cakupan yang komprehensif dari
keragaman genomik, database GBS akan bertujuan untuk cakupan
taksonomi yang komprehensif hanya dari satu gen.
Melalui pengiriman berbasis web, sistem ini dapat menyediakan
akses mudah ke informasi taksonomi, manfaat tertentu
ke negara-negara berkembang. Adopsinya oleh sebuah organisasi
seperti Fasilitas Informasi Keanekaragaman Hayati Global atau
All Species Foundation akan menjadi langkah penting
menuju memastikan umur panjang yang kurang di banyak berbasis web
sumber daya. Setelah terbentuk, sistem identifikasi mikrogenomik ini
akan mengatasi defisit morfologis
pendekatan untuk diskriminasi spesies: batas-batas keanekaragaman
intraspesifik akan dapat diukur, spesies saudara akan
dikenali, keputusan taksonomi akan objektif dan
semua tahap kehidupan akan dapat diidentifikasi. Selain itu, setelah
selesai, GBS akan memungkinkan satu laboratorium untuk mengeksekusi
diagnosis takson di seluruh spektrum penuh kehidupan hewan.
Pembentukan GBS akan menjadi usaha yang substansial
dan akan membutuhkan aliansi erat antara ahli biologi molekuler dan
ahli taksonomi. Namun, majelisnya menjanjikan
baik revolusi dalam akses ke informasi biologis dasar
dan pandangan baru yang terperinci tentang asal usul keanekaragaman
hayati.
Pekerjaan ini didukung oleh hibah dari NSERC dan Can ada Research Chairs
Program kepada PDNH Teri Crease, Mel ania Cristescu, Derek Taylor,
Jonathan Witt dan dua pengulas
memberikan komentar yang bermanfaat pada draf awal naskah ini.
Prok. R. Soc. London. B (2003)
n dalam genus n dalam keluarga
4 7.0 18 10.0
10 9.1 61 12.5
12 5.8 90 10.4
4 5.9 20 12.4
3 6.4 11 10.5
Penulis berterima kasih kepada Win Bailey, Klaus Bolte, Steve Burian, Don
Klemm, Don Lafontaine, Steve Marshall, Christine Nalepa,
Jeff Webb dan Jack Zloty baik untuk menyediakan spesimen atau memverifikasi
tugas taksonomi. Mereka juga berterima kasih kepada Lisa Schie man, Tyler
Zemlak, Heather Cole, dan Angela Holliss atas
bantuan dengan analisis DNA.
REFERENSI
Allander, T., Emerson, SU, Engle, RE, Purcell, RH &
Bukh, J. 2001 Metode penemuan virus yang menggabungkan
Pengobatan DNase dan penerapannya pada identifikasi
dua spesies parvovirus sapi. Prok. Natl Acad. Sci. AS 98, 11 609–11 614.
Avise, JC & Walker, D. 1999 Realitas dan angka spesies
pada vertebrata seksual: perspektif dari genom yang ditularkan secara
aseksual. Prok. Natl Acad. Sci. AS 96, 992–995.
Brown, B., Emberson, RM & Paterson, AM 1999 Mito chondrial COI and II
memberikan penanda yang berguna untuk Weiseana
(Lepidoptera, Hepialidae) identifikasi spesies. Banteng. Ento mol. Res.
89, 287–294.
Bucklin, A., Guarnieri, M., Hill, RS, Bentley, AM &
Kaartvedt, S. 1999 Taksonomi dan penilaian sistematis
copepoda planktonik menggunakan urutan COI mitokondria
variasi dan kompetitif, PCR spesifik spesies. Hidrobiol 401, 239–254.
Cox, AJ & Hebert, PDN 2001 Kolonisasi, kepunahan
dan pola filogeografi pada krustasea air tawar.
mol. Ekol. 10, 371–386.
Doyle, JJ & Gaut, BS 2000 Evolusi gen dan taksa: a
primer. Tanaman Mol. Biol. 42, 1–6.
Folmer, O., Hitam, M., Hoeh, W., Lutz, R. & Vrijenhoek, R.
1994 DNA primer untuk amplifikasi mitokondria cyto chrome c oxidase
subunit I dari beragam metazoan invert
ebrates. mol. Maret Biol. Bioteknologi. 3, 294–299.
Gaston, KJ & Hudson, E. 1994 Pola regional keanekaragaman
dan perkiraan kekayaan spesies serangga global. keanekaragaman hayati.
Konservasi 3, 493–500.
Godfray, HCJ, Lewis, OT & Memmott, J. 1999 Belajar
keanekaragaman serangga di daerah tropis. Fil. Trans. R. Soc.
London. B354 , 1811–1824. (DOI 10.1098/rstb.1999.0523.)
Hamels, J., Gala, L., Dufour, S., Vannuffel, P., Zammatteo,
N. & Remacle, J. 2001 Konsensus PCR dan microarray untuk
diagnosis genus Staphylococcus, spesies, dan resistensi methicil lin.
BioTeknik 31, 1364–1372.
Hammond, P. 1992 Inventarisasi spesies. Dalam keanekaragaman hayati global:
status sumber daya hayati bumi (ed. B. Groombridge), hlm.
17–39. London: Chapman & Hall.
Hawksworth, DL & Kalin-Arroyo, MT 1995 Besaran
dan distribusi keanekaragaman hayati. Dalam penilaian keanekaragaman
hayati global (ed. VH Heywood), hlm. 107-191. Pers Universitas Cambridge.
Jarman, SN & Elliott, NG 2000 Bukti DNA untuk kematian
Machine Translated by Google
spesiasi Kenozoikum phological dan samar di dae Anaspidi, 'fosil
hidup' dari Trias. J. Evol. Biol. 13, 624–633.
Knowlton, N. 1993 Spesies saudara di laut. A.Pdt.Ekol.
Sistem 24, 189–216.
Knowlton, N. & Weigt, LA 1998 Tanggal baru dan tarif baru
untuk perbedaan di seluruh Tanah Genting Panama. Prok. R. Soc.
London. B 265, 2257–2263. (DOI 10.1098/rspb.1998.0568.)
Kumar, S. & Gadagkar, SR 2000 Efisiensi metode penyambungan
tetangga dalam merekonstruksi dalam dan dangkal
hubungan evolusioner dalam filogeni besar. J. Mol. Evolusi
51, 544–553.
Kumar, S., Tamura, K., Jacobsen, IB & Nei, M. 2001
MEGA2: perangkat lunak analisis genetika evolusi molekuler.
Tempe, AZ: Universitas Negeri Arizona.
Kurtzman, CP 1994 Taksonomi molekuler dari ragi. Ragi
10, 1727-1740.
Lessa, P. 1990 Penskalaan multidimensi genetik geografis
struktur. Sistem Zool. 39, 242–252.
Lynch, M. & Jarrell, PE 1993 Sebuah metode untuk mengkalibrasi
jam molekuler dan penerapannya pada mitokondria hewan
DNA. Genetika 135, 1197–1208.
Mardulyn, P. & Whitfield, JB 1999 Sinyal filogenetik dalam
gen COI, 16S, dan 28S untuk menyimpulkan hubungan
di antara genera Microgastrinae (Hymenoptera:
Braconidae): bukti tingkat diversifikasi yang tinggi dalam hal ini
kelompok parasitoid. mol. Filogenet. Evolusi 12, 282–294.
Nanney, DL 1982 Gen dan fen dalam Tetrahymena. Biosains 32,
783–788.
Nei, M. & Kumar, S. 2000 Evolusi molekuler dan etika filogen. Pers
Universitas Oxford.
Novotny, V., Baset, Y., Miller, SE, Weiblen, GD, Bremer,
B., Cizek, L. & Drezel, P. 2002 Kekhususan inang yang rendah
dari serangga bivoranya di hutan tropis. Alam 416, 841–845.
Prok. R. Soc. London. B (2003)
Identifikasi berbasis DNA PDN Hebert dan lainnya 321
Pace, NR 1997 Pandangan molekuler keanekaragaman mikroba dan
biosfer. Sains 276, 734–740.
Saccone, C., DeCarla, G., Gissi, C., Pesole, G. & Reynes, A.
1999 Genomik evolusioner di Metazoa: DNA mitochon drial
sebagai sistem model. Gen 238, 195–210.
Simmons, RB & Weller, SJ 2001 Utilitas dan evolusi dari
sitokrom b pada serangga. mol. Filogenet. Evolusi 20, 196– 210.
Trewick, SA 2000 Mendukung urutan DNA mitokondria
bukti allozim untuk radiasi samar Selandia Baru Per ipatoides
(Onychophora). mol. Ekol. 9, 269–282.
Vincent, S., Vian, JM & Carlotti, MP 2000 Parsial
sekuensing gen subunit sitokrom oksidase-b. I. A
alat untuk mengidentifikasi spesies lalat tiup Eropa
untuk estimasi interval post mortem. J. Ilmu Forensik. 45, 820–823.
Barang, JP & Cunningham, CW 2001 Filogeni dan
ekologi sejarah intertidal Atlantik Utara. Evolusi
12, 2455–2469.
Williams, ST & Knowlton, N. 2001 Gen semu mitokondria meresap
dan sering berbahaya dalam gertakan
udang Alpheus. mol. Biol. Evolusi 18, 1484–1493.
Wilson, KH 1995 Biologi molekuler sebagai alat taksonomi.
klinik Menulari. Dis. 20 (Suppl.), 192–208.
Zhang, D.-X. & Hewitt, GM 1997 Penilaian universalitas dan
kegunaan satu set primer mitokondria yang dilestarikan
pada serangga. Serangga Mol. Biol. 6, 143–150.
Karena kertas ini melebihi panjang maksimum yang biasanya diizinkan,
penulis telah setuju untuk berkontribusi pada biaya produksi.
Kunjungi http://www.pubs.royalsoc.ac.uk untuk melihat lampiran elektronik untuk
makalah ini.