Khena Zuraeda-FIKES

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA

PRODUK BAKSO SAPI YANG BEREDAR DI
KECAMATAN CIPUTAT TIMUR MENGGUNAKAN
REAL TIME POLYMERASECHAIN REACTION
(RT-PCR)
SKRIPSI
KHENA ZURAEDA
NIM. 11141020000042
FAKULTAS ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
OKTOBER 2018
ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA

PRODUK BAKSO SAPI YANG BEREDAR DI
KECAMATAN CIPUTAT TIMUR MENGGUNAKAN
REAL TIME POLYMERASECHAIN REACTION
(RT-PCR)
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi
KHENA ZURAEDA
NIM. 11141020000042
FAKULTAS ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
OKTOBER 2018
i
Dr. Nurmeilis, M. Si., Apt
NIP. 197404302005012003
HALAMAN PENGESAHAN
Nama : Khena Zuraeda

NIM : 11141020000042
Program Studi : Farmasi
Judul : Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Bakso Sapi
Yang Beredar Di Kecamatan Ciputat Timur
Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR)
Telah berhasil dipertahankan dihadapan Dewan Penguji dan diterima

sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar
Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
DEWAN PENGUJI
Pembimbing I : Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. ( )
Pembimbing II : Chris Adhiyanto.,M.Biomed.,Ph.D ( )
Penguji I : Dr. M.Yanis Musdja.,M.Si.,Apt ( )
Penguji II : Dr.Endah Wulandari.,M.Biomed ( )
iii
ABSTRAK

Judul : Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Bakso Sapi
Yang Beredar Di Kecamatan Ciputat Timur
Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR)
Tingginya harga daging sapi dan kurangnya suplai daging sapi

menyebabkan produsen produk olahan daging merasa kesulitan untuk membeli
daging sapi. Untuk mengatasi hal tersebut, para produsen daging olahan
melakukan substitusi daging sapi dengan menggunakan jenis daging lain yang
harganya lebih murah seperti daging babi. Dalam Islam, babi merupakan salah
satu hewan yang diharamkan untuk dikonsumsi.Penelitian ini dilakukan untuk
mengidentifikasi adanya cemaran daging babi pada produk bakso sapi yang
beredar di Kecamatan Ciputat Timur. Penelitian ini dilakukan dengan
mengamplifkasi hasil isolasi DNA menggunakanReal Time PCR.Real Time PCR
merupakan satu metode yang cukup akurat untuk mendeteksi cemaran daging babi
pada produk pangan. Isolat DNA dari 1 kontrol positif, 1 kontrol negatif dan 7
sampel didapatkan menggunakan kit isolasi yaitu Wizard®Genomic DNA
Purification Kit dengan hasil konsentrasi dankemurnian yang memenuhi syarat.
Hasil analisis isolat DNA pada elektroforesis menunjukkan primer yang
digunakan spesifik. Suhu annealing yang digunakan untuk amplifikasi yaitu
65ºC untuk primer sapi dan 60 ºC untuk primer babi. Hasil menunjukkan bahwa
Primer sapi tidak dapat mengamplifikasi secara spesifik sehingga NTC dan
kontrol negatif menghasilkan nilai Cp atau teramplifikasi. Sedangkan untuk
kontrol positif dan semua sampel menunjukkan bahwa pada sampel bakso sapi
yang beredar di kecamatan ciputat timur tidak mengandung DNA daging babi.
Kata Kunci : Real TimePCR , Bakso, Cemaran Daging Babi
v
ABSTRACT
Name : Khena Zuraeda

Major : Pharmacy
Title : Analysis of Pork Contamination In Beef Meet Ball Which
Are Available in East Ciputat area Using Real Time
Polymerase Chain Reaction (PCR)
The high price of beef and the lack of beef supply have caused producers of
processed meat products to find it difficult to buy beef. To overcome this,
processed meat producers substitute beef using other types of meat that are
cheaper, such as pork. In Islam, pigs are the animals that are forbidden for
consumption. This research was conducted to identify the presence of pork
contamination in beef meatball products circulating in East Ciputat District. This
research was conducted by amplifying the results of DNA isolation using Real
Time PCR. Real Time PCR is an accurate method for detecting pork
contamination in food products. DNA isolates from one positive control, one
negative control and seven samples were obtained using an isolation kit namely
Wizard® Genomic DNA Purification Kit with results of concentration and purity
that met the requirements. The results of DNA isolate analysis
on Electrophoresis showed that the primers used were specific. The annealing
temperature used for amplification is 65ºC for primary cattle and 60 ºC for
primary pigs. The results show that primary cattle cannot amplify specifically so
that NTC and negative controls produce Cp values or amplified. Whereas for
positive control and all samples showed that the samples of beef meatballs
circulating in the eastern Ciputat district did not contain pork DNA.
Keyword : Real TimePCR, Meatball, Contamination of Pork
vi
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, segala puji syukur selalu terpanjatkan kehadirat Allah

SWT yang senantiasa mencurahkan segala nikmat, karunia dan ilmu kepada kita
semua. Shalawat serta salam semoga selalu tercurah kepada junjungan Nabi Besar
Muhammad SAW. Berkat rahmat dan pertolongan Allah kepada penulis dalam
menyelesaikan skripsi penelitian yang berjudul “Analisis Cemaran Daging Babi
Pada Produk Bakso Sapi Yang Beredar Di Kecamatan Ciputat Timur
Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)” yang
bertujuan untuk memenuhi persyaratan guna memperoleh gelar sarjana farmasi di
Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta.”
Selama proses penyusunan dan penulisan skripsi ini, penulis menyadari
bahwa skripsi ini tidak akan terwujud tanpa begitu banyak bantuan dari berbagai
pihak yang telah meluangkan waktunya, mendidik, membimbing, dan mendoakan
penulis. Oleh karena itu, penulis menyampaikan penghargaan setinggi-tingginya
dan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Ibu Dr.Zilhadia.,M.Si.,Apt selaku pembimbing pertama serta Bapak Chris
Adhiyanto.M.Biomed.,Ph.D, selaku pembimbing kedua yang telah
membantu, membimbing dan memberikan ilmu kepada saya, serta
meluangkan waktu, tenaga dan pikiran dari awal peneltian sampai pada
penyusunan skripsi ini selesai.
2. Prof. Dr. Arief Sumantri, S.KM, M.KM., selaku Dekan Fakultas Kedokteran
dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3. Ibu Nurmeilis, M.Si., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas
Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
4. Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si. Apt selaku dosen Penasehat Akademik (PA)
atas motivasi dan bantuan selama empat tahun penulis menimba ilmu di
Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
5. Bapak dan Ibu dosen pengajar Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu
Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah
memberikan ilmu dan teladan selama masa perkuliahan.
vii
6. Kedua orang tua tercinta, Bapak Siswoyo dan Ibu Murtini atas doa,
kesabaran, bimbingan, dukungan moral, materi, serta kasih sayang.
7. Adik-adik saya yang sangat saya sayangi, Arya Natan dan Lutfi Adiansyah
terima kasih atas doa dan dukungannya. Semoga kita selalu berbakti kepada
Bapak dan Ibu serta selalu dalam naungan kasihNya.
8. Laela Wulandari partner dan Teman seperjuangan “Sarjana Farmasi 2018”
yang selalu setia membantu dan memotivasi dalam menyelesaikan skripsi
penelitian ini.
9. Novia,Irma, Idha, Kak Roisqi dan M.Sofyan atas perhatian, semanaga,
dukungan dan selalu meluangkan waktu untuk mendengarkan keluh kesah
penulis selama ini.
10. Teman-teman Grup Happy yang selau memberikan dukungan , motivasi,
waktu untuk selalu mendengarkan keluh kesah penulis serta telah telah
memberikan warna dalam kehidupan perkuliahan ini.
11. Teman-teman seperjuangan Mahasiswa/i S1 Farmasi UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta angkatan 2014.
12. Seluruh pihak yang telah banyak membantu penulis dalam penulisan skripsi
ini.
Semoga Allah SWT membalas atas segala kabaikan semua pihak yang telah
membantu dalam penyusunan skripsi ini. Akhirnya dengan segala kerendahan
hati, penulis berharap kritik dan saran atas kekurangan dan keterbatasan proposal
penelitian ini. Semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat untuk banyak pihak
dan perkembangan ilmu pengetahuan.
Ciputat, Oktober 2018
Penulis
viii
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI
TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Sebagai civitas akademik Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta, Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

NIM : 11141020000042
Fakultas : Ilmu Kesehatan
Jenis Karya : Skripsi
Demi perkembangan ilmu pengetahuan, Saya menyetujui skripsi/karya

ilmiah saya, dengan judul:
Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Bakso Sapi Yang Beredar
Di Kecamatan Ciputat Timur Menggunakan Real Time Polymerase
Chain Reaction (RT-PCR)
Untuk dipublikasikan atau sitampilkan di internet atau media lain yaitu

Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang – Undang
Hak Cipta.
Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan
sebenarnya.
Dibuat di : Ciputat
Pada Tanggal : Oktober 2018
Yang menyatakan,
Khena Zuraeda
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL i
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING iii
HALAMAN PENGESAHAN iv
ABSTRAK v
ABSTRACT vi
KATA PENGANTAR vii
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ix
DAFTAR ISI x
DAFTAR GAMBAR xii
DAFTAR TABEL xiii
DAFTAR LAMPIRAN xiv
DAFTAR ISTILAH xv
BAB I PENDAHULUAN 1
1.1 Latar Belakang 1
1.2 Rumusan Masalah 3
1.3 Tujuan Penelitian 3
1.4 Manfaat Penelitian 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4

2.1 Daging Babi 4
2.2 Organel Sel 5
2.3 Asam Nukleat dan Protein 7
2.4 DNA 9
2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA 9
2.4.2 Sifat Fisika DNA 11
2.4.3 Fungsi DNA 11
2.4.4 Isolasi DNA 12
2.5 DNA Mitokondria 14
2.6 Elektroforesis Gel Agarosa 17
2.7 PCR 19
2.7.1 Komponen PCR 21
2.7.2 Tahapan PCR 24
2.8 RT-PCR 25
2.8.1 Pewarma Fluoresens 28
2.9 Bakso 30
BAB III METDOLOGI PENELITIAN 32

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 32
3.1.1 Tempat 32
3.1.2 Waktu 32
3.2 Alat dan Bahan 32
3.2.1 Alat 32
3.2.2 Bahan 32
3.3 Tahapan Penelitian 33
x
3.4 Prosedur Kerja 33
3.4.1 Pengumpulan Sampel 33
3.4.2 Isolasi DNA 33
3.4.3 Analisis Isolat DNA 34
3.4.3.1 Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV 34
3.4.3.2 Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa 35
3.4.4 Amplifikasi DNA dengan menggunakan Real Time PCR 36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 39
4.1 Isolasi DNA 39
4.2 Hasil Analisis Isolat DNA 40
4.2.1 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV 40
4.2.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarose 42
4.3 Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan Real Time PCR 45
4.3.1 Penetapan Metode Amplifikasi yang Optimal 46
4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan
NTC menggunakan Primer Sapi 47
4.3.3 Hasil Amplifikasi DNA Daging Babi, Bakso Sapi dan
4.3.4Hasil Amplifikasi DNA Daging Babi, Bakso Sapi dan
NTC menggunakan Primer Babi 52
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 54
5.1 Kesimpulan 54
5.2 Saran 54
DAFTAR PUSTAKA 55
LAMPIRAN 64
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
2.1 Sel Prokariotik dan Eukariotik 5

2.2 Struktur Primer DNA dan RNA 8
2.3 Struktur Basa Nitrogen 10
2.4 Struktur Double Helix 11
2.5 Struktur Mitokondria ................................................................................. 15
2.6 Struktur mtDNA ........................................................................................ 16
2.7 Simulasi PCR ............................................................................................. 20
2.8 Kurva RT PCR........................................................................................... 27
2.9 Prinsip SYBR Green dalam Mendeteksi Produk RT PCR ........................ 28
4.1 Hasil Elektroforesis PCR dengan Primer Sapi dan Babi ........................... 42
4.2 Hasil Uji Spesifisitas Primer Sapi dengan BLAST melalui
Database NCBI 44
4.3 Hasil Uji Spesifisitas Primer Babi dengan BLAST melalui
Database NCBI 44
4.4 Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan
4.5. Mealting Peaks Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging
Babi dan NTC menggunakan Primer Sapi 48
4.6 Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi,
Bakso Sapi dan NTC menggunakan Primer Sapi 49
4.7 Mealting Peaks Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Bakso
Sapi, Daging Babi dan NTC menggunakan Primer Sapi 51
4.8 Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Bakso Sapi,
Daging Babi dan NTC menggunakan Primer Babi 52
4.9 Melting Peaks Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Bakso
Sapi, Daging Babi dan NTC menggunakan Primer Babi 53
xii
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
2.1 Perbandingan Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik 6

2.2 Kisaran Umum Konsentrasi Agarosa 17
2.3 Perbandingan Menggunakan Deteksi SYBR Green dan Deteksi
Hydrolisis Probe 29
2.4 Kandungan Gizi Bakso 30
3.1 Susunan Basa Primer 33
3.2 Pengaturan Program Untuk Optimasi Suhu Amplifikasi Primer
Sapi dengan Modifikasi 37
3.3 Pengaturan Program Untuk Optimasi Suhu Amplifikasi Primer
Babi dengan Modifikasi 38
3.4 Pengaturan Program PCR Konvensional 38
4.1 Hasil Konsentrasi dan Kemurnian DNA 41
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Kerangka Penelitian 64
2. Alur Kerja Isolasi DNA Mengunakan Genomic DNA
Purification Kit 65
3. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer 66
4. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer 67
5. Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA 68
6. Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA 69
7. Optimasi Suhu Annealing Primer Sapi 71
8. Program Amplifikasi yang Digunakan pada RT PCR dengan
Metode SYBR Green 75
9. Gambar Alat yang Digunakan dalam Penelitian 77
xiv
Daftar Istilah
BLAST : Basic Local Aligment Search Tool merupakan

program untuk menganalisis kesejajaran sekuen query
(DNA) atau protein dengan sekuen DNA atau protein
pada datbase NCBI.
CP : Crosing Point merupakan siklus yang menunjukan
sinyal fluoresensi dari akumulasi amplikon telah
melewati garis threshold.
Garis Threshold : Garis penanda silkus awal dari reaksi PCR yaitu saat
sinyal fluoresensi berada pada tingkat terendah (sinyal
3-15).
Fit Point :Metode penentuan CP melalui pertemuan antara garis
treshold dengan kurva amplifikasi.
Formasi Hairpin : Terbentuk struktur loop/hairpin pada primer yang
disebabkan oleh intraksi intramolekuler yang dapat
memicu terbentuknya amplifikasi yang nonspesifik.
Melting Curve : Analisis data pada Real Time PCR digunakan untuk
menguji spesifisitas amplikon yang terbentuk.
Mis-priming : Penempelan primer di luar sekuen target sehingga
membentuk produk amplifikasi yang nonspesifik.
NCBI : National Center for Biotechnology Information
merupakan suatu institusi milik United States National
Library of Medicine yang berperan sebagai sumber
informasi perkembangan biologi molekuler. Situs
NCBI berisi database meliputi gene bank mengenai
sekuens DNA atau protein serta memuat publikasi
„ilmiah.
NTC : No Template Control merupakan kontrol negatif
karena well tidak dimasukkan DNA.
Primer-Dimer : berkaitan suatu primer dengan primer sejenis atau
dengan primer lainnya sehingga membentuk produk
amplifikasi yang Temperature melting nonpesifik.
Tm : atau suhu melting adalah suhu saat 50 % bagian DNA
telah terbuka menjadi untai tunggal
xv
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Dalam Al Qur‟an dan Hadist, Islam mengajarkan umat Islam untuk
mengkonsumsi makanan yang halal dan thoyyib. Seorang Muslim di wajibkan
untuk memakan makanan yang halal dan menghindari semua yang haram. Suatu
makanan dapat dikatakan halal apabila tidak dilarang dalam agama. Kehalalan
suatu makanan diatur didalam Al-Qur‟an diantaranya pada Surat Al-Baqarah ayat
173 “Sesungguhnya Allah hanya mengharamkan bagimu bangkai, darah, daging
babi, dan binatang yang (ketika disembelih) disebut (nama) selain Allah”. Dari
penjelasan diatas, babi merupakan salah satu hewan yang diharamkan untuk
dikonsumsi, baik dagingnya maupun semua jenis turunannya.
Di era serba modern ini dengan produk – produk yang dihasilkan termasuk
produk-produk makanan olahan yang banyak beredar di masyarakat luas,
seringkali membuat seseorang lalai untuk mengetahui kualitas dan hukum dari
produk-produk tersebut. Sementara, peluang makanan mengandung babi cukup
besar. Hal ini karena banyak produk yang dihasilkan dari babi serta turunannya.
Bakso merupakan makanan yang banyak ditemukan di Indonesia. Bakso
adalah produk makanan yang dibuat dari daging giling dengan bumbu tambahan
yang disajikan dengan kuah kaldu serta bahan-bahan pelengkap lainnya seperti
mie, sambal dan lain-lain. Namun, karena tingginya harga daging sapi dan
kurangnya suplai daging sapi menyebabkan produsen produk olahan daging
merasa kesulitan untuk membeli daging sapi. Untuk mengatasi hal tersebut, para
produsen daging olahan tersebut melakukan substitusi bahan utama yaitu daging
sapi dengan menggunakan jenis daging lain yang harganya lebih murah. Namun,
para pedagang yang tak bertangung jawab melakukan substitusi daging sapi
dengan daging babi. Pemilihan daging babi sebagai substitusi dari daging sapi
adalah karena daging babi memiliki karakterisik yang paling mendekati daging
sapi. Selain itu, harga daging babi yang lebih murah sehingga produsen
mendapatkan laba yang lebih besar. Hal ini menimbulkan ancaman yang serius
bagi masyarakat terutama bagi seorang muslim.(Ramdhan,2017).Oleh karena
1 UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2
ituperlu dilakukan analisis yang dapat digunakan untuk menguji kehalalan dari
produk olahan daging seperti bakso.
Metode-metode analisis yang telah diteliti untuk analisis daging babi dan
atau lemak babi, antara lain e-nose GC-MS (Nurjuliana M dkk.2011),
spektrofotometri FTIR (Rohman A, Sismindari, Erwanto, Y.and Che Man, Y.B.,
2011), ELISA (Asensio, L., González, I., García, T., & Martín, R. 2008) dan Gold
Nanoparticle (Ali, M. E. Hashi,M,dkk.2012, Ali, M. E. Hashim,dkk.2011) telah
digunakan. Beberapa metode tersebut memerlukan waktu dan biaya yang banyak,
sehingga perlu adanya suatu teknik analisis yang cepat dan reliable terhadap
analisis daging babi di dalam produk bakso. Salah satu metode yang cukup akurat
untuk mendeteksi cemaran daging babi pada produk pangan adalah dengan
menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction).
Pengujian cemaran daging babi dalam berbagi produk daging olahan seperti
daging bakso dapat dideteksi melalui amplifikasi PCR. Pada tahun 2008, Alaraidh
juga berhasil melakukan isolasi DNA dan amplifikasi PCR dari sampel daging
yang terkontaminasi daging babi di pasar Arab Saudi. Margawati dan Ridwan
(2010) telah menunjukan pengujian pencemaran campuran daging babi pada
produk bakso. Pada tahun 2017, Hassan A.Al-Kahtani, Elsayed A. Ismail dan
Mohammed Asif Ahmed mendeteksi daging babi dalam campuran dua macam
daging dan beberapa produk makanan komersial menggunakan teknik PCR
konvensional dan Real-Time PCR (RT-PCR) (Hassan A.Al-Kahtani et al, 2017).
Keuntungan metode analisis dengan menggunakan DNA yaitu DNA dapat
ditemukan di semua tipe sel pada suatu individu dengan informasi genetik yang
identik. Dengan demikian upaya mendeteksi adanya campuran daging babi dalam
produk daging sapi olahan dapat dilakukan.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisa ada atau tidaknya
kandungan daging babi pada produk daging sapi olahan. Sampel yang digunakan
pada penelitian ini adalah bakso sapi. Pengujian dilakukan melalui amplifikasi
DNA mengunakan Real-Time PCR. Real-Time PCR. lebih dikenal sebagai
Quantitatif PCR karena kemampuan analisisinya yang sensitif dan spesfik
sehingga mengurangi kesalahan dalam hasil (Burnset al,2005). Pengambilan
sampel di wilayah Ciputat Timur dikarenakan Ciputat merupakan salah satu

3
kawasan pendidikan di Tanggerang Selatan yang di dominasi oleh mahasiswa dan

pelajar. Selain itu, karena kampus UIN ada di Ciputat, sehingga peneliti
berinisiatif untuk melakukan penelitian terhadap bakso yang di jual di sekitar
wilayah kecamatanCiputat Timur ini.
1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana kondisi optimal amplifikasi DNA pada bakso menggunakan
primer spesifik babi dan sapi dengan Real-Time PCR?
2. Apakah bakso sapi yang beredar di wilayah kecamatan Ciputat Timur
tercemar daging babi?
1.3 Tujuan Penelitian

Menganalisis cemaran daging pada produk bakso sapi yang beredar di
wilayah Ciputat Timur melalui amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR.
1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi kepada
masyarakat tentang keamanan dan kehalalan produk sapi yang beredar di wilayah
Ciputat. Hal ini dilakukan sebagai dharma UIN terhadap masyarakat sekitar,
sehingga masyarakat lebih berhati-hati dan bijaksana dalam mengkonsumsi
produk olahan daging seperti bakso sapi.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Daging Babi

Babi adalah sejenis hewan ungulata yang bermancung panjang dan
berhidung ceper pemakan daging maupun tumbuh-tumbuhan dan merupakan
hewan yang berasal dari Eurasia. Penelitian ilmiah modern di dua negara yaitu
Cina dan Swedia menyatakan bahwa daging babi merupakan penyebab utama
kanker anus dan kolon. Babi banyak mengandung parasit, bakteri, bahkan virus
yang berbahaya sehingga dikatakan sebagai reservoir penyakit (Hilda,2013).
Secara umum babi memiliki banyak istilah, diantarnya pig, pork, hog,
swine, boar, lard, bacon, ham, sow, sow milk, bak, char siu, cu nyuk, sou, dwaeji,
tonkatsu, b2, dan khinzir. Secara fisik babi adalah hewan mamalia yang
mempunyai tulang belakang dan berjalan menggunakan empat kaki. Relatifnya,
tubuh babi lebih rendah dan kecil dibandingkan dengan sapi. Berat badan babi
sekitar 50 hingga 350 kg tergantung berat macam-macam spesiesnya. Selain itu,
babi juga mempunyai ekor, kepala, tanduk, telinga, mata, hidung, mulut, gigi, ulu
dan beberapa organ dalam tubuhnya.
Ditinjau dari prepektif kesehatan, ada beberapa alasan logis yang membuat
konsumsi babi sangat tidak dianjurkan. Dengan memperhatikan peri kehidupan
babi secara kasat mata tampak bahwa babi adalah hewan pemalas, haus seks,
kotor, serakah, dan pelahap (Mayasari,2007). Mereka melahap hampir apa saja
yang ada di hadapannya, tidak terkecuali kotorannya sendiri. Kebiasaan ini
membuat tubuhnya menjadi sarang berbagai jenis organisme penyebab penyakit,
salah satunya Cacing trichina. Penelitian di Amerika Serikat dan Kanada
memperlihatkan bahwa umumnya pada otot mereka yang mengkonsumsi babi
didapati Cacing trichina. Sampai saat ini, belum ada obat maupun antibiotik,
untuk penyakit ini. Penyakit itu sendiri tidak menampakkan tanda-tanda yang
jelas. Satu-satunya cara menghindari penyakit ini adalah dengan menghindari
konsumsi babi.
Terdapat empat ayat dalam al-Qur‟an yang menjelaskan larangan
mengkonsumsi babi, dan satu ayat tentang laknat Allah terhadap orang yahudi

5
yang melanggar hari sabat, yakni al-Baqarah ayat 173, al-Ma‟idah ayat 3 dan 60,
al-An‟am ayat 145, dan an-Nahl ayat 115. Ayat-ayat ini sudah cukup memberikan
pemahaman bagi kaum muslimin untuk tidak melanggar larangan Allah SWT.
2.2 Organel Sel

Sel adalah komponen dasar dan unit terkecil dari kehidupan. Sel yang
menyusun makhluk hidup tingkat tinggi memang sangat kecil ukurannya sehingga
tidak dapat dilihat dengan alat bantu yang sederhana, tetapi memiliki tugas yang
sangat besar layaknya sebuah kota yang memiliki bagian-bagian untuk menunjang
kehidupan kota. Bagian-bagian yang menunjang kehidupan sel disebut organel-
organel (Yuni et al,2006). Organisme yang hidup saat ini dibagi menjadi dua
kelompok besar, yaitu prokariotik dan eukariotik. Prokariotik adalah organisme
sederhana, uniseluler yang tidak memiliki nukleus sel yang dibatasi membran.
Contoh dari prokariotik adalah bakteri. Eukariotik bisa uniseluler atau
multiseluler, sel-sel mereka mengandung inti yang berbeda, serta struktur
fungsional yang disebut organel. Satu karakteristik utama dari suatu organisme
yang hidup adalah dapat mereplikasi atau memproduksi. Untuk organisme sel
tunggal uniselluler bereproduksi dengan membelah dirinya menjadi 2 salinan baru
yang identik, sebaliknya organisme multiseluler bereproduksi dengan cara yang
bervariasi (Cain,2002).
Gambar 2.1 . Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik .

Sumber : Campbell, N.A.,et al 2002

6
Tabel 2.1. Perbandingan Sel Prokariotik dan Eukariotik

Karakteristik Prokariotik Eukariotik
Struktur genetik
Materi genetik (DNA) Kromosom tunggal Kromosom lebih dari satu
sirkular berbentuk linear
Lokasi informasi genetik Bagian nuklear Membran nukleus
(nukleoid)
Nukleus Tidak ada Ada
Histon Tidak ada Ada
Ekstrakromosomal DNA Dalam Plasmid Pada organel, seperti
mitokondria dan kloroplas,
dan di dalam plasmid
Struktur Intraseluler
Benang Mitosis Tidak Ada Terlihat ketika terjadi
pembelahan
Membran Dalam Hanya pada Organel-organel tertutup
fotosisntesis organisme oleh membran
Retikulum Endoplasma Tidak Ada Ada
Kloroplas Tidak Ada Ada pada beberapa jenis
Aparatus golgi Tidak Ada Ada
Liposom Tidak Ada Ada
Peroksisom Tidak Ada Ada
Ribosom 70 S 80 S didalam sitoplasma
dan retikulum endoplasma,
70 S pada organel lain
Sitokeleton Tidak Ada Ada
Struktur Ekstraseluler
Dinding sel Peptidoglikan Selulosa, kitin atau
ditemukan pada keduanya ditemukan pada
kebanyakan sel sel tanaman dan fungi
(Sumber : Black EM et al, 2008)

7
2.3 Asam Nukleat dan Protein

Asam nukleat dan protein merupakan senyawa polimer utama yang terdapat
pada sel. Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan informasi
genetik dalam sel. Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu DNA
(asam deoksiribonukleat) dan RNA (asam ribonukleat). DNA menyimpan
informasi genetik yang spesifik untuk setiap individu dan spesies tertentu, yang
akan diwariskan ke generasi berikutnya (Gaffar,2007).
Asam nukleat yang unit-unit pembangunnya deoksiribonukleotida, disebut
asam deoksirebonukleotida (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit ribonukleotida
disebut asam ribonukleotida (RNA). Baik RNA maupun DNA memiliki fungsi
yang berbeda, RNA yang tersusun dari asam rebonukleotida berguna dalam
sintesis protein. Sedangkan DNA yang tersusun dari asam deoksirebonukleotida
berguna dalam pembentukan inti sel. (Poedjiadi,Anna.2005)
Struktur DNA mirip dengan struktur RNA. Perbedaan diantara keduanya
terdapat pada jenis gula dan basa pada monomernya serta jumlah untai
penyusunnya. Pada DNA, tidak terdapat gugus hidroksil pada posisi karbon 2‟
dari molekul gula (2-deoksiribosa), sementara pada RNA molekul gulanya adalah
ribosa. Basa nitrogen yang terdapat pada DNA adalah adenin, guanin, sitosin dan
timin, sedangkan pada RNA jenis basanya adalah adenin, sitosin, guanin dan
urasil.
Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula
pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan
gugus fosfat. Ada dua jenis basa nitrogen yaitu basa purin dan basa pirimidin.
Basa purin dan pirimidin bergabung dengan gugus gula ribosa atau deoksiribosa
akan menghasilkan senyawa yang disebut nukleosida. Terdapat dua jenis
nukleosida: ribonukleosida dan deoksiribonukleosida. Nukleotida merupakan
ester dari asam fosfat dan nukleosida. Asam fosfat terikat pada gugus hidroksil
dari salah satu atom karbon dalam cincin pentosa. Nukleotida terdapat bebas
dalam sel, dan dapat terbentuk dari hidrolisis bertahap asam nukleat dengan enzim
nuklease (Gaffar,2007).
Asam nukleat merupakan polimer dari ratusan, ribuan, bahkan jutaan
nukleotida yang bergabung satu sama lainnya melalui ikatan fosfodiester. Ikatan

8
fosfodiester terbentuk antara gugus OH pada posisi 3‟ dengan gugus fosfat pada
posisi 5‟. Sehingga tulang punggung molekul DNA dan RNA terdiri dari gugus
fosfat dan pentosa secara bergantian (Gaffar,2007)
Gambar 2.2 Struktur Premier DNA dan RNA

Sumber :Gaffar,2007
Protein merupakan produk dari aliran informasi genetik. Sel yang
membutuhkan ribuan protein yang berbeda setiap waktu. Protein berasal
dari bahasa yunani yaitu proteos, yang berarti yang utama atau yang di
dahulukan. Kata ini diperkenalkan oleh ahli kimia Belanda, Geraldus
Mulder (1802-1880). Ia berpendapat bahwa protein adalah zat yang paling
penting dalam setiap organisme (Ellya, 2010). Protein merupakan polimer
yang panjang dari asam-asam amino yang bergabung melalui ikatan peptida.
Komposisi rata-rata unsur kimia yang terdapat dalam protein adalah karbon
55%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%, sulfur 1% dan kurang dari
1% fosfor (Winarno, 1991; Tarigan, 1983)
Asam nukleat adalah biopolymer yang berbobot molekul tinggi
dengan unit monomernya mononukleotid. Asam nukleat terdapat pada
semua sel hidup dan bertugas untuk menyimpan dan mentransfer genetik,
kemudian menerjemahkan informasi ini secara tepat untuk mensintesis
protein yang khas bagi masing-masing sel (Poedjiadi,Anna.2005).

9
2.4 DNA
DNA berperan sebagai materi genetik pada sel prokariot dan eukariot, virus,
dan plasmid, masing-masing mempunyai pengaturan dan lokasi yang berbeda.
Pada prokariot, DNA tidak terpisah dari komponen sel lain. Pada eukariot DNA
berlokasi dalam nukleus terpisah dari komponen sel lain oleh selaput inti. DNA
eukariot berikatan dengan protein, membentuk kompleks yang disebut kromatin.
Sebelum mitosis (pembelahan sel), DNA mengalami replikasi, menghasilkan dua
kromosom identik yang disebut sister kromatid (Gaffar,2007).
Kurang dari 0,1% total DNA dalam sel terdapat dalam mitokondria.
Informasi genetik dalam mitokondria dikode oleh kurang dari 20.000 pasang basa
DNA. DNA dan sistem sintesa protein dalam mitokondria lebih kurang sama
dengan sistem bakteri, dimana tidak terdapat membran yang menutupi organel
(Gaffar,2007).
2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA

Molekul DNA pertama kali diisolasi oleh F.Miescher pada tahun 1986 dari
sel spermatzoa. Ia tidak dapat mengenali sifat zat kimia tersebut secara pasti,
kemudian menyebutnya sebagai nuklein. Nuklein ini berupa senyawa kompleks
yang mengandung unsur fosfor sangat tinggi. Nuklein selanjutnya dikenal sebagai
gabungan asam nukleat dan protein sehinga sering disebut nukleoprotein. Dalam
kedua jenis asam nukleat ini (DNA dan RNA) terdapat dua basa nitrogen yaitu
purin dan pirimidin. Keduanya ditemukan oleh Fishcher pada tahun 1880
(Gaffar.2007)
DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun
dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyusun nukleotida terdiri
dari tiga jenis molekul yaitu gula pentosa (deoksiibosa pada DNA atau ribosa
pada RNA), basa nitrogen dan gugus fosfat. Basa yang ditemukan pada nukleotida
adalah basa purin (Adenin= A, guanin= G ) dan basa pirimidin (cytosin = C,
tymin = T, urasil = U). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada
posisi karbon 3‟, gugus fosfat pada posisi karbon 5‟ dan basa pada posisi karbon
1‟ molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan -

10
ikatan fosfodiester, yaitu ikatan antara fosfat dengan gula pentosa, ikatan ini
terjadi antara gugus 5‟ fosfat dengan gugus 3‟ hidroksil (Gaffar,2007).
Gambar 2.3 Struktur Basa Nitrogen Purin dan Pirimidin

(Sumber: Gaffar, 2007)
Struktur molekul DNA terdiri atas dua rangkaian nukleotida yang tersusun
secara linier. Kedua rangkaian yang saling berikatan itu terbentuk seperti tali
berpilin, sehingga molekul DNA dikatakan sebagai double helix (gambar 2.4).
Untuk membentuk rangkaian molekul DNA heliks ganda, basa nitrogen dari
setiap nukleotida dalam satu rangkaian akan berpasangan dengan basa nitrogen
dari setiap nukletida pada rangkaian lainnya melalui ikatan hidrogen. Pengikatan
basa nitrogen dari masing-masing nukleotida tersebut sangat spesifik. Basa A dari
satu nukleotida selalu berikatan dengan basa T dari nukleotida lainnya, sedangkan
basa G selalu berikatan dengan basa C. Pasangan A dan T terbentuk dengan dua
ikatan hidrogen sedangkan pasangan G dan C terbentuk dengan tiga ikatan. Oleh
karena itu, pasangan G dan C lebih stabil dari pasangan A dan T (Pratami,2011).
Salah satu jenis DNA yang pada makhluk hidup adalah DNA mitokondria
(mtDNA), yaitu DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler yang tersimpan dalam
matriks mitokondria (Bandelt et al., 2006). Ukuran mtDNA relatif sangat kecil
dibandingkan dengan ukuran DNA nukleus. Namun, mtDNA mempunyai jumlah
kopi yang tinggi, yaitu sekitar 1.000-10.000 kopi. Oleh sebab itu, mtDNA dapat
digunakan untuk analisis sampel dengan jumlah DNA yang sangat terbatas (Yeni
WH et al.,2004).

11
Gambar 2.4. Struktur Double Helix DNA, (a) Pengaturan gula, kelompok
fosfat dan basa dalam DNA (b) letak atom-atom dan ikatan-katan dalam
DNA (c) diagram yang menunjukkan DNA dalam konformasi B
(sumber: Gaffar,2007)
2.4.2 Sifat Fisika DNA

Sifat Fisika DNA adalah untai heliks DNA dapat terpisah dari rantai
komplementernya menjadi struktur tunggal dengan adanya pemanasan yang
mendekati titik didih atau (> 90°C), dan ph ekstrim (ph < 3 atau ph >10) peristiwa
ini disebut dengan denaturasi. Denaturasi DNA bersifat reversible. Proses
pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan terdenaturasi disebut
renaturasi. Proses ini dapat berjalan jika suhu mendekati suhu subdenaturasi
(mendekati 60°C) (Pratami,2011). DNA menyerap sinar UV pada panjang
gelombang 260 nm (Yuwono,2009).
2.4.3 Fungsi DNA

DNA adalah dasar kimiawi hereditas dan penyusun gen yang menjadi unit
fundamental informasi genetik. Informasi genetik yang disimpan dalam
nukleotida berfungsi untuk memenuhi dua tujuan, yaitu sumber informasi bagi
sintesis semua molekul protein pada sel serta organisme dan memberikan
informasi yang diwariskan kepada anak atau generasi berikutnya (Pratami,2011).

12
2.4.4 Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan
lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsipnya adalah memisahkan DNA
kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA
bisa dari tanaman, kultur mikroorganisme, atau sel manusia (Corkill dan
Rapley,2008). Langkah utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley,2008; Dolphin,2008). Berikut
adalah uraian tahapan isolasi DNA :
1. Penghancuran Membran Sel (Lisis)
Untuk mendapatkan DNA, membran terlebih dahulu dilisiskan
dengan senyawa kimia seperi lisozim, EDTA, dan SDS. Lisozim
merupakan enzim yang dapat memakan dinding sel. Penggunaan
lisozim biasanya untuk ekstraksi dan isolasi DNA dari sel tumbuhan.
EDTA merupakan zat yang dapat merusak memban sel dengan cara
mengikat ion Mg2+ yang berfungsi untuk mempertahankan integritas
sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak
asam nukleat. SDS (sedium deodecil sulfat) merupakan detergen yang
dapat merusak integritas membran sel dengan cara mengikat lipid
yang terdapat pada membran sel. Larutan pelisis sel umumnya terdiri
atas satu atau lebih detergen seperti SDS, NP-40, atau Triton X-100.
sel debris yang ditimbulkan akibat cairan pelisis dilakukan
sentrifugasi sehingga hanya tertinggal molekul nukleotida.
2. Pemisahan DNA dari protein sel
Protein pada sel yang dihancurkan dengan bantuan enzim
proteinase K. Enzim ini dapat memecahkan protein histon sehingga
DNA terurai. Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan
fenol (untuk mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan kloroform
(untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan).
Umumnya ditambahkan dengan perbandingan 1:1. Kemudian
dilakukan sentrifugasi kembali untuk mengendapkan molekul yang
berat, dan dipisahkan DNA yang berada pada supernatan.

13
3. Purifikasi DNA
DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan
RNA. Untuk membersihkan molekul RNA dari larutan, enzim RNAse
digunakan untuk mendegradasi molekul RNA. Dengan hilangnya
protein dan RNA, maka DNA dapat disolasi secara utuh. Molekul
DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara
presipitasi menggunakan etanol absolut dan larutan garam. Dengan
adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+), pada suhu -
20°C etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga
mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi.
Pada umumnya isoalsi DNA dengan metode konvensional yang dijelaskan
sebelumnya cukup melelahkan karena membutuhkan waktu hingga beberapa jam
bahkan sampai beberapa hari (Izzah,2014). Seiring berkembangnya ilmu
pengetahuan dan teknologi, metode isolasi DNA telah banyak dikembangkan dan
digunakan dalam sebuah penelitian. Salah satu metode yang mudah
pengerjaannya serta dapat menghasilkan DNA dengan kemurnian tinggi yaitu
dengan menggunakan metode kit komersial (Nishiguchi MK et al. 2002).
Metode kit komersial tidak hanya digunakan untuk mengisolasi DNA dari
produk makanan olahan tetapi juga dirancang untuk mengisolasi DNA yang
berasal dari sel darah putih, sel kultur jaringan hewan, jaringan tanaman dan juga
dari bakteri gram negatif serta gram positif (promega,2014). Keuntungan yang
dihasilkan dari metode isolasi DNA dengan menggunakan kit diantaranya
menghemat waktu selama proses isolasi karena dapat menghasilkan jumlah DNA
hanya beberapa menit saja, meningkatkan sensitifitas dan keunggulan PCR dalam
menganalisis karena pada proses isolasi menghasilkan DNA dengan kemurnian
yang tinggi, mengurangi seminimal mungkin jumah kontaminan pada DNA yang
dihasilkan, dan dapat digunakan untuk penelitian karena metode kit komersial
dapat memurnikan DNA yang berasal dari berbagai sumber (Roche,2007).
Setelah semua tahapan isolasi dilakukan, perlu dilakukan penilaian terhadap
kemurnian DNA yang dihasilkan. Penilaian dapat dilakukan salah satunya dengan
menggunakan Spektrofotometer UV, florometri dan elektroforesis agarosa.

14
Spektrofotometer UV dapat digunakan untuk menghitung kadar dan

kemurnian asam nukleat. Spekrofotometer ini dapat mengukur yang sangat kecil,
yaitu sekitar 0,2-2 µl tanpa harus mengencerkan sampel terlebih dahulu. Spektrum
atau panjang gelombang yang dapat digunakan berkisar dari 220-750 nm.
Pengukuran yang dilakukan oleh alat ini sangat cepat, yaitu hanya beberapa detik.
Namun, kontaminan dalam sampel asam nukleat dapat mempengaruhi akurasi
yang dihasilkan (kennedy dan Oswald,2011).
Pada sektrofotometer UV DNA, Untuk memperkirakan kemurnian asam
nukleat digunakan absorbansi pada 260 nm terhadap 280 nm (rasio A260/A280)
atau rasio absorbansi pada 260 nm terhadap 230 nm (rasio A260/A230) (Greene
and Rao V,1998;Kulkarni dan Pfeifer,2015). DNA dinyatakan murni jika
memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1,8-2,0
(Muladno,2002). Menurut Devereux dan Wilkinson (2004) rasio OD260/OD280
<1,8 menunjukan adanya kontaminasi fenol atau protein pada hasil ekstraksi.
Khosravina et al.,(2007) juga menjelaskan bahwa DNA dikatakan terkontaminasi
DNA jika memiliki rasio OD260/OD280 > 2,0.
2.5 DNA Mitokondria

Mitokondria adalah organel yang menghasilkan sebagian besar energi kimia
yang diperlukan oleh sel ekariotik. Mitokondria memiliki diameter sebesar 1-2
µm (Passarge,2007). Sel eukarotik rata-rata terdiri dari 103-104 salinan
mitokondria yaitu mencapai 25% volume sel. Setiap mitokondria dibungkus oleh
selubung yang terdiri dari sebuah membran bagian luar dan sebuah membran
bagian dalam. Membran bagian dalam membentuk invaginasi (lipatan-lipatan)
yang dikenal sebagai kristae dimana terdapat enzim-enzim oksidase. Membran
dalam juga memliki permukaan yang besar yang mengelilingi ruang matriks.
Matriks ini mengandung DNA, RNA, ribosom dan berbagai enzim yang berperan
dalam oksidasi zat-zat makanan. DNA yang terdapat pada mitokondria disebut
DNA mitkondria atau disingkat menjadi mtDNA (Koolman dan Roehm,2005).
Molekul mtDNA terdiri dari untai heavy (H) dan untai light (L). Pada untai H
terdapat lebih banyak basa purin daripada basa pirimidin, sehingga lebih berat dari
untai L. mtDNA memiliki laju mutasi yang sangat tinggi, sehingga dapat

15
dimanfaatkan untuk menentukan keragaman ginetik antar individu dalam suatu

populasi dan rekonstruksi migrasi suatu populasi.
Gambar 2.5. Struktur Mitokondria

(Sumber: Koolman dan Roehm,2005)
Umumnya, mitokondria terdiri dari 2-10 molekul DNA. mtDNA merupakan
DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler dengan ukuran genom mitokondria
hewan berkisar 14000-39000 pasang basa. Ukuran mtDNA relatif kecil
dibandingkan dengan ukuran DNA inti serta struktur organisasi mtDNA bersifat
stabil. Sehingga, mtDNA hewan memiliki jumlah gen dan ukuran yang sama,
yakni terdiri atas 13 gen yang menyandikan protein URF1, URF2, URF3, URF4,
URF5, URF6 ,URFA6L, URF4L, Cytochrom Oxidase unit I, Cytochrom Oxidase
unit II, Cytochrom Oxidase unit III, Cytochrom b dan ATPase 6 (terlibat dalam
respirasi sel), 2 gen menyandikan rRNA (12S dan 16S), 22 gen menyandikan
tRNA, beberapa daerah lain yang tidak menyandikan protein D-Loop (Control
Region) dan daerah intergenic (gambar 2.6) (Solihin,1994).
DNA mitokondria memiliki karakteristik yang mendukung dalam keperluan
analisis biologi dan keragaman genetik, yaitu DNA ini mempunyai copy number
yang tinggi sekitar 1000-10.000 dan berada di dalam sel. DNA mitokondria dapat
digunakan untuk analisa, meskipun jumlah sampel yang ditemukan terbatas,
mudah terdegradasi dan pada kondisi yang tidak memungkinkan untuk dilakukan
analisa terhadap DNA inti.

16
Gambar 2.6. Struktur mtDNA

(sumber : Passarge,2007)
DNA mitokondria hewan maupun manusia juga diturunkan secara maternal,
sehingga setiap individu pada garis keturunan ibu yang sama memiliki tipe DNA
mitokondria yang identik, hal inilah yang digunakan untuk penyelidikan kasus
orang hilang atau menentukan identitas seseorang dengan membandingkannya
dengan DNA mitokondria saudaranya yang segaris keturunan ibu (Yeni WH,et al
2004). Selain itu DNA mitokondria juga mampu mengcopy diri dalam jumlah
yang tinggi (menjadikan mudah diisolasi), ukuran yang relatif kecil sekitar 14 kb
sampai 39 kb sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh, dan
memiliki laju polimorfisme yang tinggi dengan laju evolusinya sekitar 5-10 kali
lebih cepat dari DNA inti (Solihin,1994).
2.6 Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi suatu campuran
berdasarkan pergerakan partikel koloid yang bermuatan dibawah pengaruh medan
listrik. Cara elektroforesis telah digunakan untuk analisa virus, asam nukleat,
enzim, protein, serta molekul-molekul organik dengan berat molekul rendah
seperti asam amino (Westermeier,2004).

17
Elektroforesis gel didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam

media penyanggah matriks stabil dibawah pengaruh medan listrik. Ada dua jenis
gel yang sering digunakan untuk proses elektroforesis yaitu gel agarose dan gel
poliakrilamid. Kedua gel ini digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen-fragmen DNA (Muladno,2010; Sudjadi,2008). Molekul
DNA termasuk senyawa yang bermuatan negatif. Sifat ini menjadikan molekul
DNA yang ditempatkan pada medan listrik akan bermigrasi menuju kutub positif.
Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh beberapa
faktor (Sambrook et al,2001), yaitu :
1. Ukuran molekul DNA
Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang DNA.
Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat
dibandingkan dengan fragmen DNA yang berukuran lebih besar.
Sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen berdasarkan
ukuran panjangnya.
2. Konsentrasi Agarosa
Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih
cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel
berkonsentrasi tinggi.
Tabel 2.2 Kisaran Umum Konsentrasi Agarosa
Konsentrasi Efisiensi Pemisahan

Agarosa (%) DNA (kb)
0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
(Sumber : Muladno,2010)
3. Konformasi DNA
Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama
akan bermigasi dengan kecepatan yang berbeda. DNA dalam bentuk

18
sirkular akan lebih cepat bermigrasi dibandingkan dengan DNA

bentuk linier.
4. Voltase yang Digunakan
Perpindahan molekul DNA terjadi dengan adanya arus listrik yang
mengalir dari kutub negatif menuju kutub positif. Semakin tinggi
voltase yang digunakan maka migrasi molekul DNA pun meningkat
secara tajam, sedangkan pada voltase rendah migrasi molekul DNA
lambat. Voltase yang tinggi mengakibatkan pemisahan DNA di dalam
gel tidak berjalan dengan baik. Penggunaan voltase yang ideal untuk
pemisahan molekul DNA berukuran lebih besar 2 kb adalah tidak
boleh lebih dari 5-8 volt per cm.
5. Etidium Bromida
Keberadaan etidium bromida didalam gel dapat mengakibatkan
pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul linier sebesar 15 %.
6. Komposisi Larutan Buffer
Proses migrasi DNA pada saat elekroforesis tidak lepas dari adanya
kekuatan ion. Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka
aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat.
Apabila larutan buffer berkekuatan ion tinggi dapat meningkatkan
panas sehingga aliran listrik menjadi sangat maksimal dan
memungkinkan gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami
denaturasi. Konsentrasi larutan buffer yang dapat dibuat yaitu TAE 1x
atau TBE 0,5x.
Sebelum proses elektroforesis, dilakukan pencampuran antara DNA dengan
loading dye. Loading dye terdiri dari glyserol, bromphenol blue, dan xylene
cyanol FF(Carson,2006). Selain itu, proses elektroforesis tidak terlepas dari proses
pewarnaan (staining). Pewarna yang sering digunakan adalah etidium bromida.
Etidium bromida akan menginterkalasi pada ikatan hidrogen DNA sehingga pita
DNA akan terlihat dibawah sinar ultraviolet (Yuwono,2009). Pita DNA yang
berpendar pada gel agarosa menunjukkan hasil positif bahwa terdapat DNA pada
setiap lajur. Larutan etidium bromida sangat berbahaya dan bersifat karsinogen.
Oleh karena itu, semua larutan yang mengandung etidium bromida harus

19
didekontaminasi sebelum dibuang (Muladno,2010; Sambrook dan Russel, 2001;

Gaffar, 2007).
2.7 PCR
Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction,PCR)adalah teknik

biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen DNA spesifik menjadi ribuan
sampai jutaan kopi sekuen DNA. PCR ini pertama kali dikembangkan pada tahun
1985 oleh Kary B. Mullis (Yusuf,2010). Teknik ini menggunakan metode
enzimatis yang diperantarai primer. Prinsip dasar PCR adalah sekuen DNA
spesifik diamplifikasi menjadi dua kopi selanjutnya menjadi empat kopi dan
seterusnya. Pelipatgandaan ini membutuhkan enzim spesifik yang dikenal dengan
polimerase. Polimerase adalah enzim yang mampu menggabungkan DNA cetakan
tunggal, membentuk untaian molekul DNA yang panjang. Enzim ini
membutuhkan primer serta DNA cetakan seperti nukleotida yang terdiri dari
empat basa yaitu Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) dan Guanine (G) (Gibbs
RA.1990).
Target PCR yaitu asam nukleat (DNA) untai ganda yang tidak diekstraksi
dari sel dan terdenaturasi menjadi asam nukleat berantai tunggal. Proses ini terjadi
pada mesin PCR meliputi tiga tahap utama yaitu pemisahan untai ganda DNA
(Denaturasi), penempelan primer (annealing) dan pemanjangan primer
(ekstensi). Proses yang dimulai dari denaturasi, penempelan dan esktensi disebut
sebagai satu siklus. Produk PCR dapat berlangsung melalui proses elektroforesis
dan digunakan untuk analisis lebih lanjut. Produk PCR dipisahkan dengan
elektroforesis gel yang diwarnai dengan etidium bromida dan divisualisasikan
dengan sinar ultraviolet (W.Widiwati Esti,2013). Reaksi PCR (amplifikasi)
dimulai dengan melakukan denaturasi DNA cetakan yang berantai ganda menjadi
rantai tunggal, kemudian suhu diturunkan sehingga primer akan menempel
(annealing) pada DNA cetakan yang berantai tunggal. Setelah proses annealing,
suhu dinaikkan kembali sehingga enzim polimerase melakukan proses polimerase
rantai DNA yang baru. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya sebagai
cetakan bagi reaksi polimerase berikutnya (Yuwono 2006).

20
Gambar 2.7. Simulasi Proses PCR

(Sumber: Yusuf,2010)
Metode PCR dibedakan menjadi dua yaitu PCR konvensional dan real time.
Analisis hasil amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional dilakukan
dengan visualisasi di agar elektroforesis. Sedangkan real time PCR, jumlah DNA
yang diamplifikasi dapat dideteksi dan diukur di setiap siklus proses PCR.
Perbandingan prosedur antara PCR konvensional dan real time PCR secara
singkat dapat dilihat pada gambar dibawah ini
Gambar 2.8. Perbandingan prosedur PCR Konvensional dan RT PCR

(Sumber:Yusuf,2010)

21
Kedua prosedur pada gambar di atas dimulai dengan isolasi RNA atau
DNA dilanjutkan dengan karakterisasi terhadap kemurniannya. Sampel
RNA murni diawali dengan tahap transkripsi balik (reverse transcriptase)
tetapi tahap ini tidak dilakukan apabila sampel berupa DNA murni. Jumlah
amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional divisualisasikan dengan
menggunakan agar elektroforesis. Penandaan fragmen DNA dengan
fluorescent dye dan intensitas pita DNA dapat diukur dengan menggunakan
mesin digital densitometri. Hal ini berbeda pada PCR real time, jumlah
DNA diukur di setiap siklus proses amplifikasi PCR terutama pada fase
eksponensial. Deteksi akumulasi amplifikasi DNA pada PCR real time
menggunakan probe DNA fluoresen. Walaupun demikian, analisis data
hasil kedua prosedur tersebut baik PCR konvensional maupun real time
memerlukan normalisasi data terhadap acuan yang diketahui untuk
menentukan kualitas awal ekspresi target gen (Fraga et al. 2008).
2.7.1 Komponen PCR

Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah
template DNA, sepasang primer oligonukletida, DNA polimerse,
deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan larutan buffer (Yusuf,2010;
Muladno,2010; Gaffar,2007; Sulistyaningsih, 2007).
1. Template DNA
Template DNA adalah moleul DNA untai ganda yang megandung
sequen target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA bukan
merupakan faktor utama keberhasilan PCR, berapapun panjangnya
jika tidak mengandung seqens yang diinginkan maka tidak akan
berhasil proses suatu PCR, namun sebaliknya jika ukuran DNA tidak
terlalu panjang tapi mengandung sekuens yang dinginkan maka PCR
akan berhasil (Sulistyaningsih, 2007).
DNA cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105-106
molekul. Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan
kuantitas atau konsentrasi (Yusuf,2010). Jika konsentrasi terlalu
rendah maka primer mungkin tidak dapat menemukan target dan jika
konsentrasi terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan

22
mispriming. Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian template

karena akan mempengaruhi hasil reaksi (Sulistyaningsih, 2007)
2. Primer
Primer PCR adalah oligodeoksiribonukleotida pendek atau
oligomer yang dirancang untuk melengkapi urutan akhir sekuen dari
amplikon target PCR dan digunakan untuk mengawali sintesis rantai
DNA. Panjang basa DNA primer umumnya 15-25 nukleotida dan
mempunyai 50-60% kandungan Guanine ditambah Cytocine. Primer
yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang
mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA
cetakan pada ujung 5‟-fosfat dan oligonukleotida yang kedua identik
dengan sekuen pada ujung 3‟-OH rantai DNA cetakan yang lain.
Masing-masing dari dua primer PCR melengkapi untaian tunggal yang
berbeda dari target untaian ganda. Untuk mendapatkan skrining
sekuen yang potensial dan homolog, rancangan primer ditetapkan
dengan menggunakan perangkat lunak seperti Oligo (National
Biosciences, Plymouth, NC) atau situs pencarian online seperti
BLAST (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Namun demikian,
primer PCR juga dapat homopolimer misalnya oligo (dT) yang sering
digunakan untuk mengawali proses PCR RNA (Yusuf.2010).
Spesifisitas PCR sangat tergantung pada suhu melting (Tm) primer,
yaitu suhu dimana suhu dimana separuh jumlah primer annealing
pada Template. Tm kedua primer serupa (dalam 2-4°C) dan diatas
60°C. Konsentrasi primer biasanya optimal pad 0,1-0,5 µM.
Konsentrasi primer yang terlalu tinggi akan menyebabkan
mispriming (penempelan pada tempat yang tidak spesifik) dan
akumulasi produk non spesifik serta meningkatkan kemungkinan
terbentuknya primer-dimer. Sebaliknya, bila konsentrasi primer terlalu
sedikit maka PCR menjadi tidak efisien sehingga hasilnya rendah
(Sulistyaningsih, 2007).

23
3. Taq DNA polymerase

Taq DNA polimerase adalah suatu enzim yang dihasilkan dari
bakteri Thermus aquaticus yang sangat tahan panas. Enzim ini
memungkinkan reaksi amplifikasi terbentuk pada suhu yang lebih
tinggi sehingga reaksi PCR dapat dilakukan secara otomatis karena
penambahan enzim tidak diperlukan di setiap siklus PCR. Walaupun
demikian, Taq DNA polimerase dari T. aquaticus tidak dapat
memanfaatkan RNA sebagai cetakan dan memiliki aktivitas
transkripsi balik yang rendah. Oleh karena itu, digunakan DNA
polimerase yang lain, yaitu Taq DNA polimerase dari Thermus
thermophilus (Tth DNA polymerase) yang mempunyai aktivitas DNA
polimerase yang lebih tinggi untuk proses transkripsi balik RNA.
Enzim ini dapat digunakan untuk melakukan RT-PCR molekul RNA
sampai ukuran 1000 pasangan basa (bp, base pairs) (Yuwono 2006).
Enzim DNA polimerase berfungsi sebagai katalis untuk reaksi
polimerisasi DNA. Polimerisasi adalah suatu molekul komplek yang
memiliki tiga aktivitas diantaranya sebagai aktivitas polimerise dari
ujung 5‟-3‟ dan bisa juga dari 3‟-5‟ (Handoyo,et al.,2001). Enzim
Polimerisasi DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari
bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini
bersifat termostabil sampai temperatur 95°C. Aktivitas polimerisasi
DNA bergantung dari jenisnya dan darimana bakteri tersebut diisolasi.
Penggunaan jenis polimerisasi DNA berkaitan erat dengan buffer PCR
yang dipakai (Handoyo,et al.,2001).
4. Deoxynucleotida Triphosphate (dNTP)
dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri dari dATP
(deoksiadenosintrifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP
(deoksisitidintrifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam
proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang
diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada
gugus –OH pada ujung 3‟ dari primer yang membentuk untai baru

24
yang komplementer dengan untai DNA template (Handoyo et al,

2001).
5. Larutan buffer
Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu.
Oleh karena itu, untuk melakukan proses PCR diperlukan Bufer PCR.
Fungsi buffer pada PCR adalah untuk menjamin ph medium. Selain
buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari
MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi
menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini
akan meningkatkan interaksi primer dengan template yang
membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam
proses PCR, konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan
perolehan proses. Pada umumnya, buffer PCR sudah mengandung
senyawa MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan
mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan
(Handoyo et al,2001).
2.7.2 Tahapan PCR

Tahapan utama dalam PCR ada tiga yaitu :
1. Denaturasi DNA template
Pada tahap ini, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai
tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi
menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang
komplemen. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 95°C selama
3 menit untuk meyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin
dilipatgandakan jumlahnya benar-benar telah terdenaturasi menjadi
untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya, waktu yang diperlukan
hanya 30 detik pada suhu 95°C atau 15 detik pada suhu 97°C.
(Harisah,2017)
Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sequen DNA target. Jika DNA
target kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi, hal ini
dikarenakan ikatan hidrogen pada G-C lebih banyak dibandingkan

25
dengan ikatan A-T. Selain itu, suhu denaturasi juga tidak boleh terlalu
tinggi dan waktu denaturasi tidak boleh terlalu lama karena dapat
mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq
polymerase (Harisah,2017)
2. Penempelan (annealing)
Primer akan menuju daerah yang spesifik, dimana daerah tersebut
memiliki komplemen dengan primernya. Pada proses annealing ini,
ikatan hidrogen akan terbentuk. Selanjutnya, enzim Taq DNA
Polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan
menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali. Proses ini biasanya
dilakukan pada suhu 50-60°C. Spesifisitas PCR sangat tergantung
pada suhu melting (Tm) primer, yaitu suhu dimana separuh jumlah
primer menempel pada template. Temperatur penempelan yang
digunakan biasanya 5°C dibawah TM. Dimana formula untuk
menghitung Tm= 4°C(G+C) + 2 °C (A+T). Semakin panjang ukuran
primer, semakin tinggi temperaturnya.
3. Pemanjangan (extension)
Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan
pada sisi 3‟nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan
template oleh DNA olimerase. Umumnya reaksi polimerase
(ekstension) atau perpanjangan rantai, terjadi pada suhu 72 °C karena
merupakan suhu optimum Taq polimerase. Kecepatan penyusunan
nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72°C diperkirakan antara
35 sampai 100 nukleotida per detik, bergantung pada buffer, pH,
konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian, untuk
produk PCR sepanjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih
cukup untuk tahap pemanjangan primer ini.
2.8 RT-PCR
Real Time PCR adalah suatu metode analisis yang dikembangkan dari
reaksi PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR (juga dikenal sebagai
quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR atau qPCR) atau kinetic

26
polymerase chain reaction) adalah suatu tehnik pengerjaan PCR di laboratorium

untuk mengamplifikasi sekaligus mengkuantifikasi jumlah target molekul DNA
hasil amplifikasi tersebut. Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) tepat
untuk berbagai aplikasi seperti analisis ekspresi gen, penentuan jumlah virus,
deteksi organisme yang mengalami mutasi genetik, diskriminasi alel dan genotipe
single nucleotide polymorphism (SNP). Penggunaan probe yang spesifik
membantu peningkatan spesifisitas pada pengujian Real Time PCR jika
dibandingkan dengan pengujian PCR konvensional (Chantratita et al. 2008).
Teknik ini sangat sensitif yang memungkinkan amplifikasi terjadi secara
bersama-sama serta kuantitas sekuens asam nukleat dapat diketahui. Disamping
memiliki sensitivitas lebih tinggi, kelebihan pengujian Real Time PCR jika
dibandingkan dengan PCR konvensional adalah lebih dinamis, risiko kontaminasi
silang lebih sedikit, kemampuan aplikasi penggunaannya untuk pengujian lebih
banyak (Black et al. 2002).
Instrumen Real Time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur
peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan untai
ganda DNA. Alat ini dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga
hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang
sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva
amplifikasi Real Time PCR (Gambar 2.8). Ada tiga fasa utama dalam kurva
amplifikasi Real Time PCR yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan
fasa plateau atau stabil (Harisah,2017).
Prinsip kerja Real Time PCR adalah mendeteksi dan mengkuantifikasi
reporter fluorescent. Sinyal fluorescent akan meningkat seiring dengan
bertambahnya amplifikasi DNA PCR dalam reaksi. Reaksi selama fase
eksponensial dapat dipantau dengan mencatat jumlah emisi fluorescent pada
setiap siklus. Peningkatan hasil amplifikasi PCR pada fase eksponensial
berhubungan dengan jumlah inisiasi target gen. Makin tinggi tingkat ekspresi
target gen maka deteksi emisi fluorescent makin cepat terjadi (Pardal 2010).
Kuantitas urutan DNA target dicapai dengan menentukan jumlah siklus
amplifikasi. Jumlah siklus amplifikasi diperlukan untuk menghasilkan produk
PCR berdasarkan fluoresensi di awal fase eksponensial PCR serta untuk melewati

27
garis ambang fluoresensi/siklus treshold (Ct). Jumlah siklus yang diperlukan

untuk mencapai ambang batas disebut Ct. Siklus Ct adalah prinsip dasar dari Real
Time PCR dan sebagai bagian yang sangat penting untuk memperoleh data yang
akurat. Nilai Ct Real Time PCRsangat berkorelasi dengan kuantitas urutan DNA
target (Giglio et al. 2003). Apabila kuantitas urutan DNA target tinggi di awal
reaksi, nilai Ct akan lebih cepat diketahui. Namun demikian, nilai Ct akan lebih
sering ditemukan pada fase eksponesial di setiap siklus amplifikasi PCR. Hal ini
yang menjadi alasan utama bahwa nilai Ct lebih mampu mengukur jumlah
amplifikasi DNA target dari awal reaksi (Yusuf,2010).
Gambar 2.8. Kurva RT PCR

(Sumber : bio.rad)
Dalam Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) umumnya terdapat
tiga jenis pelacak berfluoresensi yang digunakan diantarnya fluorescent DNA
binding dyes, fluorescent probes, dan fluorescent primers. Fluorescent DNA-
binding dyes merupakan jenis pelacak yang menghasilkan warna ketika terikat
untai ganda pada DNA (sdDNA) contohnya seperti SYBR Green (Ma et al,.2006).
Sedangkan fluorescent probe merupakan suatu pelacak berbasis probe yang
umumnya adalah potongan DNA atau RNA yang diberi label nukleotida yang
32
mengandung P atau nukleotida yang berlabel fluoresen (Muray e al.,2006),
contohnya seperti Taqman probe, scorpions, dan molecular beacons.

28
2.8.1 Pewarna Fluoresensi

a. SYBR Green
SYBR Green merupakan suatu senyawa berfluorescent yang
biasa digunakaan untuk mewarnai DNA karena memiliki kemampuan
untuk interkalat atau menyisip diantara basa-basa nitrogen pada DNA.
Di dalam suatu larutan biasa, SYBR Green hanya akan menghasilkan
fluoresensi yang kecil, namun ketika dicampurkan dengan DNA untai
ganda, maka fluoresensinya akan meningkat seiring dengan
peningkatan konsentrasi DNA (Arya,Manit et al.,2005). Prinsip dari
SYBR Greenadalah pewarna fluoresensi akan mengikat bagian minor
dari untai ganda DNA sehingga menghasilkan pendaraan warna hijau
pada akhir fase extension selama proses Real Time PCR berlangsung
(Shipley,2007).
Gambar 2.9. Prinsip SYBR Green dalam mendeteksi produk PCR

pada Real Time PCR
(Sumber : Arya,Manit et al.,2005)
SYBR Greenumumnya digunakan dalam singlepex pada Real
Time PCR yang menggunakan satu DNA Target dan sepasang primer.
Intensitas fluoresensi yang akan dihitung dalam analisis kualitatif
maupun kuantitatif pada qRT PCR. Pengukuran fluoresensi dilakukan
diakhir proses elongation (pemanjangan) untuk memantau
peningkatan jumlah DNA(Arya,Manit et al.,2005).
Keuntungan dari penggunaa pewarna SYBR Greenadalah relatif
mudah, stabil dan murah karena dapat digunakan untuk sepasang
primer untuk target apapun serta tidak memerlukan probe yang cukup

29
mahal dalam pembuatannya. Namun, SYBR Green memiliki

kelemahan, yaitu SYBR Green untuk mengikat DNA untai ganda pada
bagian tidak berspesifik sehingga primer-dimer juga akan diikat oleh
SYBR Green. Namun, produk tidak spesifik dapat dianalisis
keberadaannya dalam analisis melting curve (Valasek MA,et al.2005)
b. Hydrolisis Probe
Hydrolisis probe menggunakan oligonukleotida spesifik
berkomplemen dengan DNA target yang disebut probe. Probe dilabeli
oleh dua molekul, yaitu reporter pada ujung 5‟ probe yang merupakan
pewarna fluoresensi dan quencher pada ujung 3‟ probe yang
merupakan molekul penerima sinyal fluoresensi. Hydrolisis Probe
memiliki prinsip kerja, yaitu saat probe belum berkomplemen dengan
target, molekul reporter akan mengeksitasi sinyal fluoresensi ke
molekul quencher. Karena jarak antara kedua molekul berdekatan.
Probe akan berkomplemen dengan DNA target saat mencapai suhu
annealing lalu mekanisme eksitasi sinyal fluoresnsi dari reporter ke
quencher terhenti karena jarak kedua molekul berjauhan. DNA
polimerase akan mengelongasi DNA target sampai DNA polimerase
dan probe berdekatan maka 5‟ nuklease yang terdapat pada DNA
polymerase akan menghidrolisis molekul reporter sehingga emisi
sinyal fluoresensi dapat tertangkap oleh detektor pada real time PCR
(Shipley,2007).
Tabel 2.3 Perbandingan Menggunakan Deteksi SYBR Green dan

Deteksi Hydrolisis Probe pada PCR
SYBR Green Hydrolisis Probe
Ease of use ++ +
Esae of assay design ++ +
Cost efficiency ++ +
Spsificity/robustness + ++
Design flexibility + ++
Multiplexing capability - +
(sumber : Shipley,2007).

30
2.9 Bakso
Bakso adalah jenis makanan yang berupa bola-bola yang terbuat dari daging
dan tepung. Makanan ini biasanya disajikan dengan kuah dan mie. Bahan-bahan
yang dibutuhkan dalam pembuatan bakso adalah daging, bahan perekat, bumbu
dan es batu atau air es. Biasanya jenis bakso di masyarakat pada umumnya diikuti
dengan nama jenis bahan seperti bakso ayam, bakso ikan dan bakso sapi atau
bakso daging (Wibowo,2009).
Menurut Astawan (2004), kualitas bakso sangat ditentukan oleh kualitas
daging, jenis tepung yang digunakan, perbandingan banyaknya daging dan tepung
yang digunakan untuk membuat adonan, dan pemakaian jenis bahan tambahan
yang digunakan. Bakso yang berkualitas baik dapat dilihat dari tekstur, warna dan
rasa. Teksturnya yang halus, kompak, kenyal dan empuk. Halus yaitu permukaan
isinya rata, seragam dan serat daging tidak tampak. Bakso daging sapi telah
dikenal dan banyak dikonsumsi oleh berbagai kalangan masyarakat Indonesia.
Kandungan gizi bakso dapat dilihat pada tabel berikut
Tabel 2.4 Kandungan Gizi Bakso
(Sumber :Wibowo,2009)
Bakso merupakan produk daging olahan yang bercita rasa gurih dan sedap
yang terbuat dari daging sapi atau ayam. Namun, akhir-akhir ini sering di
beritakan di media masa ada adanya cemaran daging babi dalam produk bakso
sapi. Hal ini berkaitan dengan tingginya harga daging sapi bila di bandingkan
dengan harga daging babi. Para penjual bakso yang tidak bertanggung jawab
melakukan pengoplosan daging sapi dengan daging babi untuk meningkatkan
keuntungan yang didapat.

31
Beberapa penelitian telah dilakukan di beberapa daerah untuk menganalisa

apakah ada cemaran daging babi dalam bakso sapi diantaranya Margawanti dan
Ridwan (2010) telah maelakkan penguian cemaran daging babi pada bakso sapi
dan menunjukan hasil yang positif. Erwanto et al (2014) telah melakukan
pengujian terhadap 20 sampel bakso yang berada di yogyakarta dengan tehnik
Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length polymorphism (PCR-
RFLP), dimana menunjukkan hasil positif pada 9 sampel uji. Selain itu, juga
tedapat kasus di Bogor, pengoplosan daging celeng (babi) dengan daging ayam
yang dibuat dalam bentuk cilok/bakso dan di jual dengan harga yang murah
(Haryudi,2017).

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Obat dan Pangan

Halal, Laboratorium Penelitian II, Laboratorium Kimia Analisis dan Laboratorium
Biokimia/Patologi Klinis Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas
Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.1.2 Waktu
Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan dari bulan Februari 2018 hingga

Agustus 2018.
3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Real Time PCR (LightCycler® 480-Roche), Multiwell Plate 96 (Roche®),

Sealing Foil (Roche), Tabung Mikrosentrifuge volume 1,5 (Biogenik), Mikropipet
5-10µl (Biorad), Mikropipet 20-20µl (Biorad), Mikropipet 100-1000µl (Biorad),
Mikrotip 10 µl, 20 µl, dan 1000 µl (Genfollower), Spektrofotometri UV DNA
(DeNovix®), Gel Documentation (AE-6933 ATTO), satu set alat Elektroforesis
Agarosa (Biorad), Sentrifugator (5417R-Eppendrof), Vortex, Digital Waterbath
(SB-100 Eyela), Freezer, Autoklaf, Timbangan Analitik, Spatula, Batang
pengaduk, Gelas Beaker, Kertas perkamen, Kaca arloji, Pipet tetes, Pisau Steril,
Lumpang dan Alu.
3.2.2 Bahan
Daging sapi segar, daging babi segar, 7 produk bakso sapi yang beredar
disekitar kampus UIN Jakarta, satu set kit komersial Wizard®Genomic DNA
Purification Kit (meliputi: Nucleic Lysis Solution, Protein Precipitation Solution,
DNA Rehydration Solution, RNase Solution), Aquabidest (Ikapharmindo), Etanol

33
absolut (Merck), Isopropanol (Merck), Etidium Bromida 10 mg/ml (Bio Basic

Inc), Agarosa (Fermentas), DNA Ladder 100 bp (Kappa Fast), SYBR
GreenIMaster (LC 480-Roche), dH2O (PCR Grade-Roche) dan Primer (Tabel
3.1).
Tabel 3.1 Susunan Basa Primer
Nama Primer Runutan Basa

Sapi Forward 5‟-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3‟
Reverse 5‟-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3‟
Babi Forward 5‟-CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3‟
Reverse 5‟-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3‟
(Sumber : Tanabe S et al.,2007)
3.3 Tahapan Penelitian
1. Pengumpulan Sampel
2. Isolasi DNA
3. Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV
4. Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Elektoforesis Gel
5. Amplifikasi DNA dengan Menggunakan Real Time PCR
3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Pengumpulan Sampel
Pengumpulan sampel dilakukan terhadap 7 sampel bakso sapi dengan

produsen berbeda yang beredar di Kecamatan Ciputat, 7 sampel ini dipilih secara
random dari produsen tradisional yang menjajakan produknya dengan berkeliling
di sekitar kampus UIN Syarif Hidayatullah. Sampel dari produsen tradisional ini
didapatkan dalam keadaan sudah dihidangkan.
3.4.2 Isolasi DNA

Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard®Genomic
DNA Purification Kit (Promega)
1. Preparasi jaringan hewan dan pelisisan Sel

34
Masing-masing daging sapi segar, daging babi dan sampel bakso sapi
dihancurkan sampai halus menggunakan pisau steril, lumpang dan
blender. Daging yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 20 mg.
Masing-masing daging dan sampel dimasukkan kedalam
mikrosentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 600 µl Nucleic Lysis
Solution. Masing-masing campuran tersebut dihomogenkan selama 15
detik kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 30 menit
2. Pelisisan Sel dan Presipitasi Protein
Masing-masing campuran yang sudah diinkubasi ditambahkan 3 µl
larutan RNAse lalu diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 30
menit. Selanjutnya ditambahkan 200 µl Protein Presipitation Solution
dan di vortex, kemudian didiamkan dalam ice selama 5 menit lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 16.000 rpm selama 4 menit.
3. Presipitasi dan Rehidrasi DNA
Endapan dan supernatan yang terbentuk dipisahkan lalu ditambahkan
600 µl isopropanol kedalam supernatan tersebut. Campuran dikocok
dan disentrifugasi dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit.
Supernatan yang terbentuk dibuang lalu ditambahkan 600 µl etanol 70
%. Campuran dikocok dan disentrifuse kembali dengan kecepatan
16.000 rpm selama 1 menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan
dengan etanol lalu endapan di hairdry selama 15 menit. Kemudian
ditambahakan 100 µl Rehidration DNA Solution dan didiamkan
selama 1 jam pada suhu 65°C atau selama semalam pada suhu 4°C.
3.4.3 Analisis Isolat DNA

3.4.3.1 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV
DNA yang sudah diisolasi dianalisis menggunakan spektrofotometri UV

DNA (DeNovix®). Proses analisis dilakukan dengan cara pada layar
spektrofotometri UV DNA (DeNovix®) dipilih Nucleic Acid. Kemudian Sample
Port dibersihkan menggunakan tisu steril. Siapkan DNA Rehidration Solution
yang digunakan sebagai blanko sebanyak 1 µl lalu ditaruh diatas Sample Port dan
dianalisis. Sample Port dibersihkan kembali mengunakan tisu steril. Identitas

35
sampel dimasukkan kedalam kolom simple ID dan sebanyak 1 µl DNA sampel

tersebut ditaruh diatas Sample Port. Analisis dilakukan untuk mengukur
kemurnian dan kuantitas DNA dengan menekan tombol “Measure”. DNA
dianalisis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Tunggu beberapa detik
akan muncul data kemurnian dan kuantitas DNA.
3.4.3.2 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Elektroforesis Gel

a. Pembuatan Buffer Elektroforesis TAE 1x, 1 liter (Biorad,2012)
Sebanyak 20 ml TAE 50x dimasukkan kedalam labu ukur 1000 ml
dan ditambahkan aquabidest sampai tanda batas. Larutan tersebut
kemudian dihomogenkan.
b. Pembuatan Gel Agarosa 1 % (Sambrook et al.,2001)
Sebanyak 2,5 g Agarosa dilarutkan dalam 250 mL TAE 1x di dalam
erlenmeyer. Erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil, kemudian
dipanaskan diatas hot plate sampai larutan menjadi bening dan
mendidih. Larutan agarosa didiamkan hingga suhu 60°C. Larutan
dituangkan pada gel caster dan comb yang disiapkan untuk membuat
well (sumur), yang sebelumnya telah diberi 1µL Etidium bromida,
lalu larutan agarose diaduk hingga homogen dan dipastikan tidak
terdapat gumpalan. Larutan agarosa dibiarkan hingga mengeras.
Setelah gel mengeras dan membentuk agar, gel diletakkan di chamber
elektrophoresis dengan posisi well pada muatan negatif (warna
hitam). Kemudian buffer TAE 1x dituangkan hingga gel terendam
dalam chamber elektrophoresis namun tidak melebihi garis batas
maksimum buffer.
c. Loading Sampel (Sambrook et al.,2001)
Plastic wrap direkatkan pada wadah mendatar sebagai tempat
melakukan Pencampuran sampel yang akan dimasukkan kedalam well
gel. Masing masing sebanyak 5 µl isolat DNA dipipet dan ditaruh
diatas plastik wrap. Kemudian masing-masingnya ditambahkan 1 µl
Loading dye dan dihomogenkan dengan menaikturunkan mikropipet.
Masing-masing campuran tersebut dipipet dan dimasukkan kedalam

36
well agarose yang telah dibuat sebelumnya dengan urutan dari ke

kanan adalah 2 well DNA daging sapi dengan primer sapi , loading
dye, 2 well DNA daging babi dengan primer babi.
d. Running Sample (Sambrook et al.,2001)
Chamber elektroforesis yang telah mengandung gel agarosa DNA,
dan buffer TAE 1x kemudian ditutup rapat dan kabel chamber
dihubungkan dengan power supply. Kabel merah (muatan positif)
dipasang pada lubang merah dan kabel hitam (muatan negatif)
dipasangkan pada lubang hitam. Running sampel dilakukan selama 30
menit dengan voltase 90 volt 400 mA.
e. Dokumentasi Gel Agarosa (Atto,2009)
Gel agarosa yang telah mengandung DNA elektroforesis kemudian
diletakkan pada Gel Doc untuk visualisasi isolat DNA. Tombol ON
ditekan pada Saver, Printer dan Transluminator. Stand by LED dipilih
untuk melihat posisi gel. Panjang gelomang dipilih, kemudian
exposure Time. Focus dan aperture cahaya diatur. Expose UV , Freeze
ditekan dan Save. Data gambar yang akan digunakan sebagai
dokumentasi dicetak dengan menekan tombol Print.
3.4.4 Amplifikasi DNA dengan Menggunakan Real Time PCR

1. Pembuatan Primer 50 µM dari larutan induk 100 µM
Sebanyak 50 µl larutan induk primer 100 µM dimasukkan kedalam
Mikrosentifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 50 µl
aquadest kedalam tube tersebut. Larutan tersebut dihomogenkan
dengan menaik turunkan pegas pada mikropipet.
2. Pembuatan Primer 10 µM dari seri larutan induk 50 µM
3. Pembuatan Primer 5 µM dari seri larutan induk 50 µM

37

4. Pembuatan SYBR Green Mastermix
Mastermix dibuat dengan volume total 20 µl yang terdiri dari 5 µl
DNA Tamplate, 3 µl Aquabidest; 1 µl primer forward 10 µM; 1 µl
primer reverse 10 µM; dan 10 µL SYBR Green I master (enzim Taq
DNA Polymerase, SYBR Green 1, dNTP mix,dan 6,4 mM MgCl2).
5. Loading Sample dan SYBR Green Mastermix kedalam Multiwell
Plate
Sebanyak 5 µL DNA yang akan diuji dan 15 µL Mastermix
dimasukkan kedalam multiwell plate pada well yang diinginkan.
Campuran dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas mikropipet
secara perlahan. Multiwell Plate kemudian dengan Sealing foil.
6. Pengaturan program proses Amplifikasi (Roche, 2005 dengan
modifikasi)
Pengaturan program Light Cycler480 Real Time PCR yang akan
digunakan untuk menentukan suhu amplifikasi yang dapt
menghasilkan amplifikasi DNA yang baik. Suhu untuk proses
amplifikasi ditentukan dengan rentang besar suhu yaitu pada suhu
50°C, 55°C, 60°C, 65 °C dan 68°C ntuk primer sapi dan suhu 60 °C
dan 65°C untuk primer babi. Pengaturan program untuk optimasi
amplifikasi dilakukan sebagai berikut :
Tabel 3.2. Pengaturan Program Untuk Optimasi Suhu Amplifikasi Primer
Sapi dengan Modifikasi (Izzah.2014)
Analisis dengan Primer Sapi
Proses Jumlah siklus Suhu Waktu
Pre Incubation 1 siklus 95°C 10 menit
Amplification
95°C 10 detik
30 siklus
50 °C 20 detik
72 °C 30 detik
Melting Curve
1 siklus
Analysis 95 °C 5 detik

38
60 °C 1 menit
97°C/5°C -
Cooling 1 siklus 40°C 10 detik
Tabel 3.3 Pengaturan Program Untuk Optimasi Amplifikasi Primer Babi
dengan Modifikasi (Izzah.2014)
Analisis dengan Primer Babi
Proses Jumlah siklus Suhu Waktu
Pre Incubation 1 siklus 95°C 10 menit
Amplification
95°C 10 detik
30 siklus
60 °C 20 detik
72 °C 30 detik
Melting Curve
Analysis 95 °C 5 detik
1 siklus
60 °C 1 menit
97°C/5°C -
Cooling 1 siklus 40°C 10 detik
Tabel 3.4. Pengaturan Program PCR Konvensional
Analisis dengan Primer Sapi dan Primer Babi

Proses Suhu Waktu
Pre
95°C 10 detik
Incubation
Annealing 95°C 15 detik
60°C 1 menit
72°C 30 detik
Elongation 72 °C 1 menit

39

BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini dilakukan analisis cemaran daging babi pada produk
bakso sapi yang beredar di wilayah Ciputat dengan mengunakan Real Time
Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dengan metode SYBR Green. Hasil
analisis didapat melalui beberapa tahap diantaranya isolasi DNA, pengukuran
konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi, amplifikasi DNA dan analisis DNA
hasil amplifikasi.
4.1 Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan terhadap daging sapi, daging babi, dan 7 sampel
produk bakso sapi yang beredar di wilayah kelurahan Ciputat menggunakan
Wizard Genomic DNA Prification Kit Promega. Wizard Genomic DNA Prification
Kit dirancang untuk mengisolasi DNA dari leukosit, jaringan hewan dan
tumbuhan, yeast, bakteri gram porsitif dan bakteri gram negatif. Prinsip isolasi
DNA menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit yaitu lisis, ekstraksi,
homogenisasi, presipitasi protein dan rehidrasi DNA (lampiran 2).
Tahap pertama adalah preparasi jaringan hewan. Preparasi jaringn hewan
dilakukan dengan mengambil tiga cuplikan dari 1 sampel pada sisi yang berbeda.
Setiap cuplikan tersebut dihancurkan menggunakan lumpang dan alu lalu
ditimbang masing-masing 20 mg. Pengambilan cuplikan ini dilakukan pada
daging sapi, daging babi dan ketujuh sampel bakso sapi. Tahap kedua adalah
pelisisan membran sel dan nukleus dengan menggunakan Nucleic Lysis Solution
(NLS) pada daging dan bakso sapi yang telah dihancurkan. Kandungan dalam
Nucleic Lysis Solution (NLS) adalah Etilendiamin tetra asetat (EDTA) atau
sodium deodesil sulfat (SDS) yang bekerja dengan cara mengganggu ikatan
kimia pada membran tersebut (Nurfadila, 2015). Daging dan bakso sapi yang
sudah ditambahkan dengan NLS, kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 30
menit. Hal ini bertujuan untuk mengoptimalkan proses pelisisan membran sel dan
nukleus. Tahap ketiga adalah degradasi RNA dengan menggunakan RNAse.
RNAse merupakan enzim yang dapat mendegradasi RNA sehingga DNA menjadi

41
murni atau tidak mengandung RNA serta mempermudah dalam proses isolasi
DNA (Radji,2011). Setelah ditambahkan RNAse kemudian dilakukan inkubasi
pada suhu 37°C yang bertujuan untuk mengoptimalkan proses pendegradasian
RNA oleh RNAse (Nurfadila, 2015).
Tahap keempat adalah presipitasi atau pengendapan protein dengan
menambahkan Protein Presipitation Solution (PPS). Kandungan Protein
Presipitation Solution (PPS) biasanya terdiri dari garam netral seperti amonium
sulfat pelarut organik seperti etanol atau aseton dan zat pengendap lainnya seperti
asam triokloroasetat. Mekanisme pengendapan protein oleh Protein Presipitation
Solution (PPS) dengan menurunkan kelarutan protein (Ngili,2013). Tahap kelima
adalah presipitasi dan purifikasi DNA yang dilakukan dengan cara menambahkan
isopropanol dan etanol 70%. Isopropanol berfungsi untuk memurnikan molekul
DNA atau mengendapkan DNA dan memisahkan dari garam-garam mineral sisa
Nucleic Lysis Solution (NLS), sedangkan etanol 70% digunakan untuk
membersihkan isopropanol. Pemurnian ini merupakan tahap paling penting dalam
isolasi DNA karena bila ada kontaminasi selain DNA maka hasil isolasi DNA
yang dilakukan dianggap gagal. Kontaminasi ini dapat menurunkan kualitas DNA
hasil isolasi dan mengakibatkan data yang didapat tidak valid (Faatih,2009).
Tahap terakhir adalah rehidrasi DNA menggunakan DNA Rehidration Solution
yang berfungsi untuk melarutkan molekul DNA. Selanjutnya DNA tersebut
disimpan di suhu 4°C.
4.2 Hasil Analisis Isolat DNA

4.2.1 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV
Isolat DNA yang dihasilkan dari tahapan kerja diatas, didapatkan
konsentrasi dan kemurniannya menggunakan spektrofotometri DNA (DeNovix).
Pengukuran kuantitas (konsentrasi) dan kualitas (kemurnian) didasarkan pada
prinsip penyinaran sinar ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein
dalam larutan (Muladno,2010). Pengukuran isolat DNA dilakukan pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm, sedangkan untuk tingkat kemurniannya dapat
dihitung dari rasio antara nilai A260 dan A280 (Muladno,2010). Hasil pengukuran
terlihat pada tabel 4.1 dibawah ini:

42
Tabel 4.1. Hasil Konsentrasi dan Kemurnian DNA

Konsentrasi Kemurnian
No. Sampel
(µg/ml) (A260/280)
1. Daging sapi 28,563 1,64
2. Daging babi 76,635 1,50
3. Sampel 1 88,943 1,80
4. Sampel 2 8,204 1,67
5. Sampel 3 63,191 1,83
6. Sampel 4 21,315 1,73
7. Sampel 5 30,662 1,64
8. Sampel 6 12,925 1,56
9. Sampel 7 25,410 1,60
Berdasarkan hasil pengukuran konsentrasi isolat DNA yang terlihat pada

tabel 4.1 konsentrasi yang dihasilkan dari masing-masing sampel bervariasi
antara 8,205 ng/µl - 88,943 ng/µl. Berdasarkan hasil isolasi dan konsentrasi DNA,
konsentrasi DNA tertinggi terdapat pada sampel 1 yaitu sebesar 88,943 ng/µl
sedangkan konsentrasi DNA terendah terdapat pada sampel 2 yaitu sebesar 8,204
ng/µl. Dengan demikian, konsentrasi DNA yang didapatkan dari tiap sampel
masih dapat dilanjutkan ke tahap selanjutnya yaitu tahap amplifikasi DNA
menggunakan real time PCR karena batas konsentrasi minimal untuk melanjutkan
real time PCR adalah 0,03-0,80 pg (Lopez-Andreo M et al,2005).
Perbandingan antara panjang gelombang 260 dan 280 nm merupakan nilai
kemurnian DNA. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada panjang
gelombang 260 nm, sedangkan untuk protein akan menyerap cahaya UV pada
panjang gelombang 280 nm, sehingga kemurnian dari suatu isolat DNA diukur
dengan membandingkan nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi
280 nm. Berdasarkan hasil pengukuran kemurnian isolat DNA yang terlihat pada
tabel 4.1. Kemurnian yang dihasilkan dari masing-masing sampel bervariasi
antara 1,5-1,8. Dari hasil yang didapat, kemurnian dari daging sapi, daging babi
serta ketujuh sampel bakso sapi menunjukkan kemurnian yang cukup baik serta
memenuhi syarat suatu isolat DNA untuk dianalisis menggunakan real time PCR.

43
Syarat suatu isolat DNA dikatakan murni jika nilai perbandingan A260/280
berkisar antar 1,8-2,0 (Stephenso,2003; Muladno,2010). Jika dilihat dari syarat
suatu isolat DNA dikatakan murni, untuk daging babi dan sampel 6 menunjukkan
kemurnian yg paling rendah yaitu 1,5. Namun, nilai tersebut masih dapat
digunakan untuk dilanjutkan dalam tahap analisis menggunakan real time PCR
karena berdasarkan pada penelitian Glasel (1995), nilai kemurnian 1,5 memiliki
perbandingan presentase teoretis protein dan asam nukleat yaitu sekitar 80% dan
20%. Hal ini menunjukkan bahwa telah terjadi kesalahan dalam proses isolasi
DNA sehingga isolat DNA yang dihasilkan tidak murni.
Kemurnian suatu isolat DNA yang ada dibawa rentang 1,5 menunjukkan
bahwa isolat DNA tersebut terkontaminasi oleh protein sedangkan jika kemurnian
isolat tersebut menunjukan angka diatas 2,0 menunjukan bahwa isolat tersebut
terkontaminasi oleh RNA (Teare et al,1997). Sedangkan, menurut Kusumadewi,
Nilai kemurnian di atas 1,0masih dapat diterima dan dilanjutkan ke proses analisis
menggunakan real-time PCR (Kusumadewi et al., 2012).
4.2.2 Hasil Analisis PCR dengan Elektroforesis Agarose

Hasil isolasi DNA yang telah diukur konsentrasi dan kemurniannya
selanjutnya diuji di dalam mesin PCR untuk mengetahui spesifisitas primer yang
akan digunakan dalam proses RT PCR. Isolat DNA yang digunakan adalah
kontrol positif (DNA sapi) dan kontrol negatif (DNA Babi) yang dicampurkan
dengan Taqman Probe Master dan primer. Hasil PCR selanjutnya divisualisasi
keberadaannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1 % seperti
gambar berikut :
Gambar 4.1. Elektroforesis Hasil PCR dengan Primer Sapi dan Babi

44
Melalui teknik elektroforesis dengan medium berupa agarosa yang dialiri

arus listrik dan larutan buffer, DNA yang bermuatan negatif akan bergerak dari
kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan ini akan memisahkan DNA
berdasarkan ukrannya (Yowono,2009). DNA dapat tervisualisasi karena larutan
etiodium bromida yang ditambahkan terinterkalasi dengan ikatan hidrogen yang
terdapat pada untai ganda DNA , sehingga pita fragmen DNA dapat terlihat
dibawah lampu UV (Yowono,2009).
Gambar diatas menunjukkan hasil elektroforsis dengan 5 lajur, lajur 1 dan
lajur 2 merupakan hasil elektroforesis dari isolat daging sapi dengan primer sapi.
Pada lajur tersebut dihasilkan pita genom yang jelas dan tebal. Lajur 3 merupakan
DNA ladder 100 bp yang menunjukkan pita genom yang jelas. Sedangkan untuk
lajur 4 dan lajur 5 merupakan hasil elektroforesis dari isolat daging babi dengan
primer babi. Pada lajur tersebut dihasilkan pita genom yang jelas namun sedikit
smear. Smear yang terbentuk dapat disebabkan karena adanya primer dimer yang
terjadi pada primer babi yang digunakan. Primer dimer merupakan terbentuknya
struktur sekunder karena menempelnya sesama primer sejenis ataupun primer
yang yang tidak sejenis yaitu antara primer forward dengan komplemen primer
reverse (Widowati,2013)
Elektroforesis hasil PCR dengan menggunakan primer sapi dan primer babi
dilakukan untuk menguji spesifisitas dari primer sapi dan babi. Spesifisitas primer
sapi maupun babi sangat berpengaruh pada asil yang akan diperoleh dari proses
amplifikasi Real Time PCR. Primer yang spesifik akan mengamplifikasi DNA
target sehingga didapatkan hasil yang diinginkan. Dari hasil diatas, primer sapi
menunjukkan pita genom yang jelas dan tebal. Pita genom yang tebal dan jelas
membuktikan bahwa primer sapi tesebut spesifik untuk menguji kandungan sapi
pada sampel bakso sapi. Hal ini juga di dukung dengan hasil uji spesifisitas
primer dengan Database NCBI yang sebelumnya telah dilakukan oleh Izzah
(2014). Izzah telah melakukan uji spesifisitas primer dan probe dengan Database
NCBI pada runutan basa primer dan probe yang diperoleh dari penelitian Tanabe
S. et al,(2007).
Hasil spesifisitas primer sapi dan probe dengan Database NCBI
menunjukkan bahwa primer-probe sapi yang digunakan spesifik untuk DNA sapi

45
dengan nilai maksimum identitas 100%. Berikut ini hasil uji spesifisitas primer
sapi dengan BLAST melalui Database NCBI
Gambar 4.2 Hasil Uji Spesifisitas Primer Sapi dengan BLAST Melalui
Database NCBI (Sumber : Izzah, 2014)
Hasil uji spesifisitas primer babi dengan menggunakan elektroforesis

menunjukkan pita yang jelas namun sedikit smear. Smear tersebut dapat terbentuk
karena adanya primer dimer pada primer babi. Primer dimer pada primer babi
dapat mengakibakan primer babi tersebut tidak spesifik dalam mengamplifikasi
DNA target. Hal ini tidak sesuai dengan hasil uji spesifisitas primer babi
menggunakan Database NCBI yang menunjukkan bahwa primer babi spesifik
untuk DNA babi dengan nilai maksimum identitas 100%.
Gambar 4.3 Hasil Uji Spesifisitas Primer Sapi dengan BLAST Melalui
Database NCBI (Sumber : Izzah, 2014)

46
4.3 Hasil Amplifikasi DNA Menggunakan Real Time PCR

Amplifikasi DNA daging sapi, daging babi dan 7 sampel bakso sapi yang
beredar di wilayah ciputat dilakukan dengan menggunakan dua primer yaitu
primer sapi dan primer babi. Penggunaan primer sapi pada pengujian ini adalah
untuk memastikan bahwa sampel bakso tersebut mengandung daging sapi.
sedangkan untuk penggunaan primer babi untuk pengujian ini adalah untuk
mengetahui ada atau tidaknya kandungan daging babi di dalam sampel bakso
tersebut.
Primer yang digunakan pada penelitian ini menggunakan susunan basa dari
Tanabe et al, tahun 2007. Konsentrasi primer yang digunakan merupakan salah
satu faktor penting pada keberhasilan proses amplifikasi. Nilai konsentrasi primer
sapi dan babi didasari pada hasil perhitungan (Lampiran 3) yang mengacu pada
SYBR Green I Protokol serta dari hasil optimasi yang dilakukan. Konsentrasi
primer akhir pada RT PCR yang dianjurkan antara 0,1-0,5 µM (Roche,2005).
Konsentrasi primer yang tinggi (≥ 0,5 µM) dapat meningkatkan kesalahan
penempelan primer pada DNA cetakan, sehingga menyebabkan penumpukan
primer yang tidak spesifik. Namun, penggunaan konsentrasi primer yang terlalu
rendah akan memberikan hasil amplifikasi yang tidak jelas (Bintang,2010).
Proses amplifikasi pada RT PCR biasanya berlangsung 35 – 40 siklus
(Muladno,2010). Namun, pada penelitian ini kami menggunakan 30 siklus. Hal ini
karena setelah melakukan beberapa optimasi jumlah siklus yang digunakan untuk
proses amplifikasi seperti siklus 30, 35, 40 dan 45 siklus, didapatkan bahwa DNA
sapi dan sampel bakso sapi dengan menggunakan primer sapi teramplifikasi pada
siklus dibawah 30, sedangkan untuk DNA daging babi dengan menggunakan
primer babi teramplifkasi pada siklus dibawah 35. sehingga dipilih siklus yang
digunakan adalah 30 dan 35 siklus. Selain itu, pengunaan jumlah siklus dibawah
35 merupakan hasil optimasi. Pengunaan siklus diatas 35 akan menyebabkan NTC
yang merupakan blanko berisi air mengalami proses amplifikasi
Analisis kurva amplifikasi dilihat melalui kenaikan kurva dan nilai CP
(Crossing Point) pada kurva amplifikasi.CP adalah jumlah siklus dimana sampel
mulai terbaca diatas Arbitary Fluoresence Level (AFL) yang menunjukkan awal
mulainya fase pertumbuhan eksponensial (Roche,2008). CP merupakan nilai

47
dimana produk amplifikasi pertama kali terlihat pada data (Rojas et al.,2011).
Kenaikan kurva amplifikasi akan terlihat jika jumlah molekul produk telah
melebihi batas deteksi reaksi (pada CP, kurang lebih 1011 sampai 1012 molekul
produk, ada pada reaksi). CP sampel tergantung pada konsentrasi awal pada
sampel DNA. Sampel dengan konsentrasi awal kecil membutuhkan siklus
amplifikasi lebih banyak untuk mencapai CP dan sebaliknya.
Spesifisitas hasil amplifikasi dapat dilihat melalui nilai Tm (Melting
Temperature ) pada melt curve. Tm adalah suhu dimana 50% bagian dari DNA
telah terbukan manjadi untai tunggal. Nilai Tm tergantung dari jumlah basa A, G,
T, dan C. Primer yang spesifik akan menghasilkan satu puncak Tm pada DNA
target (Sambrook et al,2001).
4.3.1 Penetapan Metode Amplifikasi yang Optimal

Suhu amplifikasi merupakan salah satu faktor penting dalam proses
amplifikasi pada Real Time PCR. Suhu amplifikasi disesuaikan berdasarkan
perkiraan dari suhu Tm (Lampiran 4) dan dikombinasikan dengan hasil optimasi
suhu annealing menggunakan Real Time PCR. Dalam menentukan metode
amplifikasi yang optimal untuk analisis pada Real Time PCR, dilakukan
optimalisasi suhu annealing pada masing-masing primer beberapa titik suhu yaitu
pada suhu 50°C,55°C, 60°C,65°C dan 68°C.
Hasil optimalisasi suhu annealing yang telah dilakukan menunjukkan kurva
amplifikasi yang berbeda tiap suhu (Lampiran 7). Pada suhu 60°C dan 65°C
sampel uji dengan primer sapi, menunjukkan hampir sama. Namun, untuk suhu
65°C nilai CP dari kontrol negatif dan blanko yang lebih besar dibandingkan
dengan suhu 60°C. Selain itu, suhu annaealing 65°C untuk primer sapi sesuai
dengan perhitungan teoretis nilai Ta (Lampiran 4) Sehingga, Suhu annealing yang
digunakan untuk primer sapi adalah 65°C dan untuk sampel primer babi 60°C.
Program amplifikasi yang digunakan pada Real Time PCR dengan metode SYBR
Green sebagai penanda pada reaksi RT PCR sehingga program yang digunakan
dapat dilihat pada Lampiran 8.

48
4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan NTC
menggunakan Primer Sapi
Amplifikasi ini dilakukan menggunakan primer sapi dengan menguji
daging sapi sebagai kontrol positif, daging babi sebagai kontrol negatif dan NTC
sebagai blanko. Amplifikasi menggunakan daging sapi ini bertujuan untuk
mengetahui primer sapi yang digunakan tersebut spesifik atau tidak terhadap
daging sapi. Kurva amplifikasi terhadap kontrol sampel menggunakan primer sapi
dapat dilihat pada gambar 4.4.
Pada gambar 4.4, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging sapi adalah 17,52.
Sedangkan untuk daging babi dan NTC juga menghasilkan nilai CP yaitu 24,95
dan 25,94. Nilai CP yang dihasilkan oleh ketiga sampel ini menunjukkan bahwa
telah terjadi proses amplifikasi.
Gambar 4.4. Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan
NTC menggunakan Primer Sapi
Keterangan: DS (DNA Daging Sapi), NTC (No Template Control),
DB (DNA Daging Babi)
Hasil yang seharusnya adalah DNA daging babi dan NTC tidak
menghasilkan nilai CP ketika menggunakan primer sapi. Hal ini menunjukkan
bahwa primer sapi tidak dapat mengamplifikasi DNA daging sapi secara spesifik.
Terbentuknya nilai CP atau terjadinya proses amplfikasi pada DNA non target

49
menunjukkan bahwa telah terjadi mis priming atau primer dimer seperti self
dimer, cross dimer ataupembentukan formasi hairpin. Mis priming adalah
penempelan primer diluar sekuen DNA target sedangkan primer dimer adalah
terbentuknya struktur sekunder karena menempelnya sesama primer sejenis
ataupun primer yang yang tidak sejenis yaitu antara primer forward dengan
komplemen primer reverse (Widowati,2013).
Amplifikasi non spesifik dapat dianalisis juga melalui nilai Tm pada
Melting Peaks seperti pada gambar 4.5. Pada kurva tersebut menunjukkan bahwa
pada DNA daging babi dan NTC muncul puncak Tm yang seharusnya tidak ada.
Puncak kedua dan ketiga DNA tersebut merupakan hasil amplifikasi non spesifik
(Ponchel,2007). Dari kurva amplifikasi dan melting peaks menunjukkan bahwa
primer sapi yang diadopsi dari Tanabe S , et al 2007, tidak dapat digunakan untuk
analisis lebih lanjut pada sampel.
Gambar 4.5. Mealting Peaks Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging
Babi dan NTC menggunakan Primer Sapi
Keterangan : DS(Daging Sapi), NTC(No Template Control), DB(Daging Babi)
4.3.3 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, Bakso Sapi dan
NTC menggunakan Primer Sapi
Pengukuran amplifikasi yang kedua dilakukan dengan menggunakan primer
babi terhadap DNA daging sapi, sampel bakso sapi dan NTC. Isolat DNA daging
sapi sebagai kontrol positif, DNA sampel bakso sapi sebagai sampel uji dan NTC

50
sebagai blanko. Tujuan pengukuran amplifikasi ini adalah untuk memastikan

bahwa bakso sapi yang digunakan sebagai sampel uji mengandung daging sapi.
Hasil amplifikasi terhadap kontrol sampel dan blanko dapat dilihat pada kurva
amplifikasi (gambar 4.6).
Kurva hasil amplifikasi DNA sampel dengan primer sapi menunjukkan
nilai CP hasil amplifikasi DNA daging sapi adalah 18.56, untuk sampel 1, sampel
2, sampel 3, sampel 4, sampel 5, sampel 6 dan sampel 7 secara berturut-turut
adalah 16.91; 20.28; 21.20; 19.66; 21.34; 21.48 dan 21,22. Sedangkan pada DNA
daging babi dan NTC menghasilkan nilai CP yaitu 27,03 dan 24,37. Nilai CP
yang dihasilkan oleh DNA daging sapi, daging babi, sampel uji dan NTC
menunjukkan telah terjadi proses amplifikasi. Pada hasil tersebut menunjukkan
adanya amplifikasi pada DNA non target. Hal ini dikarenakan penggunaan primer
sapi yang tidak spesifik.
Gambar 4.6. Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi,
Bakso Sapi dan NTC menggunakan Primer Sapi
Keterangan :DS(Daging Sapi),S1(Sampel 1),S2(Sampel 2),S3(Sampel 3),
S4(Sampel 4),S5(Sampel 5),S6(Sampel 6),S7(Sampel 7), NTC(No Template
Control), DB(Daging Babi)

51
Nilai CP yang dihasilkan DNA sapi dan sampel dengan konsentrasi dari
DNA sapi dan DNA sampel uji menunjukkan semakin besar nilai CP, semakin
kecil konsentrasi DNA tersebut contohnya pada sampel 1 dan sampel 2. Sampel 1
memiliki nilai CP yaitu 16,91 dengan konsentrasi awal DNA adalah 88,943,
sedangkan sampel 2 memilki nilai CP 20,28 dengan konsentrasi awal DNA adalah
8,204. Selain itu, untuk amplifikasi pada DNA non target yaitu DNA daging babi
dan NTC menghasilkan nilai CP yang sama ketika diujikan menggunakan primer
sapi yaitu untuk DNA daging babi memiliki nilai CP 24 dan NTC dengan nilai CP
25.
Munculnya amplifikasi pada DNA non target terutama pada NTC (blanko)
dapat terjadi karena beberapa hal diantaranya primer kurang spesifik adanya
kontaminasi dari alat-alat yang digunakan (seperti mikropipet, mikrotips dan lain-
lain), kontaminasi pada bahan yang digunakan, primer kurang fresh, maupun
karena pengunaan suhu annealing yang salah. Selain itu, munculnya nilai CP pada
NTC dan kontrol negatif dapat terjadi karen pangaruh dari penetapan nilai
treshold yang digunakan. Nilai treshold adalah besarnya titik atau garis ambang
batas yang reaksinya menghasilkan fluoresensi diatas latar belakang. Garis
treshold ini diambil pada fase eksponensial suatu amplifikasi supaya
menghasilkan pengukuran paling teliti (Sudjadi dan Rohman,Abdul.2018). pada
penenlitian ini, garis treshold yang digunakan pada proses amplifikasi
menggunkan primer sapi sebesar 1,5723. Pada penelitian sebelumnya, besar nilai
treshold yang optimal untuk primer sapi adalah 0,75. Penggunaan nilai treshold
yang lebih tinggi akan menyebabkan nilai CP semakin meningkat, sehingga dapat
menyebabkan teramplifikasinya DNA non target seperti NTC dan kontrol negatif.
(Rasyid,2017).
Amplifikasi pada DNA non target yaitu pada NTC dan DNA daging babi
menunjukkan bahwa primer yang digunakan tidak spesifik. Spesifisitas proses
amplifikasi dapat dianalisa melalui Melting Peaks. Proses amplifikasi yang
spesifik akan menghasilkan satu jenis puncak dengan nilai Tm yang sama. Berikut
ini Melting Peaks dari hasil amplifikasi menggunakan primer sapi :

52
Gambar 4.7Mealting Peaks Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Bakso

Sapi Daging Babi dan NTC menggunakan Primer Sapi
Gambar Mealting Peaks diatas menunjukkan bahwa terdapat 3 puncak
yang dihasilkan dari proses amplifikasi DNA tersebut, puncak pertama merupakan
puncak dari hasil amplifikasi DNA sapi, puncak kedua terbentuk dengan
berhimpitan dengan puncak pertama atau ada diantara puncak pertama dan ketiga,
puncak ini terbentuk dari hasil amplifikasi sampel bakso yaitu sampel bakso 1-7.
Sedangkan untuk puncak ketiga dengan tinggi hampir mendekati puncak kedua,
puncak ini terbentuk dari hasil amplifikasi DNA babi dan NTC. Syarat suatu
puncak pada Melting Peaks yang baik adalah apabila puncak kontrol positif dan
sampel membetuk satu puncak yang sama dengan nilai Tm yang sama juga. Nilai
Tm DNA Sapi adalah 78, sedangkan untuk nilai Tm semua sampel uji bakso sapi
adalah 80. Perbedaan nilai Tm tersebut menunjukkan telah terbentuknya proses
amplifikasi non spesifik. Munculnya nilai Tm pada DNA Babi dan NTC
menunjukkan adanya primer dimer. Berdasarkan hasil tersebut, kami
menyimpulkan bahwa primer sapi yang didesain oleh Tanabe et al, 2007, tidak
dapat digunakan karena primer tidak spesifik.

53
4.3.4 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, Bakso Sapi dan
NTC menggunakan Primer Babi
Pengukuran amplifikasi yang keempat dilakukan dengan menggunakan
primer babi terhadap DNA daging babi, sampel bakso sapi dan NTC. Isolat DNA
daging babi sebagai kontrol positif, DNA sampel bakso sapi sebagai sampel uji
dan NTC sebagai blanko. Tujuan pengukuran amplifikasi ini adalah untuk
mengetahui ada atau tidaknya kandungan daging babi didalam sampel bakso sapi
tersebut. Hasil amplifikasi terhadap kontrol sampel dan blanko dapat dilihat pada
kurva amplifikasi (Gambar 4.8).
Kurva hasil Amplifikasi sampel uji dan kontrol menunjukkan nilai CP hasil
amplifikasi DNA daging babi yaitu 21,80. Sedangkan pada DNA sampel bakso
sapi dan NTC tidak menghasilkan nilai CP. Nilai CP yang dihasilkan oleh DNA
daging babi menunjukkan telah terjdi amplifikasi sedangkan pada DNA bakso
sapi dan NTC tidak terjadi proses amplifikasi. Hasil amplifikasi yang spesifik
dikarenakan tidak terjadi mis priming maupun primer dimer.
Gambar 4.8. Kurva Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Bakso Sapi, Daging
Babi dan NTC menggunakan Primer Babi
Keterangan : DB(Daging Babi), NTC(No Template Control)

54
Spesifisitas proses amplifikasi dapat dianalisa melalui Melting Peaks. Proses

amplifikasi yang spesifik akan menghasilkan satu jenis puncak dengan nilai Tm
yang sama. Berikut ini Melting Peaks dari hasil amplifikasi menggunakan primer
Babi :
Gambar 4.9. Melting Peaks Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Bakso
Sapi, Daging Babi dan NTC menggunakan Primer Babi
Gambar diatas menunjukkan Melting Peaks hasil amplifikasi sampel uji
dengan primer babi bahwa terdapat 1 puncak yang dihasilkan dari proses
amplifikasi DNA tersebut, puncak tersebut merupakan puncak dari hasil
amplifikasi DNA kontrol sampel dan DNA sampel uji. Nilai Tm yang dihasilkan
dari puncak tersebut adalah 82° C. Suatu proses amplifikasi dikatakan spesifik
apabila menghasilkan 1 puncak yang sama. Berdasarkan hasil amplifikasi diatas,
dapat digunakan untuk menunjukkan bahwa di dalam bakso sapi yang berdar di
wilayah ciputat tidak mengandung cemaran daging babi dan primer babi yang
digunakan spesifik

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari hasil penelitian yag telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan sebagai
berikut:
a. Hasil isolasi DNA sampel uji dan kontrol menunjukkan konsentrasi
yang cukup tinggi serta kemurnian yang baik
b. Amplifikasi DNA menggunakan primer sapi dan primer babi dapat
dilakukan dengan Real Time PCR sebanyak 30 siklus dengan kondisi
suhu denaturasi 95°C selama 10 menit dan annealling suhu 60°C
(pada sapi) serta 65°C (pada babi).
c. Hasil kurva amplifikasi DNA daging sapi dan sampel uji serta blanko
dengan menggunakan primer sapi menunjukkan bahwa primer sapi
tersebut tidak spesifik dan menghasilkan amplifikasi non taget,
sedangkan untuk primer babi spesifik untuk menguji kandungan
daging babi pada sampel.
d. Berdasarkan kurva amplifikasi pada running sample primer babi, tidak
didapatkan hasil positif untuk semua sampel DNA bakso. Maka
sampel bakso yang beredar di wilayah Ciputat Timur dan diambil
pada Juli 2018 tidak mengandung cemaran daging babi
5.2 Saran
1. Perlu dilakukan perhitugan dan penggunakan beberapa macam teknik
sampling dalam melakukan penentuan jumlah sampel
2. Perlu dilakukan uji spesifisitas primer dengan menggunakan kontrol
positif dan kontrol negatif masing-masing sampel
3. Perlu dibuat simulasi dari bakso sapi maupun bakso babi.
4. Perlu dilakukan pengujian spesifikasi primer sapi yang baru
5. Penelitian terhadap status kehalalan dalam produk makanan olahan perlu
ditingkatkan dikarenakan daya konsumsi makanan olahan sapi dikalangan
masyarakat indonesia semakin meningkat.

DAFTAR PUSTAKA
Alaraidha IA. 2008. Improved DNA Extraction Method for Porcine Contaminants,
Detection in Imported Meat to The Saudi Market. Saudi Journal of Biologic
Sciences 15 (2) 225-229 December 2008. Diakses pada tanggal 2 Februari
2018 pukul 08.00 WIB
Ali ME, Hasyim U, Mustafa S, Che Man YB, Dhahi TS, Kashif M, Uddin MK,
Abd Hamid SB.2012. Analysis of Pork Adulteration in Commercial
Meetballs Targeting Porcine-Specific Mitocondrial Cytochrome b gene by
Taqman Probe Real Time Polymerase Chain Reaction. Meat Sci.91(3):454-
9 Agustus 2012. Diakses pada tanggal 2 Februari 2018 pukul 08.05 WIB
Ali ME, Hasyim U, Mustafa S, Che Man YB, Dhahi TS & Abdul LM.2011.
Analysis of Pork Adulteration in Commercial Burgers Targeting Porcine
Specific Mitochondrial Cytochrome B gene by TaqMan Probe Real-Time
Polymerase Chain Reaction. Food Analytical Methods, 5(4):1-11. Diakses
pada tanggal 2 Februari 2018 pukul 08.05 WIB
Ali ME, Hasyim U, Mustafa S, Che Man YB. 2011. Swine-Specific CRRFLP
Assay Targeting Mitochondrial Cytochrome b gene for Semiquantitative
Detection of Pork in Commercial Meat Products, Food Analytical
Methods.doi: 10.1007/s12161- 12011-19290- 12165 Diakses pada tanggal 2
Februari 2018 pukul 08.05 WIB
Al-Kahtani HA,Ismail EA, Asif Ahmed M. 2017. Pork Detection In Binary Meat
Mixtures and Some Commercial Food Products Using Conventional and
Real Time PCR Techniques.Journal Food Chemistry 219,54-60. Diakses
pada tanggal 5 Maret 2018 pukul 14.17 WIB
Arya,Manit, Shergill IS, Williamsonnn M,Gommersall l, Arya N, Petel

HR.2005.Basic Principles of Real Time Quantitative PCR. London: food
drug ltd. Vol 5(2) : 209-21.Diakses pada tanggal 2 Februari 2018 pukul
08.20 WIB
Asensio, L., González, I., García, T., & Martín, R. 2008. Determination of food
authenticity by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Food
Control.19 (1), 1-8. Diakses pada tanggal 2 Februari 2018 pukul 08.20 WIB

57
Astawan, M. 2004. Tetap Sehat dengan Produk Makanan Olahan. Tiga

Serangkai. Solo. Diakses pada tanggal 2 Februari 2018 pukul 10.00 WIB
Bandelt HJ, Richards M and Macaulay V. 2006 . Human Mitochondrial DNA and
The Evoluation of Homo sapiens. Berlin :Spinger. Diakses pada tanggal 3
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta. Erlangga. Diakses pada

tanggal 3 Februari 2018 pukul 10.03 WIB
BioRad.2006.Real Time PCR ApplicationGuide. http://bio-rad.com. Diakses pada

Black EM, Lowings JP, Smith J, Heaton PR, McElhinney LM. 2002. A rapid RT-
PCR method to differentiate six established genotypes of rabies and rabies-
related viruses using TaqMan technology. J Virol Methods. 105:25-35.
Diakses pada tanggal 3 Februari 2018 pukul 08.37 WIB
Burns MJ, Nixon GJ, Foy CA, Harris N. 2005. Standardisation of data from real-
time quantitative PCR methods-evaluation of outliers and comparison of
calibration curves. BMC Biotecnology.5:31. . Diakses pada tanggal 2
Cain,ML.2002.Discover Biology Second Edition.W.W.Norton & Co And Sumana

Inc. Diakses pada tanggal 15 Februari 2018 pukul 20.20 WIB
Campbell NA, Reece JB, Mitchell, Lawrence G. 2002. Biologi. Edisi Kelima Jilid
1, alih bahasa Rahayu Lestari. Jakarta: Erlangga. Diakses pada tanggal 11
Carson, Susan & Robertson, Dominique.2006. Manipulation and Expression of

Recombinant DNA,2ndEdition .USA : Elsivier Academic Press. Diakses
Chantratita W, Sukasem C, Kaewpongsri S, Srichunrusami C, Pairoj W,

Thitithanyanont A, Chaichoune K, Ratanakron P, Songserm T,
Damrongwatanapokin S, Landt O. 2008. Qualitative detection of Avian
Influenza A (H5N1) viruses: a comparative evaluation of four real-time
nucleic acid amplification methods. Mol Cell Probes.22:287-293. . Diakses

58
Corkill G, Rapley R, 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools &
Techiques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker,
J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ,USA. Diakses pada tanggal 9 Februari
Devereux,R and Wilkinson. 2004. Amplification of Ribosomal RNA

Sequences.Kluwer Academic Publisher :Netherlands. Diakses pada tanggal
08 Februari 2018 pukul 14.15 WIB
Dieguez MR,Alonso IG, Garcia T, Martin R.2012. Authentification of Meat and

Commercial Meat Products from Common Pigeon (Columba livia)
Woodpigien (Columba palumbus) and Stock pigeon (Columba oenas) Using
a Taqman Real Time PCR Assay. Food Control 23: 369-376 . Diakses pada
Dolphin, W. D. 2008. Biological investigations. New York : The McGraw-Hill

Companies, Inc. Diakses pada tanggal 09 Februari 2018 pukul 16.15 WIB
Ellya, E.S. (2010). Gizi Dalam Kesehatan Reproduksi. Jakarta: Trans Info Media.
Faatih,M.2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom Skripsi.Jurusan Pendidikan

Biologi FKIP, Universutas Muhamadiyah Surakarta. Jurnal Penelitian Sains
dan Teknologi ,Vol.10 No 1 2009. Diakses pada tanggal 15 Agustus 2018
pukul 14.00 WIB
Fraga D, Meulia T, Fenster S. 2008. Real-Time PCR. In: Current protocols

essential laboratory techniques. New York (US): John Wiley & Sons, Inc.
p. 10.3.110.3.33 Diakses pada tanggal 2 Februari 2018 pukul 09.40 WIB
Gaffar,S.2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Jurusan Kimia.Universitas

Padjajaran. Bandung . Diakses pada tanggal 2 Februari 2018 pukul 13.00 WIB
Gibbs RA.1990. DNA Amplification by The Polymerase Chain Reaction. Anal

Chem. 62 : 1202-1214. Diakses pada tanggal 11 maret 2018 pukul 20.00
WIB

59
Giglio S, Monis PT, Saint CP. 2003. Demonstration of preferential binding of

SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR.
Nucleic Acids Res. 31:e136. Diakses pada tanggal 05 maret 2018 pukul
14.15 WIB
Greene, JJ and Venigalla B. Rao. 1998. Recombinant DNA Principles and

Methodologies. New York : Marcel Dekker Inc. Diakses pada tanggal 1
Maret 2018 pukul 14.15 WIB
Handoyo D dan Ari R. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Surabaya: Universitas Surabaya. Diakses pada tanggal 1
Maret 2018 pukul 14.17 WIB
Harisah,SU.2017. Analisis Cemaran Daging Bbabi Pada Sosis Sapi yang Beredar
di Pasar Parung Menggunakan Metode Real Time Polymerase Chain
Reaction (PCR).Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan. Univeersitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Haryudi.2017.Daging Oplosan: Sindikat Pengoplos Daging Celeng untuk Bakso

Dibongkar Polisi Bogor. Sindo News. Dikutip dari :
http://metro.sindonews.com
Hidayat,Rian.2015. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA Babi dan DNA

Sapi untuk Deteksi Kehalalan Cangkang Kapsul Keras dari Gelatin dengan
Real Time PCR. Skripsi . Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan. Univeersitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Hilda,Dr.Lelya,M.Si.2013.Pandangan Sains Terhadap Haramnya Lemak

Babi.TSAIN Padangsidimpuan. Diakses pada tanggal 10 Maret 2018 pukul
17.17 WIB
Izzah, Afifah Nurul.2014. Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode
Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi
dengan Menggunakan Real Time PCR. Skripsi . Program Studi Farmasi.
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Univeersitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta. Diakses pada tanggal 5 Maret 2018 pukul 10.00 WIB

60
Kennedy, S. and N. Oswald. 2011. PCR Troubleshooting and Optimization: The

Essential Guide. Caister Academic Press. Norfolk, UK. Diakses pada
tanggal 5 Maret 2018 pukul 13.45 WIB
Khosvarina H, Murthy HNN, Parasad DT, Pirany N .2007. Optimazing factore

influencing DNA extaction from fresh whole avian blood.AfricanJournal of
biotecnolgy,Vol. 6 (4). Diakses pada tanggal 5 Maret 2018 pukul 11.30 WIB
Koolman J dan Klaus-Henrich Roehm,2005. Color Atlas of Biochemistry. Edisi

Kelima. Germany : Georg Theime Verlag Diakses pada tanggal 24 Maret
Kulkarni,Shashikant dan John Pfeifer.2015.Clinical Genomics : A Guide to

Clinical Nezt Generation Sequencing. USA : Academic Press. Diakses pada
Lopez-Andreo M, Lugo L,Garrido-Pertierra A, Prieto MI, Puyet A. 2005.

Identification and quantitation of Species in complex dna mixtures by real-
time polymerase chain reaction. Analytical biochemistry. 339(1), 73-82
Diakses pada tanggal 20 Agustus 2018 pukul 08.15 WIB
Ma H,Shieh KJ, Cain G, Quao XT, Chuang MY.2006. Aplication of Real Time
Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). The Journal of American science:
2(3):1-15. Diakses pada tanggal 10 maret 2018 WIB
Margawati ET dan Ridwan M. 2010. Pengujian Pencemaran Daging Babi pada

Beberapa Produk Bakso dengan Teknologi PCR: Pencarian Sistem
Pengujian Efektif. Bogor : Pusat Penelitian Bioteknologi , LIPI Diakses
pada tanggal 07 maret 2018 Pukul 12.25 WIB
Mayasari N.2007.Memilih Makanan Halal .Jakarta: Qultum Media. Diakses pada

tanggal 11 maret 2018 pukul 20.05 WIB
Muladno, 2002. Teknologi Rekayasa Genetik. Bogor : Pustaka Wirausaha Muda.

Diakses pada tanggal 07 maret 2018 pukul 12.20 WIB
Muray,R.K.,Granner,D.K.,Rodwell,V.W.2012. Biokimia Herper.Jakarta :EGC.


61
Ngili,Yohanis.2013.Biokimia Dasar. Bandung : Rekayasa Sains. Diakses pada

tanggal 08 maret 2018 pukul 14.45 WIB
Nishiguchi,M.K.,et al.2002.DNA Isolation Prosedure.Birkhauser Verlag Basel :

Switzerland Diakses pada tanggal 11 maret 2018 WIB
Nurfadila,Mifa.2015.Isolasi DNA Stomatopoda Sp dan Drosopjila melanogaster. .

Nurjuliana M, Che Man YB, Mat Hashim D and Mohamed AK. 2011. Rapid
identification of pork for halal authentication using the electronic nose and
gas chromatography mass spectrometer with headspace analyser. Meat
Science. Diakses pada tanggal 23 februari 2018 pukul 12.09
Pardal SJ. 2010. Menguji ekspresi gen menggunakan real time PCR. Warta
Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Diakses pada tanggal 17 April
2018 pukul 20.06
Passarge,Ebenhard. 2007. Color Atlas of Genetic. Edisi ketiga. New York

Theime. Diakses pada tanggal 17 februari 2018 pukul 08.35 WIB
Pratami,D.f.2011.Analisis Cemaran Daging Babi Ada Produk Burger Sapi Yang

Beredar Di Wilayah Ciputat Melalui Amlifikasi DNA Menggunakan Real
Time PCR.Skripsi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Diakses pada tanggal
Poedjadi,Anna.2005. Dasar-Dasr Biokimia.UI Press. Jakarta. Diakses pada

Ponchel,F.2006. Real Time PCR Using SYBR Green , dalam : Dorak.M.T., (Ed)
Real Time PCR. Taylor & Francis,hal 139-152. Diakses pada tanggal 17
maret 2018 pukul 13.07 WIB
Promega.2014. Technical Manual Wizard Genomic DNA Purification

Kit.Promega diakses dari www.promega.comDiakses pada tanggal 18 maret

62
Radji, Maksum. 2011. Rekayasa Genetika. Jakarta: ISBN : 978-602-8674-40-9

Rasyid,Sulaiman.2017. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi

yang beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real Time Polymerase
Chain Reaction (RT PCR) dengan Metode Hydrolisis Probe.Skripsi.
Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan.
Univeersitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Diakses pada tanggal
5 Maret 2018 pukul 09.45 WIB
Rochec. 2005. LightCycler® 480 DNA SYBR Green I Master. www.rocheapplied-

science.comDiakses pada tanggal 1 maret 2018 pukul 20.06 WIB
Roched.2007. Nucleic Acid Isolation and Purification 3nd Edition. Jerman : Roche
Diagnostics GmbH. Diakses pada tanggal 11 maret 2018 pukul 13.35 WIB
Roched. 2008. LightCycler® 480 Probes Master. www.rocheapplied-

science.com. Diakses pada tanggal 17 April 2018 pukul 20.06 WIB
Roche.2008.The Light Cycler 480 Instrument Operator ‘s Manual.

http://www.roche-applied-science.com. Diakses pada tanggal 23 maret 2018
pukul 20.06 WIB
Rohman A, Sismindari, Erwanto Y,Che man YB .2012. Pig Species Identification

in Meatballs Using Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment
Length Polymorphism for Halal Authentication. International Food
Research Journal19 (3):901-906 Diakses pada tanggal 7 Februari 2018
pukul 09.00 WIB
Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A

Labolatory Manual. 2nd edition. New York : Cold Spring Harbour
Laboratory Press. Book 1.6.1-6.17. Diakses pada tanggal 17 maret 2018
pukul 20.15 WIB
Shipley,G.L.,2006.An Introduction to Real Time PCR dalam Dorak,M.T (Ed) Real

Time PCR. Taylor & Francis,hal 9-18. Diakses pada tanggal 20 februari
Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA mitokondria (mtDNA) dalam
studi keragaman genetic dan biologi populasi pada hewan. Bogor: FMIPA

63
IPB. ISSN 0854-8587. Diakses pada tanggal 20 Februari 2018 pukul

19.46 WIB
Stephenson, Frank, H., 2003. Calculations in Molecular Biology and

Biotechnology, A Guide to Mathematics in The Laboratory, Academic
Press, California, USA. Diakses pada tanggal 23 Februari 2018 pukul 14.30
WIB
Sudjadi,2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Kanisius. Diakses pada

Sudjadi dan Rohman,Abdul. 2018.Analisis Derivat Babi.Bandung : UGM Press.

diakses pada tanggal 27 September 2018 pukul 23.00 WIB
Sulistyaningsih, Erna. 2007.Polymerase Chain Reaction (PCR) : Era Baru

Diagnosa DNA Manajemen Penyakit Infeksi .Jember : Laboratorium
Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember Diakses pada tanggal 25
Tarigan, Henry Guntur.1983. Menulis Sebagai Suatu Keterampilan Berbahasa.

Bandung: Angkasa. Diakses pada tanggal 3 Maret 2018 pukul 20.06 WIB
Tanabe S, Hase M, Yano T, Sato M, Fujimura T, Akiyama H. 2007. A real-time

quantitative PCR detection method for pork, chicken, beef, mutton, and
horseflesh in foods. Biosci Biotechnol Biochem 71(12):3131-5. Diakses
pada tanggal 17 Febuari 2018 pukul 14.43 WIB
Teare JM, Islam R, Flanagan R, Gallagher S, Davices MG, Grabau C

.1997.Measurement of nucleic acid concentration using the DyNa Quant TM
and the Gene QuantTM. Bio Techniques 22:1170-1174.. Diakses pada tanggal
Valasek MA and Repa JJ.2005. The Power of real time PCR.The American
Physiological Society. 29(3):151-9. Diakses pada tanggal 3 Maret 2018
pukul 19.00 WIB
W.Widiwati, Esti.2013.Desain Primer Sitokrom B (cyt b) Sebagai Salah Satu

Komponen PCR (polymerase Chain Reaction) Untuk Deteks DNA

64
Babi.Yogyakarta : Lembaga Peelitian UIN Sunan Kalijaga Yogyakarta.

Westermeier, 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice.

New-Jersey: John Wiley & Sons inc. Diakses pada tanggal 3 Maret 2018
pukul 19.17 WIB
Wibowo, Singgih. 2009. Membuat Bakso Sehat dan Enak. Penebar Swadaya.
Jakarta. Diakses pada tanggal 5 Maret 2018 pukul 13.57 WIB
Winarno, F.G. 1991. Kimia Pangan dan Gizi.Gramedia, Jakarta. Diakses pada
Yeni WH, Iman P. Maksum. 2004. Amplifikasi 0,4 Kb Daerah D-Loop DNA
Mitokondria Dari Sel Epitel Rongga Mulut Untuk Keperluan Forensik.
Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Padjadjaran. Hasil Penelitian. Tidak
dipublikasiYuwono, T., 2009, Biologi Molekular, Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, 209-215,
Jakarta, Erlangga. Diakses pada tanggal 25 Februari 2018 pukul 13.00 WIB
Yuni et al.2006. Struktur Sel Tumbuhan dan Hewan.Yogyakarta : Fakultas

Matematika dan ilmu Pengetahuan Alam UNY . Diakses pada tanggal 10
Yusuf, Zuhriana K. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek vol.5 No:6,
2010, FIKK-Universitas Gorontalo. Diakses pada tanggal 20 Februari 2018
pukul 10.07 WIB
Yuwono dan Tribowo, 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction,
Panduan Eksperimen PCR untuk Memecahkan Masalah Biologi Terkini,
Penerbit Andi, Yogyakarta. Diakses pada tanggal 20 Februari 2018 pukul
10.15 WIB
Yuwono, Triwibowo. 2009. Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga. Diakses pada


65
Lampiran 1. Kerangka Penelitian

66
Lampiran 2. Alur Kerja Isolasi DNA Menggunakan Genomic DNA

Purification Kit

67
Lampiran 3. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer
1. Membuat larutan primer 50 µM dari larutan induk 100 µM

V1.M1 = V2.M2
X. 100µM =100µL.50µM
X=
= 50 µL
Maka, 50 µL diambil dari masing-masing primer 100 µM dan di add 50
µL aquabidest.
V1.M1 = V2.M2
X. 50µM =100µL.10µM
X=
= 20 µL
Maka, 20 µL diambil dari masing-masing primer 50 µM dan di add 80 µL
aquabidest.
V1.M1 = V2.M2
X. 50µM =100µL.5µM
X=
= 10 µL
Maka, 10 µL diambil dari masing-masing primer 50 µM dan di add 90 µL
aquabidest.
4. Rekomendasi konsentrasi untuk primer pada SYBR Green mastermix

adalah 0,3-1 µM (Roche), diplih konsentrasi 0,5 µM untuk tiap primer
V1.M1 = V2.M2
X. 10µM =20µL.0,1 µM
X=
= 1 µL
Maka, diambil 1 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM

68
Lampiran 4. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer
Rumus  Tm = 2°C (A+T) + 4°C (G+C)
Primer Sapi Primer Babi
Primer Sapi Forward Primer BabiForward

Tm = 2°C (A+T) + 4°C (G+C) Tm = 2°C (A+T) + 4°C (G+C)
= 2°C (10) + 4°C (10) = 2°C (11) + 4°C (11)
= 60°C = 66°C
Primer Sapi Reserse Primer BabiReserse

Tm = 2°C (A+T) + 4°C (G+C) Tm = 2°C (A+T) + 4°C (G+C)
= 2°C (13) + 4°C (11) = 2°C (15) + 4°C (10)
= 70°C = 70°C
Tm rata-rata Primer Sapi Tm rata-rata Primer Babi

Tm = (60+70)/2 Tm = (66+70)/2
= 65 °C = 68 °C
Ta * = 60°C Ta * = 65°C
*) Suhu annealing yang digunakan biasanya 5°C dibawah Tm (Muladno,2010)

69
Lampiran 5. Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA
Tabel 1. Campuran reaksi SYBR Green Mastermix untuk Primer Sapi
Konsentrasi Larutan Induk Jumlah yang

akhir digunakan
Primer Forward 0,5 µM 10 µM 1 µL
Primer Reverse 0,5 µM 10 µM 1 µL
Light Cycler 480
- - 10 µL
SYBR GreenI
ddH2O - - 3 µL
DNA template - - 5 µL
Total Volume Reaksi 20 µL
Tabel 2.Campuran reaksi SYBR Green Mastermix untuk Primer Babi
Konsentrasi Larutan Induk Jumlah yang

akhir digunakan
Primer Forward 0,25 µM 10 µM 1 µL
Primer Reverse 0,25 µM 10µM 1 µL
Light Cycler 480
- - 10 µL
SYBR GreenI
ddH2O - - 3 µL
DNA template - - 5 µL
Total Volume Reaksi 20 µL

70
Lampiran 6. Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA
Konsentrasi dan
Sampel Gambar Kemurnian DNA
(A280/260)
Daging Konsentrasi
Sapi 28,563 ng/µl
Kemurnian :1,64
Daging Konsentrasi
Babi 76,635 ng/µl
Kemurnian : 1,49
Sampel 1 Konsentrasi
88,943 ng/µl
Kemurnian : 1,80
8,204 ng/µl
Kemurnian : 1,67

71
63,191 ng/µl
Kemurnian : 1,83
21,315 ng/µl
Kemurnian : 1,73
30,662 ng/µl
Kemurnian : 1,64
12,925 ng/µl
Kemurnian : 1,56
25,410 ng/µl
Kemurnian : 1,60

72
]Lampiran 7. Optimasi Suhu Annealing pada Primer Sapi
a. Suhu 50°C

73
b. Suhu 55°C

74
c. Suhu 60°C

75
d. Suhu 68°C

76
Lampiran 8 .Program Amplifikasi yang Digunakan pada Real Time PCR

dengan Metode SYBR Green
Tabel 1. Hasil Optimasi Program Amplifikasi Real Time PCR

untuk Primer Sapi

77
Tabel 2. Hasil Optimasi Program Amplifikasi Real Time PCR

untuk Primer Babi

78
Lampiran 9. Gambar Alat-Alat yang Digunakan dalam Penelitian
Kit isolasi DNA (Promega) Masker, Glove
Mikropipet (1) Vol 1000 µl; Mikrotips, Microsentrifuge,

(2) Vol 200 µl; (3) Vol 20 µl tube
Microsentrifugasi Vortex

79
Timbangan Analitik Mikrosentrifugasi 5417 R
Spektrofotometri DNA Lemari Pendingin(Freezer) -21°C
Multiwell Plate & Sealing Foil Rt PCR

80
PCR Konvensional Alat Elektroforesis
Gel Documentation Bakso Sapi
Daging Sapi Daging Babi

Khena Zuraeda-FIKES

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Khena Zuraeda-FIKES

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

Nama : Khena Zuraeda

Telah berhasil dipertahankan dihadapan Dewan Penguji dan diterima

Pembimbing I : Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. ( )

Pembimbing II : Chris Adhiyanto.,M.Biomed.,Ph.D ( )

Penguji I : Dr. M.Yanis Musdja.,M.Si.,Apt ( )

Penguji II : Dr.Endah Wulandari.,M.Biomed ( )

Nama : Khena Zuraeda

Tingginya harga daging sapi dan kurangnya suplai daging sapi

Kata Kunci : Real TimePCR , Bakso, Cemaran Daging Babi

Name : Khena Zuraeda

Keyword : Real TimePCR, Meatball, Contamination of Pork

Alhamdulillah, segala puji syukur selalu terpanjatkan kehadirat Allah

Ciputat, Oktober 2018

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai civitas akademik Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Nama : Khena Zuraeda

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, Saya menyetujui skripsi/karya

Untuk dipublikasikan atau sitampilkan di internet atau media lain yaitu

Pada Tanggal : Oktober 2018

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4

BAB III METDOLOGI PENELITIAN 32

2.1 Sel Prokariotik dan Eukariotik 5

2.1 Perbandingan Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik 6

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool merupakan

1.1 Latar Belakang

1 UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

kawasan pendidikan di Tanggerang Selatan yang di dominasi oleh mahasiswa dan

1.2 Rumusan Masalah

1.3 Tujuan Penelitian

1.4 Manfaat Penelitian

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2.1 Daging Babi

4 UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2.2 Organel Sel

Gambar 2.1 . Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik .

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Tabel 2.1. Perbandingan Sel Prokariotik dan Eukariotik

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2.3 Asam Nukleat dan Protein

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Gambar 2.2 Struktur Premier DNA dan RNA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Gambar 2.3 Struktur Basa Nitrogen Purin dan Pirimidin

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2.4.2 Sifat Fisika DNA

2.4.3 Fungsi DNA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2.4.4 Isolasi DNA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Spektrofotometer UV dapat digunakan untuk menghitung kadar dan

2.5 DNA Mitokondria

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

dimanfaatkan untuk menentukan keragaman ginetik antar individu dalam suatu

Gambar 2.5. Struktur Mitokondria