Afri Yanti-FKIK

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
UJI AUTENTIFIKASI DAGING KAMBING TERHADAP

CEMARAN DAGING BABI MENGGUNAKAN REAL-
TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
SKRIPSI
AFRI YANTI
1113102000081
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
JULI 2017
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
UJI AUTENTIFIKASI DAGING KAMBING TERHADAP

CEMARAN DAGING BABI MENGGUNAKAN REAL-
TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi
AFRI YANTI
1113102000081
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
JULI 2017
ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

LEMBAR PERNYATAAN ORISINALITAS
Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk
telah saya nyatakan dengan benar.
Nama : Afri Yanti

NIM : 1113102000081
Tanda Tangan
Tanggal : 17 Juli 2017
iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING
Nama : Afri Yanti
NIM : 1113102000081
Program Studi : Strata-1 Farmasi
Judul : Uji Autentifikasi Daging Kambing Terhadap Cemaran Daging Babi

Menggunakan Real-time PCR (Polymerase Chain Reaction)
Disetujui oleh:
Pembimbing I, Pembimbing II,
Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D.

NIP: 197308222008012007 NIP: 196905112003121001
Mengetahui,
Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt.

NIP: 197404302005012003
iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PENGESAHAN
Skripsi ini diajukan oleh
Nama : Afri Yanti
NIM : 1113102000081
Program Studi : Strata-1 Farmasi

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai

bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi
pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
DEWAN PENGUJI
Pembimbing I : Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. ( )
Pembimbing II : Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D. ( )
Penguji I : Dr. Endah Wulandari, M.Biomed. ( )
Penguji II : Imam Prabowo, M.Farm., Apt. ( )
Ditetapkan di : Ciputat
Tanggal : 17 Juli 2017
v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK
Nama : Afri Yanti

Program Studi : Farmasi
Daging kambing merupakan salah satu jenis daging yang banyak terdapat di
Indonesia dan dikonsumsi oleh sejumlah luas populasi. Adanya kasus peredaran
daging yang tercampur dengan daging babi sangat meresahkan masyarakat Muslim.
Untuk mengantisipasi meningkatnya kasus tersebut, maka perlu dilakukan
autentifikasi daging kambing terhadap cemaran daging babi. Pengembangan teknik
analisis berbasis DNA menggunakan real-time PCR telah menjadi salah satu teknik
analisis yang cepat, sensitif, dan efisien. Amplifikasi DNA menggunakan real-time
PCR memerlukan primer yang spesifik dan pewarna fluoresensi. Primer kambing dan
babi yang digunakan ditargetkan pada sekuens DNA mitokondria dengan UPL probe
sebagai pewarna fluoresensi. Proses isolasi DNA menggunakan kit komersial.
Kelompok sampel simulasi daging A yaitu campuran antara daging kambing dan
daging babi dengan konsentrasi daging kambing 100%; 50%; 10%; 1%; 0,5%; dan
0,1%. Kelompok sampel simulasi daging B yaitu campuran antara daging kambing
dan daging babi dengan konsentrasi daging babi 100%; 50%; 10%; 1%; 0,5%; dan
0,1%. Isolat DNA yang diperoleh yaitu memiliki konsentrasi terendah 6,36 ng/μl,
sedangkan konsentrasi terbesar yaitu 35,26 ng/μl. Adapun kemurnian isolat DNA
yang terendah dan tertinggi yaitu masing-masing 1,50 dan 2,02. Hasil kurva
amplifikasi menunjukkan masing-masing primer telah spesifik. Primer kambing dapat
mendeteksi daging kambing hingga konsentrasi 0,1% dalam campuran daging babi.
Demikian pula dengan primer babi, dapat mendeteksi daging babi hingga konsentrasi
0,1% dalam campuran daging kambing.
Kata Kunci: Real-time PCR, daging, UPL probe
vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT
Name : Afri Yanti

Programe Study : Pharmacy
Title : Authentication of Goat Meat to Contamination of Pork Meat
Using Real-time PCR (Polymerase Chain Reaction)
Goat meat is one type of meat that is widely available in Indonesia and consumed by
a large number of population. The existence of cases of circulation of meat mixed
with pork is very disturbing Muslim community. To anticipate the increased cases, it
is necessary to authenticate goat meat to contaminate pork meat. The development of
DNA-based analysis techniques using real-time PCR has become one of the fastest,
most sensitive, and efficient analysis techniques. DNA amplification using real-time
PCR requires a specific primer and fluorescence dye. The goat and pig primers used
are targeted at mitochondrial DNA sequences with UPL probes as fluorescence dyes.
The process of DNA isolation using a commercial kit. The simulated group of meat A
is a mixture of goat meat and pork with 100% goat meat concentration; 50%; 10%;
1%; 0.5%; and 0.1%. Group of simulated samples of B meat is a mixture of goat meat
and pork with 100% pork concentration; 50%; 10%; 1%; 0.5%; and 0.1%. The
obtained DNA isolate has the lowest concentration is 6.36 ng/μl, while the largest
concentration is 35,26 ng/μl. The purity of the lowest and highest DNA isolates are
1.50 and 2.02 respectively. The result of the amplification curve shows that each
primary has been specific. Primary goats can detect goat meat up to a concentration
of 0.1% in pork mix. Similarly with pig primers, it can detect pork to a concentration
of 0.1% in a mixture of goat meat.
Keyword: Real-time PCR, meat, UPL probe
vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR
Keanugrahan inspirasi dari Allah SWT menjadi kekuatan kepada penulis untuk
segera menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, tiada kata yang terindah selain
ucapan syukur tak terhingga karena penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang
berjudul “Uji Autentifikasi Daging Kambing Terhadap Cemaran Daging Babi
Menggunakan Real-time PCR (Polymerase Chain Reaction)”. Sholawat dan salam
semoga tercurah kepada Rasulullah SAW, pembawa cahaya Islam. Skripsi ini
diajukan kepada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan,
UIN Syarif Hidayatullah.
Dalam penulisan skripsi ini, banyak pihak yang telah membantu hingga skripsi
ini dapat penulis tuntaskan. Oleh karena itu, penulis berterima kasih kepada
1. Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. dan Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D. yang ikhlas
membimbing, mendidik, dan menerima penulis dengan baik untuk berkonsultasi;
2. Dr. Arief Sumantri, SKM, M. Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta;
3. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt., selaku Kepala Program Studi Farmasi UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta;
4. Nelly Suryani, Ph.D., Apt., selaku Sekretaris Program Studi Farmasi UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta sekaligus dosen Penasehat Akademik yang selalu setia
memberikan arahan dan bimbingan dengan sabar;
5. Bapak dan Ibu pengajar serta segenap staf dan karyawan yang telah memberikan
ilmu pengetahuan dan bimbingan selama penulis menempuh pendidikan farmasi
di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta;
6. Masyarakat dan Pemerintah Sumsel yang telah memberikan beasiswa sehingga
memicu semnagat belajar;
7. Kakak-kakak laboran yang telah membantu dalam melakukan penelitian;
8. Bu Frida dan tim yang telah bersedia membantu dalam penyelesaian real-time
PCR;
9. Kakak-kakak sejawat (Kak Vesty dan Kak Safizah) yang telah menyumbangkan
materi dan pikiran;
10. Teman anggota tim analisis halal (Rizki), dan teman-teman seperjuangan yang
selalu setia menginsipirasi untuk menyelesaikan penelitian ini;
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada keluarga: ibu (Halipah), ayah (A.
Rahman), dan adik-adik tercinta yang selalu mendukung penulis melalui doa dan
memotivasi penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.
Semoga skripsi ini dapat bermanfaat, baik sebagai sumber informasi maupun
sumber inspirasi, bagi para pembaca.
Jakarta, Juli 2017
Penulis
viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI
TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK
Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini
Nama : Afri Yanti
NIM : 1113102000081
Program Studi : Farmasi
Fakultas : Kedokteran dan Ilm Kesehatan
Jenis Karya : Skripsi
demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,
dengan judul
UJI AUTENTIFIKASI DAGING KAMBING TERHADAP CEMARAN DAGING

BABI MENGGUNAKAN REAL-TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital
Lybrary Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-undang Hak Cipta.
Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan
sebenarnya.
Dibuat di : Ciputat
Pada tanggal : 17 Juli 2017
Yang menyatakan,
(Afri Yanti)
ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS................................................. iii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. iv
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... v
ABSTRAK ............................................................................................................. vi
ABSTRACT ........................................................................................................... vii
KATA PENGANTAR ........................................................................................... viii
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI....................................................... ix
DAFTAR ISI .......................................................................................................... x
DAFTAR TABEL.................................................................................................. xii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xiii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xiv
DAFTAR SINGKATAN ....................................................................................... xv
BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 4
1.3 Tujuan Penelitian.................................................................................. 4
1.4 Manfaat Penelitian................................................................................ 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 5
2.1 Babi dan Keharamannya ..................................................................... 5
2.2 Sel ......................................................................................................... 5
2.3 Deoxyribonucleic Acid (DNA) ............................................................. 7
2.3.1 Definisi DNA ............................................................................. 7
2.3.2 Sifat Fisika DNA ....................................................................... 9
2.3.3 DNA Mitokondria ....................................................................... 10
2.3.4 Isolasi DNA ................................................................................ 12
2.3.5 Uji Kuantitatif DNA ................................................................... 13
2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) ...................................................... 14
2.4.1 Komponen PCR ......................................................................... 14
2.4.2 Tahapan PCR .............................................................................. 17
2.5 Real-time PCR ...................................................................................... 19
BAB III METODE PENELITIAN ...................................................................... 22
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .............................................................. 22
3.1.1 Tempat Penelitian ....................................................................... 22
3.1.2 Waktu Penelitian ......................................................................... 22
3.2 Alat dan Bahan ..................................................................................... 22
3.2.1 Alat.............................................................................................. 22
3.2.2 Bahan .......................................................................................... 22
3.3 Alur Kerja ............................................................................................. 23
3.4 Prosedur Kerja ...................................................................................... 23
3.4.1 Preparasi Sampel ........................................................................ 23
x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.2 Isolasi DNA ................................................................................ 23
3.4.3 Analisis Isolat DNA .................................................................... 24
3.4.4 Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI ......................... 24
3.4.5 Amplifikasi DNA Menggunakan Real-time PCR ....................... 25
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................... 27
4.1 Analisis Isolat DNA ............................................................................. 27
4.2 Analisis Uji Spesifisitas Primer............................................................ 30
4.3 Amplifikasi DNA Menggunakan Primer Kambing dan Primer Babi
pada Real-time PCR ............................................................................. 31
4.3.1 Amplifikasi DNA Menggunakan Primer Kambing pada Real-
time PCR ..................................................................................... 32
4.3.2 Amplifikasi DNA Menggunakan Primer Babi pada Real-time
PCR ............................................................................................. 35
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 39
5.1 Kesimpulan........................................................................................... 39
5.2 Saran ..................................................................................................... 39
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 40
LAMPIRAN .......................................................................................................... 46
xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 3.1 Primer (Macrogen®) dan UPL (Roche®) ................................................ 23
Tabel 3.2 Pengaturan Program Amplifikasi Real-time PCR .................................. 26
Tabel 4.1 Isolat DNA .............................................................................................. 29
xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Skema Representasi Sel Eukariotik dengan Organel Sel ................... 6
Gambar 2.2 Struktur Basa Nitrogen DNA ............................................................. 8
Gambar 2.3 Struktur DNA Double Helix ............................................................... 8
Gambar 2.4 Mitokondrion....................................................................................... 11
Gambar 2.5 Struktur DNA Mitokondria pada Manusia ......................................... 11
Gambar 2.6 Nanospektrofotometer ........................................................................ 13
Gambar 2.7 Tahapan PCR ...................................................................................... 18
Gambar 2.8 Amplifikasi Eksponensial DNA pada PCR ........................................ 19
Gambar 2.9 Fase Kurva Amplifikasi PCR ............................................................. 21
Gambar 4.1 Kurva Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Babi, dan NTC
Menggunakan Primer Kambing ........................................................... 33
Gambar 4.2 Amplifikasi Simulasi Sampel A .......................................................... 35
Menggunakan Primer Babi................................................................... 36
Gambar 4.4 Amplifikasi Simulasi Sampel B .......................................................... 37
xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Kerangka Penelitian............................................................................ 46

Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA ............................................ 47
Lampiran 3 Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe............................ 52
Lampiran 4 Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer................................. 53
Lampiran 5 Campuran Reaksi Master Mix untuk Amplifikasi DNA .................... 54
Lampiran 6 Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI ................................ 55
Lampiran 7 Kurva Amplifikasi DNA Kontrol, Simulasi A (1), dan Simulasi A
(2) Mengunakan Primer Kambing ..................................................... 57
Lampiran 8 Kurva Amplifikasi DNA Kontrol, Simulasi B (1), dan Simulasi B
(2) Mengunakan Primer ..................................................................... 59
Lampiran 9 Gambar Alat dan Bahan yang Digunakan dalam Penelitian .............. 61
xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN
AFL : Arbitrary Fluorescence Level

ATP : Adenosine Triphosphate
CP : Crossing Point
dATP : Deoxyadenosine Triphosphate
dCTP : Deoxycytidine Triphosphate
dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate
DNA : Deoxyribonucleic Acid
dNTP : Deoxyribonuleaside Triphosphate
dTTP : Deoxythmidine Triphosphate
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid
kDa : Kilo Dalton
mtDNA : Mitochondrial Deoxyribonucleic Acid
NLS : Nuclei Lysis Soluition
PCR : Polymerase Chain Reaction
PPS : Protein Precipitation Solution
RNA : Ribonucleic Acid
rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid
RT-PCR : Real Time Polymerase Chain Reaction
Tm : Melting Temperature
tRNA : Transfer Ribonucleic Acid
SDS : Sodium Dedocyl Sulfate
UPL : Universal Probe Library
xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Makanan adalah kebutuhan esensial manusia. Makanan merupakan suatu
senyawa yang berfungsi sebagai nutrisi tubuh baik mikronutrisi maupun makronutrisi
yang penting bagi tubuh untuk dapat melangsungkan proses biokimia,
mempertahankan kehidupan, menstimulasi pertumbuhan, serta menghasilkan energi
(Pereira dan Vicente, 2012).
Salah satu sumber nutrisi dapat berasal dari daging hewan. Meskipun
berdasarkan data epidemiologi menunjukkan bahwa konsumsi daging berhubungan
dengan peningkatan resiko penyakit gangguan metabolik tergantung pada tingkat
kandungan kolesterol saturated fatty acid (SFA), namun konsumsi daging juga
penting untuk kesehatan seperti untuk menjaga jaringan syaraf dan mata selama fase
kehidupan manusia (Dario Pighin et al., 2016). Di antara jenis daging yang sering
dikonsumsi yaitu daging merah seperti daging sapi, daging kambing, dan daging babi.
Namun, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi keputusan seseorang untuk
memilih jenis daging yang dikonsumsi seperti faktor etnik, budaya, kesehatan,
ekonomi, dan agama.
Indonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman etnik, budaya, dan
agama. Beberapa agama seperti Islam, Hindu, dan Budha melarang untuk
mengonsumsi daging sapi atau babi serta produk turunannya. Beberapa produk
daging menjadi tabu untuk dikonsumsi. Saat ini, agama mayoritas di Indonesia adalah
Islam. Dalam Islam, terdapat konsep makanan yang dihalalkan dan diharamkan.
Makanan halal berarti makanan yang diizinkan di bawah hukum Islam, sebaliknya
haram berarti makanan yang dilarang di bawah hukum Islam (Laelasari, 2014).
Isu halal dalam makanan sangat penting dalam Islam. Kehalalan suatu produk
dinilai tidak hanya dari produk jadi, tetapi juga dari sumber material, proses
pengolahan, pengemasan, serta distribusi hingga siap dikonsumsi konsumen.
1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2
Kontaminan dapat terjadi secara sengaja (kecurangan pedagang) maupun tidak

sengaja (karena proses pengolahan).
Konsep halal telah terdapat dalam Al-Qur’an dan Sunnah. Salah satu Ayat Al-
Qur’an yang menyatakan keharusan mengonsumsi yang halal yaitu terdapat dalam
QS. Al-Baqarah: 168. Prinsip halal yang diterapkan dalam memilih makanan yaitu
memilih makanan yang hiegenis, aman, mempertimbangkan aspek kesehatan, dan
ramah lingkungan. Hal ini berarti prinsip halal dapat diterima tidak hanya untuk
Muslim, melainkan juga non-Muslim.
Saat ini kesadaran masyarakat akan pentingnya menjaga kesehatan semakin
meningkat. Salah satu aspek yang mempengaruhi kesehatan adalah makanan yang
dikonsumsi. Konsumen mulai mencari makanan yang dapat menjaga kesehatan,
mencegah penyakit, dan meningkatkan status mental dan kualitas hidup (Ahmad,
1996; Hasler, 1998; Milner, 1999; Poulsen, 1999). Isu kehalalan produk pangan
mempengaruhi kepercayan konsumen terhadap makanan yang dikonsumsi.
Ayat Al-Qur’an yang menyebut tentang beberapa jenis makanan yang
diharamkan antara lain terdapat dalam QS. Al-Baqarah:173, Al-Maidah: 3, dan An-
Nahl:115. Dalam QS. Al-Baqarah:173 dijelaskan bahwa daging babi dan daging yang
disembelih tidak sesuai syari’at Islam diharamkan untuk dikonsumsi kecuali dalam
keadaan terpaksa dan tidak melampaui batas. Oleh karena itu, telah jelas bahwa setiap
Muslim diharamkan mengonsumsi daging babi dan juga turunannya.
Alasan dasar keharaman ini adalah najis dan dapat menimbulkan efek
berbahaya. Hal ini menjadikan pentingnya perlindungan konsumen dari cemaran
daging babi terhadap jenis daging lain melalui sertifikasi halal untuk menjamin
kehalalan produk yang dikonsumsi. Di Indonesia, sertifikasi halal diberikan oleh
Majelis Ulama Indonesia (MUI). Namun, masih sering ditemukan kasus beredarnya
daging ilegal yang meresahkan masyarakat. Hal ini dilakukan pedagang untuk
meningkatkan omset penjualan karena daging babi jauh lebih murah dibandingkan
daging lainnya.
Kasus pencampuran dengan daging babi dapat terus meningkat jika tidak
ditangani dan diantisipasi dengan baik. Adanya pencampuran tersebut tidak hanya

3
melanggar aspek kehalalan tetapi juga dapat mengurangi nilai gizi yang terdapat pada
daging dan menimbulkan gangguan kesehatan terutama bagi individu yang
mengalami reaksi alergi pada daging babi. Campuran daging tersebut sulit untuk
dibedakan secara organoleptis serta memiliki kesamaan matriks jaringan yang sangat
kompleks.
Salah satu daging yang banyak terdapat di Indonesia dan dikonsumsi oleh
sejumlah luas populasi yaitu daging kambing. Tetapi, karena harganya yang relatif
lebih mahal dibandingkan beberapa jenis daging lain, daging kambing sering
dicampur dengan daging yang lebih murah seperti daging babi. Untuk itu, diperlukan
metode analisis yang cepat, sensitif, dan akurat untuk mengidentifikasi keaslian
daging kambing yang ada di pasaran sehingga dapat melindungi konsumen dari
produk ilegal untuk alasan ekonomi, agama, dan kesehatan akibat pencampuran atau
penukaran label produk.
Determinasi keaslian komponen produk merupakan analisis yang penting untuk
menjamin komposisi makanan. Saat ini telah berkembang teknik analis berbasis DNA
yaitu teknik real-time PCR. Teknik real-time PCR merupakan teknik analisis yang
sangat sensitif dan spesifik untuk deteksi dan kuantifikasi DNA dalam jumlah kecil,
efisien, dan cepat (Aw TG dan Rose JB, 2012). Selain itu, teknik molekular PCR dari
squens DNA target berpotensi untuk mengidentifikasi jenis sampel yang berbeda dan
juga sensitif untuk produk mentah maupun produk yang telah dimasak (Catuthraw,
2009; Fumiere et al., 2009; Yancy et al., 2009).
Identifikasi DNA sampel menggunakan real-time PCR memerlukan pewarna
fluoresens. Pewarna fluoresens yang sering digunakan yaitu SYBR Green dan
Hydrolysis Probe (Izzah, 2014). Pewarna lain yaitu Universal ProbeLybrary (UPL).
UPL probe memiliki fleksibelitas, ketersediaan, dan penerimaan yang sama seperti
SYBR Green, serta memiliki spesifisitas seperti Hydrolysis Probe (Roche®, 2009).
UPL probe mudah dirancang TaqMan real-time PCR assay sehingga dapat dilakukan
running pada kondisi PCR yang identik yang esensial untuk analisis real-time PCR
(Ishii, Satoshi et al., 2013).

4
Analisis real-time PCR juga memerlukan primer yang spesifik. Uji spesifisitas
primer dapat dilakukan dengan Database NCBI dipilih menu BLAST. Pengujian
spesifisitas primer dilakukan untuk menentukan kemampuan primer dalam
membedakan DNA. Untuk mengonfirmasi bahwa primer tersebut spesifik terhadap
spesies daging yang dianalisis, maka dilakukan pengujian menggunakan real-time
PCR. Pada kenyataannya, spesifisitas primer tersebut dipengaruhi oleh kondisi
running PCR termasuk konsentrasi primer dan probe yang digunakan (Akhmad,
2016).
Oleh karena itu, uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi kemungkinan adanya
cemaran daging babi terhadap daging kambing dengan teknik real-time PCR. Hasil
penelitian ini diharapkan dapat diaplikasikan untuk autentifikasi daging kambing
yang tercemar daging babi.
1.2 Rumusan Masalah

Penelitian tentang pengembangan metode uji autentifikasi daging kambing
terhadap cemaran daging babi mengunakan real-time PCR sangat penting dilakukan
mengingat belum adanya penelitian tersebut. Pengembangan metode ini dimaksudkan
untuk memberi informasi penggunaan primer dan probe, kondisi running real-time
PCR, sehingga diperoleh serangkaian metode yang optimal untuk autentifikasi daging
kambing.
1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian adalah mengautentifikasi daging kambing terhadap cemaran
daging babi menggunakan real-time PCR.
1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini yaitu tersedianya metode analisis untuk
mengidentifikasi kemungkinan adanya cemaran daging babi terhadap daging
kambing dengan teknik real-time PCR. Hasil penelitian ini diharapkan dapat
diaplikasikan untuk identifikasi kehalalan daging kambing.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Babi dan Keharamannya

Babi merupakan hewan mamalia sejenis ungulata yang masuk dalam famili
Suidae. Hewan ini berasal dari Eurasia. Keharaman babi telah dijelaskan dalam Al-
Quran sebagai sumber hukum Islam yang mutlak. Adapun salah satu ayat Al-Quran
yang menyebutkan keharaman babi yaitu QS. Al-Maidah ayat 3: "Diharamkan
bagimu (memakan) bangkai, darah, daging babi, (daging hewan) yang disembelih
atas nama selain Allah, yang tercekik, yang dipukul, yang jatuh, yang ditanduk, dan
yang diterkam binatang buas, kecuali yang sempat kamu menyembelihnya, dan
(diharamkan bagimu memakan hewan) yang disembelih untuk berhala." (QS. al-
Ma'idah [5]: 3).
Meskipun memiliki keragaman etnik dan geografi, setiap Muslim meyakini dan
mengikuti agama Islam. Segala sesuatu yang diharamkan dalam Islam berarti dilarang
dan tidak diizinkan dalam Islam (Riaz dan Chaudry, 2004). Sumber hukum Islam
yang paling utama yang menjadikan rujukan adalah Al-Quran. Namun, beberapa
ilmuan mempunyai upaya untuk menjelaskan atau justifikasi terkait pemahaman
keharaman babi dalam pandangan ilmiah (Riaz dan Chaudry, 2004).
Babi merupakan vektor patogenik cacing diantaranya Trichinella spiralis dan
Taenia solium untuk masuk ke dalam tubuh manusia. Infeksi yang disebabkan oleh
cacing tersebut berbahaya bagi kesehatan. Selain itu, komposisi asam lemak dari
lemak daging babi diketahui inkompatibel dengan lemak manusia dan sistem
biokimia (Awan, 1988; Hussaini dan Sakr, 1983; Sakr, 1993). Hal ini dapat
menimbulkan berbagai penyakit gangguan metabolisme seperti hiperkolesterolimia
yang dapat memicu penyakit kardiovaskular.
2.2 Sel
Semua organisme terdiri dari sel. Semua jaringan termasuk manusia
terorganisir dari kumpulan sel. Oleh karena itu, sel merupakan unit fundamental dari

6
kehidupan. Jika sel mati, jaringan juga akan mati dan tidak dapat berfungsi
(Chatterjea dan Shinde, 2012). Istilah sel pertama kali digunakan oleh Robert Hooke
pada tahun 1665, untuk menjelaskan struktur potongan tipis gabus di bawah
mikroskop. Setelah beberapa abad, istilah sel digunakan untuk menyatakan dasar
minimum suatu jasad hidup yang mampu melakukan perbanyakan sendiri (Yuwono,
2009).
Sel yang terdapat di alam dapat dibagi menjadi dua tipe yang secara struktural
berbeda yaitu sel prokariotik dan eukariotik. Sel prokariotik tidak memiliki nukleus
sehingga materi genetiknya (DNA) terkonsentrasi pada suatu daerah yang disebut
nukleoid tanpa membran nukleus yang membatasi daerah tersebut dengan organel
lainnya. Sedangkan sel eukariotik (gambar 2.1) memiliki nukleus sesungguhnya yang
dibungkus oleh membran nukleus (Chatterjea dan Shinde, 2012).
Gambar 2.1 Skema Representasi Sel Eukariotik dengan Organel Sel (Sumber:
Sherwood, 2010).
Semua sel tersusun atas komponen-komponen kimiawi utama yaitu protein,

asam nukleat, lemak, dan polisakarida. Asam nukleat merupakan suatu polimer
nukleotida yang berperan dalam penyimpanan serta pemindahan informasi genetik

7
dalam sel (Yuwono, 2009). Terdapat dua tipe asam nukleat dalam sel organisme yaitu
asam deoksiribonukleat atau DNA, dan asam ribonukleat atau RNA. Kedua asam
nukleat tersebut dapat dibedakan berdasarkan gula dan basa nitrogen penyusunnya
(Chatterjea dan Shinde, 2012). DNA yang terdapat pada nukleus disebut DNA
kromosomal, sedangkan DNA yang tidak terdapat di dalam sel dan di luar nukleus
yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA plasmid, ketiganya disebut DNA
ekstrakromosomal (Fatchiyah et al. 2011).
Baik DNA maupun RNA tersusun atas adenin, guanin, sitosin, tetapi timin
hanya ada pada DNA, sedangkan urasil hanya ada pada RNA. Pada DNA gulanya
adalah deoksiribosa, sedangkan pada RNA gulanya adalah ribosa. Perbedaan antara
kedua bentuk gula tersebut terletak pada atom karbon nomor 2 (Yuwono, 2009).
2.3 Deoxyribonucleic Acid (DNA)

2.3.1 Definisi DNA
Setiap sel hidup menyimpan informasi genetik dalam bentuk molekul DNA
Helix ganda-panjang, tidak bercabang, rantai polimer yang berpasangan, terbentuk
dari empat tipe monomer yang sama. Tiap rantai ini disebut sebagai DNA chain, atau
DNA strand. Rantai tersebut bersifat antiparalel terhadap rantai yang lain, dan ikatan
hidrogen antara basa dari nukleotida menghubungkan kedua rantai tersebut.
Monomer DNA disebut sebagai nukleotida, yang teridiri dari molekul gula pentosa
(deoksiribosa), gugus fosfat, dan basa nitrogen. Basa nitrogen tersebut dapat berupa
adenin (A), guanin (G), sitosin (C), atau timin (T) (gambar 2.2). Nukleotida-
nukleotida ini kemudian tersambung dengan ikatan kovalen antara gula dan fosfat
rantai punggung gula-fosfat dengan seri basa yang menonjol (gambar 2.3) (Albert et
al., 2015).
Adenin Guanin

8
Timin Sitosin
Gambar 2.2 Struktur Basa Nitrogen DNA (Sumber: Chatterjea dan Shinde, 2012).
Gambar 2.3 Struktur DNA Double Helix (Albert et al., 2015).
Ikatan antarnukleotida menghasilkan rantai DNA dengan polaritas kimia. Gula

sebagai block memiliki gugus fosfat pada posisi karbon 5’, gugus hidroksil pada
posisi karbon 3’, dan basa pada posisi karbon 1’. Hal ini menjadikan subunit DNA
memiliki orientasi yang sama. Polaritas rantai DNA diindikasikan oleh ujung-3’ dan
ujung-5’, turunan dari orientasi gula deoksiribosa (Albert et al., 2015). Struktur DNA
double helix terbentuk karena basa nitrogen masing-masing nukleotida dalam satu

9
rangkaian berpasangan dengan masing-masing nukleotida dalam rangkaian lainnya

melalui ikatan hidrogen (Gaffar, 2007). Basa dengan dua cincin (purin) berpasangan
dengan basa dengan tiga cincin (pirimidin): adenin (A) selalu berpasangan dengan
timin (T), dan guanin (G) dengan sitosin (C). Pasangan A dan T terbentuk dengan dua
ikatan hidrogen, sedangkan G dan C dengan tiga ikatan hidrogen (Albert et al., 2015).
2.3.2 Sifat Fisika DNA

Dua untai DNA double helix dapat dipisahkan atau dibuka selama proses
replikasi DNA, transkripsi RNA, dan rekombinasi genetik. Pemisahan untai ganda
DNA dapat dilakukan secara in vitro dan disebut denaturasi DNA. Denaturasi terjadi
ketika ikatan hidrogen antara basa-basa nitrogen terputus dan pasangan basa terpisah
ketika DNA diberi perlakuan dengan suhu leleh. Temperatur ketika DNA
terdenaturasi separuhnya disebut melting temperature (Tm DNA). Pada temperatur
ini, absorbansi DNA pada 260 nm meningkat menjadi 18,5%, yaitu separuh dari 37%
absorbansi DNA terdenaturasi sempurna. Fenomena ini disebut sebagai efek
hiperkromik (Chatterjea dan Rana, 2012).
Nilai Tm tergantung pada komposisi molekul DNA dan kondisi yang digunakan
untuk melakukan denaturasi. Jika DNA berada dalam larutan yang kurang lebih sama
dengan kondisi fisiologi sel, maka nilai Tm berkisar 85-95°C. Oleh karena itu, dalam
kondisi fisiologis sel yang normal molekul DNA bersifat stabil. Namun, ada beberapa
hal yang menentukan nilai Tm suatu molekul DNA (Yuwono, 2009).
Nilai Tm tergantung pada jumlah pasangan basa G-C karena ikatan G-C
mempunyai 3 ikatan hidrogen sehingga lebih stabil daripada A-T yang hanya
mempunyai dua ikatan hidorogen. Ketergantungan nilai Tm terhadap komposisi basa
bersifat linear, yaitu meningkat 0,4° untuk tiap persen peningkatan kandungan G-C.
Selain ditentukan oleh kandungan G-C, nilai Tm juga dipengaruhi oleh kondisi
denaturasi yaitu kekuatan ionik larutan. Nilai T m meningkat 16,6° untuk tiap sepuluh
kali peningkatan konsentrasi kation monovalen. Namun, terdapat senyawa yang dapat
menurunkan nilai Tm yaitu urea dan formamide. Formamide dapat menurunkan nilai
Tm sampai sekitar 40°C. Urea dan formamide dapat membentuk ikatan hidrogen

10
dengan basa-basa DNA dan berkompetisi untuk membentuk pasangan (Yuwono,

2009).
Faktor lain yang dapat menyebabkan denaturasi DNA yaitu derajat keasaman
(pH) yang ekstrem (pH<3 atau pH>10) dan perbandingan kandungan antara basa
nukleotida G-C terhadap A-T. Tingginya kandungan G-C akan memperlambat proses
denaturasi molekul DNA. Sebaliknya, kandungan A-T akan menyebabkan pita DNA
mudah putus/patah (Fatchiyah et al. 2011).
Denaturasi DNA merupakan suatu proses yang dapat balik (reversible) dalam
kondisi yang sesuai. Proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan
terdenaturasi disebut renaturasi. Renaturasi dapat terjadi jika konsentrasi garam
(NaCl) di dalam suspensi DNA cukup tinggi yaitu 0,15-0,15 M. Ion Na+ yang bersifat
positif dapat menetralkan gugus fosfat DNA yang bermuatan negatif sehingga tidak
terjadi saling tolak-menolak antara untaian DNA yang satu dengan untaian DNA
yang lain. Suhu renaturasi juga harus cukup tinggi tetapi harus di bawah suhu
denaturasi, biasanya sekitar 20-25°C di bawah nilai Tm (Yuwono, 2009).
2.3.3 DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan pusat produksi energi di dalam sel. Mitokondria
(gambar 2.4) biasanya terdapat dalam jumlah banyak didalam sel dan polimorfis, dan
bentuknya tergantung pada keseimbangan antara fusi dan fisi masing-masing
mitokondria (Herman, dan Shaw, 1998). Mitokondria merupakan tempat terjadinya
fosforilasi oksidatif yang penting untuk memproduksi ATP. ATP sangat penting
dalam berbagai fungsi biokimia. Mitokondria memiliki genom subselular organel
yang terpisah dari kromatin nuklear, disebut DNA mitokondria (mtDNA), yang
sangat umum digunakan dalam studi filogenetik molekular (Moritz et al., 1987).
Molekul DNA mitokondria (mtDNA) berukuran lebih kecil daripada kromosom
nuklear. Pada sel hewan, mtDNA berukuran lebih kecil dari 20000 bp (16596 bp ada
manusia) dan merupakan dupleks yang sirkular. Tiap mitokondrion biasanya
memiliki 2 hingga 10 kopi molekul mtDNA, dan jumlahnya dapat meningkat hingga
ratusan ketika sel mengalami diferensiasi pada masa embrio (Nelson dan Cox, 2005).

11
Gambar 2.4 Mitokondrion. Beberapa protein mitokondrial dan RNA dikode oleh
salah satu dari kopi DNA mitokondria (Sumber: Nelson dan Cox, 2005).
Gambar 2.5 Struktur DNA Mitokondria pada Manusia (Sumber: Passarge, 2007).
Umumnya, mtDNA hewan memiliki jenis gen yang sama yaitu mengandung 13
gen yang mengkode protein fosforilasi (URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6,
URFA6L, URF4L, Cytochrome oxidase unit I, Cytochrome oxidase unit II,
Cytochrome oxidase unit III, Cytochromeb, dan ATPase 6); 2 gen pengkode rRNA
yaitu 12S rRNA dan 16S rRNA; dan 22 gen pengkode tRNA yang diperlukan untuk
translasi protein yang dikode oleh mtDNA (Keddie et al., 1998; Solihin, 1994).

12
Sejumlah gen mtDNA digunakan sebagai target untuk mendeteksi atau

mengisolasi spesies hewan yang berbeda dalam bentuk daging. Beberapa hal yang
mendukung penggunaan mtDNA sebagai target untuk analisis dibandingkan DNA
nukleus yaitu mtDNA memiliki ribuan kopi per sel dan memiliki beberapa titik
mutasi yang membedakan spesies yang berdekatan. DNA mitokondria merupakan
warisan maternal dan oleh karena itu bebas dari heterozigositas (Lockley and
Bardsley, 2000).
2.3.4 Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA.
DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel, yaitu pada
mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah
laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan
dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain. Pada saat
melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak rusak dan didapatkan DNA dalam
bentuk rantai yang panjang (Fatchiyah et al. 2011).
Tahap pertama isolasi DNA yaitu proses pengeluaran DNA dari nukleus,
mitokondria, maupun organel lain dengan cara diekstraksi atau dilisiskan, biasanya
dilakukan dengan penambahan bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA
rusak. Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolat DNA yang
murni ditambahkan yaitu fenol, kloroform, dan isoamilalkohol (Fatchiyah et al.
2011).
Tahap berikutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau
kontaminan yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain
termasuk debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi. Kontaminan yang biasa
ditemukan di antaranya adalah polisakarida yang dapat mengganggu proses lanjutan
seperti PCR, di mana terjadi hambatan aktivitas Taq polimerase, atau kontaminan
lainnya yaitu polifenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA secara
kovalen. Untuk menghindari terjadinya hal ini, maka jaringan yang digunakan dijaga
tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi (Fatchiyah et al. 2011).

13
Tahap berikutnya adalah proses presipitasi DNA dengan menggunakan etanol

absolut atau isopropanol. Selain DNA, semua bahan yang lain akan larut dalam etanol
dingin. Dengan demikian, saat dilakukan sentrifugasi, maka DNA akan mengendap
dan terpisah dari senyawa-senyawa atau bahan lain (Fatchiyah et al. 2011).
2.3.5 Uji Kuantitatif DNA

Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis (gambar 2.6) merupakan
salah satu spektrofotometer UV-Vis yang mempunyai teknologi nano, DNA yang
murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena adanya basa purin dan basa
pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 260
nm, sedangkan kontaminan protein atau fenol akan menyerap cahaya pada 280 nm,
sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm
dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA
berkisar 1,8-2,0. Untuk mengukur konsentrasi DNA, digunakan rumus sebagai
berikut (Fatchiyah et al. 2011).
[DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran
Keterangan
Å260 = nilai absorbansi pada 260 nm
50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 µg untai ganda
DNA per ml.
Gambar 2.6 Nanospektrofotometer (Sumber: Fatchiyah et al. 2011).
2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi polymerase atau dikenal sebagai polymerase chain reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara

14
in vitro. Metode PCR dapat dapat meningkatkan jumlah urutan DNA sebanyak ribuan
bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 10 6-107 kali. Setiap urutan basa
nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus
PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan
PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target
dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target (Fatchiyah et al. 2011).
2.4.1 Komponen PCR

Pada reaksi PCR diperlukan cetakan DNA, primer spesifik, enzim DNA
polimerase yang termostabil, bufer PCR, ion Mg2+, dan gene cycler (Fatchiyah et al.
2011).
a. Cetakan DNA
Ukuran target amplifikasi DNA biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp)
atau 1 kB. Hasil amplifikasi yang efisien adalah antara 100-400 bp. Walaupun
kemungkinan hasil amplifikasi lebih dari 1 kB, tetapi prosesnya kurang efisien,
karena produk yang panjang rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja
enzim DNA polimerase, dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini dapat
menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan (Fatchiyah et al. 2011).
Kemurnian DNA target sangat penting, karena ketidakmurnian suspensi DNA
dapat mempengaruhi reaksi amplifikasi dan dapat menghambat kerja enzim DNA
polimerase. Namun, pada kondisi tertentu, amplifikasi PCR masih dapat bekerja
dalam suspensi kasar. Pemilihan target yang akan diamplifikasi perlu memperhatikan
kestabilan genetik dari daerah/urutan nukleotida yang ditargetkan. Perubahan atau
hilangnya sebagian urutan target akan berakibat pada hilangnya reaktivitas. Elemen
genetik bisa hilang saat isolasi atau pemindahan serial. Sebaiknya amplifikasi segera
dilakukan setelah isolasi DNA telah selesai (Fatchiyah et al. 2011).
b. Primer

15
Primer disusun dari urutan nukleotida yang dapat didownload dari pusat
GeneBank, dan dapat disintesis berdasarkan susunan nukleotida yang sudah tersusun
dan telah ditentukan. Ketentuan penyusunan primer adalah primer disusun dari urutan
nukleotida sepanjang 15-32 bp pada ujung-5’ pita DNA cetakan maupun
komplemennya (Fatchiyah et al. 2011).
Suhu annealing sangat tergantung pada primer dengan Tm tertentu. Penentuan
formula primer ditentukan secara teoritikal oleh T m asam nukleat sebagai berikut.
Tm = 2°C (A+T) + 4°C (G+C)
TA* = Tm - 5°C
Keterangan:
Tm = mealtingtemperature (°C)
* Suhu annealing yang digunakan biasanya 5°C dibawah T m (Muladno, 2010).
c. Taq DNA Polimerase

Enzim ini bersifat termostabil dan diisolasi dari Thermos aquaticus. Aktivitas
polimerisasi DNA dari ujung-5’ ke ujung-3’, dan aktivitas enzimatik ini mempunyai
waktu paruh sekitar 40 menit pada suhu 95°C. Biasanya untuk setiap 100 µl volume
reaksi, ditambahkan 2,0-2,5 unit Taq polimerase. Penggunaan enzim ini harus
memperhatikan proses penyimpanan (selalu di freezer pada suhu -20°C), dan pada
saat pengambilan tidak boleh terlalu lama dalam suhu ruang, usahakan selalu dalam
kotak berisi water-ice agar suhu tetap 4°C. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan
kerusakan enzim yang mungkin terjadi akibat pengaruh perubahan suhu (Fatchiyah et
al. 2011).
d. Bufer PCR dan Konsentrasi Mg2+

Bufer standar untuk PCR terdiri atas 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8,3), dan
1,5 mM MgCl2. Bufer standar ini bekerja dengan baik untuk cetakan DNA dan
primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimal dengan kombinasi yang
lain.

16
Konsentrasi ion magnesium dalam bufer PCR merupakan faktor yang sangat
kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, suhu
disosiasi untai cetakan DNA, dan produk PCR. Konsentrasi optimal ion magnesium
sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi cetakan DNA yang tidak mengandung
konsentrasi agen pengkhelat yang tinggi, seperti EDTA atau fosfat. Ion Mg 2+ bebas
yang terlalu rendah atau tidak ada, biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR,
sedangkan bila terlalu banyak akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.
e. Nukleotida (dNTP)
Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 µM. Pada
konsentrasi ini, penting untuk mengatur konsentrasi keempat dNTP pada titik
estimasi Km yaitu untuk setiap dNTP 50 mM, harus selalu diatur pH 7,0. Konsentrasi
yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polimerase,
sedangkan pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifisitas yang
tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan
tidak akan mengubah secara bebas.
f. PCR Gene Cycler

PCR gene cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan PerkinElmer
sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi sebagai macam tipe alat
PCR gene cycler dari berbagai perusahaan. Walaupun nama alat berbeda, tetapi
prinsip kerjanya sama.
Alat ini secara tepat meregulasi suhu dan siklus waktu yang dibutuhkan untuk
reprodusibilitas dan keakuratan reaksi amplifikasi. Siklus PCR terbagi atas tiga
langkah utama, yaitu denaturasi DNA (92-95°C, selama 30-60 detik), primer
annealing (50-62°C, selama 30-60 detik), dan ekstensi (70-72°C, selama 30-120
detik). Siklus ini berulang 30-35 kali. Siklus utama ini diawali terlebih dahulu dengan
denaturasi awal, misalnya 94°C selama 5 menit. Langkah ini dilakukan untuk
memaksimalkan proses denaturasi tidak sempurna akan menyebabkan kegagalan

17
proses PCR. Setelah siklus utama berakhir, maka ditambah program ekstensi final
dengan suhu 70-72°C, selama 7-10 menit.
2.4.2 Tahapan PCR

Proses PCR merupakan siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing,
dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase (gambar 2.7). Sepasang primer
oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’
menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang
diinginkan (Fatchiyah et al. 2011).
a. Denaturasi
Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses
PCR. Suhu yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA
menjadi dua untai cetakan DNA tunggal. Suhu pada tahap denaturasi adalah 92-95°C
selama 30-60 detik, dengan suhu 94°C merupakan pilihan standar (Fatchiyah et al.
2011).
b. Annealing
Pada langkah ini, terjadi proses pengenalan/penempelan primer cetakan DNA,
suhu annealing ditentukan oleh susunan primer. Optimalisasi suhu annealing dimulai
dengan menghitung melting temperature (Tm) dari ikatan primer dan cetakan DNA,
sedangkan suhu annealing (TA) adalah 5°C lebih kecil dari T m primer yang
sebenarnya. Amplifikasi akan lebih efisien apabila suhu annealing tidak kurang dari
37°C agar tidak terjadi mispriming. Oleh karena itu, pada suhu sekitar 55°C akan
dihasilkan amplifikasi produk yang mempunyai spesifisitas yang tinggi. Primer ini
akan menempel pada urutan nukleotida yang sesuai dengan urutan primer itu sendiri,
dan menempel pada suhu posisi ujung-5’ dari untai DNA target yang telahterurai
pada proses sebelumnya (Fatchiyah et al. 2011).
c. Ekstensi

18
Pada langkah ini, terjadi proses polimerisasi untuk pembentukan untai DNA
baru, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA
target yang akan bergerak dari ujung-5’ menuju ujung-3’ dari untai tunggal DNA.
Waktu yang dibutuhkan tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang
digandakan sebagai produk amplifikasi. Pada setiap satu kilobase (1000 bp) yang
akan diamplifikasi diperlukan waktu 1 menit; bila kurang dari 500 bp, hanya
diperlukan waktu 30 detik; dan pada kisaran 500 tetapi kurang dari 1 kb, akan
memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya. Adapun suhu ekstensi yaitu 70-72°C
(Fatchiyah et al. 2011).
Gambar 2.7 Tahapan PCR (Sumber: Chatterjea dan Shinde, 2012).
Ketiga tahapan tersebut terjadi dalam satu siklus. Setelah tiap siklus, strand
DNA baru yang telah disintesis menjadi template dalam siklus berikutnya seperti
yang terlihat pada gambar 2.8. Produk mayor dari reaksi eksponensial ini adalah

19
segmen dari doble-stranded DNA yang ujungnya berupa ujung-5’ dari dua primer
dan panjangnya merupakan jarak antarprimer. Setelah amplifikasi, jumlah kopi akhir
target sequence yaitu dinyatakan dalam rumus berikut:
(2n-2n)x
di mana n merupakan jumlah siklus, 2n merupakan produk pertama yang dihasilkan
setelah siklus pertama dan produk kedua dihasilkan setelah siklus kedua dengan
panjang yang tak ditentukan batasnya dan x adalah jumlah kopi dari original
template. Biasanya, setelah siklus 30 PCR akan menjadi sekitar 230 kali amplifikasi,
diasumsikan efisiensi 100% selama tiap siklus. Efisien PCR akan bervariasi dari
template ke template dan sesuai dengan optimasi yang dilakukan (Lazaro dan
Hernandez, 2013).
Gambar 2.8 Amplifikasi Eksponensial DNA pada PCR (Sumber: Lazaro dan
Hernandez, 2013).
2.5 Real-time PCR

Real-time PCR memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan metode PCR
konvensional, di antaranya lebih cepat, tingkat kontaminasi lebih rendah, lebih
sensitif, spesifisitas tinggi, dan standardisasi lebih mudah. Real-time PCR digunakan

20
untuk uji kuantitatif RT-PCR yang dikombinasikan dengan perlengkapan yang relatif
dan kompetitif RT-PCR sehingga akurat, presisi, dan relatif mudah digunakan. Real-
time PCR secara otomomatis melakukan amplifikasi produk reaksi untuk tiap sampel
dalam setiap siklus. Data analisis berupa standard curve generation dan kalkulasi
jumlah kopi, yang ditampilkan secara otomatis (Chatterjea dan Shinde, 2012).
Umumnya, real-time PCR didasarkan pada deteksi fluoresens yang dihasilkan
oleh molekul reporter yang mengikat double-strand DNA yang meningkat sebagai
hasil reaksi. (Garrido et al., 2009). Sinyal fluoresens akan meningkat seiring dengan
bertambahnya amplifikasi DNA PCR dalam reaksi. Reaksi selama fase eksponensial
dapat dipantau dengan mencatat jumlah emisi fluoresens pada setiap siklus.
Peningkatan hasil amplifikasi PCR pada fase eksponensial berhubungan dengan
jumlah inisiasi target gen. Makin tinggi tingkat ekspresi target gen maka deteksi
emisi fluoresens makin cepat terjadi (Pardal, 2010).
Kuantitas urutan DNA target dicapai dengan menentukan jumlah siklus
amplifikasi. Jumlah siklus amplifikasi diperlukan untuk menghasilkan produk PCR
berdasarkan fluoresensi di awal fase eksponensial PCR serta untuk melewati garis
ambang fluoresensi/siklus threshold (Ct). Jumlah siklus yang diperlukan untuk
mencapai ambang batas disebut Ct. Siklus Ct adalah prinsip dasar dari real-time PCR
dan sebagai bagian yang sangat penting untuk memperoleh data yang akurat. Nilai Ct
real-time PCR sangat berkorelasi dengan kuantitas urutan DNA target (Giglio et al.
2003).
Kurva amplifikasi pada real-time PCR terdiri dari tiga fase yang berbeda
(gambar 2.9). Fase pertama disebut fase inisiasi, yang terjadi selama siklus PCR
pertama ketika pancaran fluoresens tidak bisa dibedakan dari baseline. Selama fase
eksponensial atau fase log, terjadi peningkatan eksponensial fluoresens, sebelum fase
plateau tercapai. Pada fase terakhir, reagen telah berhenti bereaksi, dan tidak ada
peningkatan fluoresens yang teramati. Hanya pada fase eksponensial memungkinkan
untuk kuantifikasi (Lazaro dan Hernandez, 2013).
Terdapat dua metode umum untuk menganalisis produk dalam real-time PCR,
yaitu: pertama, pewarna fluoresens non-spesifik yang berinterkalasi dengan double-

21
stranded DNA, contoh pewarna metode ini yaitu SYBR Green Dye; dan kedua, probe
sequence-specific DNA yang terdiri dari oligonukleotida yang dilabeli dengan
reporter fluoresens yang mendeteksi hanya setelah hibridisasi probe dengan sequence
komplementer, contohnya yaitu TaqMan Probe. Umumnya, metode sequence specific
memiliki tingkat spesifisitas yang lebih tinggi (Pelosi et al., 2013).
Saat ini, terdapat telah metode Universal ProbeLibrary, yaitu metode yang
didasarkan pada hanya 165 short hydrolysis probe yang dilabeli pada ujung-5’
dengan fluorescein (FAM) dan pada ujung-3’ dengan dark quencher dye. Luas
cakupan trankrip UPL probe yaitu hanya 8-9 nukleotida dan sequence yang telah
dipilih. Untuk menjaga spesifisitas dan T m proses hibridisasi real-time PCR probe
memerlukan locked nucleic acids (LNA) yang ternkoporasi ke dalam sequence tiap
UPL probe. LNA merupakan analog DNA nukleotida dengan kekuatan binding lebih
tinggi dibandingkan DNA nukleotida standar (Roche, 2009).
Gambar 2.9 Fase Kurva Amplifikasi PCR. Merah: kurva amplifikasi sampel positif.
Biru: threshold. Hitam: baseline. (Sumber: Lazaro dan Hernandez, 2013).

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Analisis Obat, Laboratorium
Kimia Analisis Pangan dan Obat Halal, Laboratorium Penelitian II, Laboratorium
Biologi, dan Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran dan Imu Kesehatan
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.1.2 Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Februari 2017 hingga Juli 2017.
3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Real-time PCR (LightCycler® 480-Roche); multiwell plate 96 (Roche);
collection tube 1,5 ml; spektrofotometer UV DNA (DeNovix®); timbangan analitik;
mikrotips 10 µl, 200 µl, dan 1000 µl (Genfollower); mikropipet 0,5-10 µl (1660550-
Biorad); mikropipet 20-200 µl (Biorad); mikropipet 100-1000 µl (1660553-Biorad);
PCR tube dan microcentrifuge tube volume 1,5 µl (Biogenix); microcentrifuge
(Wiggenhauser); vortex (Wiggenhauser); filter tube; pisau steril; aluminium foil;
autoklaf ; blender; dan alat gelas (Pyrex).
3.2.2 Bahan
Daging kambing segar dan daging babi segar; satu set Genomic DNA
Purification Kit (Wizard®-Promega) (meliputi; Nucleic Lysis Solution, RNase,
Protein Precipitation Solution, DNA Rehidration Solution); LC 480 Probe Master
(terdiri dari: Fast Start Taq DNA Polymerase, dNTP mix, MgCl2 6,4 mM); aqua
bidest (IKA Pharmindo); isopropanol dan etanol 70% (Merck); primer (Macrogen®)

23
dan UPL (Roche®) babi seperti yang digunakan Vesty (2017), sedangkan primer
(Macrogen®) dan UPL (Roche®) diperoleh dari software ProbeFinder (tabel 3.1).
Tabel 3.1 Primer (Macrogen®) dan UPL (Roche®)

Nama Primer Urutan Basa
Kambing Forward 5’-CGCCGTATTCCTGTTAGCTT-3’
Reverse 5’-ACCAGGGTTGGTAAATCTCGT-3’
UPL 5’-(FAM)-CAGCCACC-3’
Babi Forward 5’-TGGGGTGTTTAGTGGGTTTG-3’
Reverse 5’-TCCTTGTACTATTCTCACCAGACCT-3’
UPL 5’-(FAM)-GACCCAGA-3’
3.3 Alur Kerja

a. Preparasi sampel
b. Isolasi DNA
c. Analisis isolat DNA
d. Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI
e. Amplifikasi DNA Menggunakan Real-time PCR
3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Preparasi Sampel
Masing-masing daging segar dipotong halus dengan pisau steril yang berbeda
untuk tiap sampel. Kemudian sampel diblender satu per satu hingga sangat halus,
setiap selesai diblender, blender dicuci bersih untuk menghindari kontaminasi.
Sampel yang telah halus ditimbang sebanyak 20 mg dan dimasukkan dalam tube.
3.4.2 Isolasi DNA

DNA diisolasi menggunakan Wizard® Genomic DNA Purification Kit
(Promega). Metode isolasi DNA mengikuti metode Vesty (2017).

24
a. Pelisisan Sel
Sampel sebanyak 20 mg ditambahkan 600 µl Nucleic Lysis Solution.
Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi pada suhu 65°C selama 30 menit.
b. Pemisahan RNA dan Presipitasi Protein

Campuran yang telah diinkubasi ditambahkan 3 µl RNase Solution dan
dihomogenkan serta diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Campuran tersebut
ditambahkan 200 µl Protein Precipitation Solution dan divortex, kemudian
didiamkan dalam ice selama 5 menit lalu disentrifugasi pada 13.000×g selama 4
menit.
c. Presipitasi dan Rehidrasi DNA

Supernatan dipindahkan ke dalam tube yang mengandung 600 µl isopropanol
pada suhu ruang dan dihomogenkan. Campuran dihomogenkan dan disentrifugasi
pada 13.000×g selama 1 menit. Supernatan dihilangkan dan ditambahkan 600 µl
etanol 70% lalu dihomogenkan. Campuran disentrifugasi pada 13.000×g selama 1
menit. Etanol dihilangkan dan pellet dibiarkan kering selama 15 menit. DNA
direhidrasi dalam 100 µl DNA Rehydration Solution selama 1 jam pada suhu 65°C.
3.4.3 Analisisis Isolat DNA

Isolat DNA dianalisis menggunakan spektrofotometer UV DNA (DeNovix ®)
untuk mengetahui kuantitas dan kemurnian isolat DNA. Isolat DNA diukur sesuai
protokol dari (DeNovix®) dengan cara pada layar spektrofotometer UV DNA
(DeNovix®) dipilih Nucleic Acid. Sample port dibersihkan dengan tisu steril.
Sebanyak 1 µl DNA Rehydration Solution sebagai blanko diteteskan pada sample
port. Sample port dibersihkan dengan tisu steril. Sampel isolat sebanyak 1 µl
diteteskan ke bagian sample port dan ditekan tombol measure. Kemudian akan
muncul data kemurnian dan kuantitas DNA.
3.4.4 Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI

25
Uji spesifisitas dilakukan dengan Database NCBI dipilih menu BLAST. Pada
halaman BLAST dipilih menu nucleotide blast. Kemudian data urutan primer yang
diuji dimasukkan dalam kolom Enter Query Squence. Selanjutnya, diklik tombol
BLAST.
3.4.5 Amplifikasi DNA Menggunakan Real-time PCR

a. Pembuatan Primer 50 µM dari Larutan Induk 100 µM
Larutan induk primer dengan konsentrasi 100 µM masing-masing dipipet
sebanyak 50 µl dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube volume 1,5 ml.
Selanjutnya, ke dalam masing-masing tube ditambahkan 50 µl aquabidest. Larutan
dihomogenkan dengan menaik-turunkan pegas pada mikropipet.
b. Pembuatan Primer 5 µM dari Larutan Induk 50 µM

Larutan induk primer dengan konsentrasi 50 µM masing-masing dipipet
sebanyak 3 µl dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube volume 1,5 ml.
Selanjutnya, ke dalam masing-masing tube ditambahkan 27 µl aquabidest. Larutan
dihomogenkan dengan menaik-turunkan pegas pada mikropipet.
c. Pembuatan Universal ProbeLybrary Master Mix

Semua proses pencampuran dan pemipetan dilakukan dalam ruang gelap.
Volume total master mix yang dibuat sesuai dengan penelitian Vesty (2017). Master
mix dibuat dengan volume total 20 µl yang terdiri dari 5 µl DNA sampel; 3,8 µl
aquabidest; 0,4 µl primer forward 10 µM; 0,4 µl primer reverse 10 µM; 0,4 µl UPL
10 µM; dan 10 µl LightCycler® 480 probe master (enzim Taq DNA Polymerase,
dNTPmix, dan 6,4 mM MgCl2).
d. Loading Sampel dan UPL Master Mix (Roche, 2009)

Sebanyak 5 µl DNA sampel dan 15 µl master mix dipipet kemudian
dimasukkan ke dalam multiwell plate. Selanjutnya campuran dihomogenkan dengan
menaik-turunkan pegas mikropipet dan ditutup dengan sealing foil.

26
e. Amplifikasi Real-time PCR

Program LyghtCycler® 480 Real-time PCR yang akan digunakan dipilih
Program Dual Color Hydrolysis Probe-UPL Probe 96-II seperti yang tertera pada
tabel 3.2.
Tabel 3.2 Pengaturan Program Amplifikasi Real-time PCR

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini merupakan analisis kualitatif untuk mengautentifikasi daging

kambing terhadap cemaran daging babi menggunakan real-time PCR. Dengan adanya
produk amplifikasi sebelum batas siklus amplifikasi yang telah ditentukan, dapat
dikatakan sampel positif mengandung DNA kambing atau DNA babi sesuai dengan
primer yang digunakan.
4.1 Analisis Isolat DNA

Prosedur isolasi DNA yang diharapkan adalah dapat menghasilkan DNA yang
memiliki kuantitas dan kualitas yang tinggi serta semurni mungkin untuk amplifikasi
dengan waktu pengerjaan yang efisien. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan
isolasi DNA menggunakan kit komersial. Keunggulan dari metode ini adalah
sederhana serta efisien baik tempat maupun waktu. Metode ini memiliki reagen yang
lengkap dan tidak membutuhkan banyak pelarut.
Prinsip isolasi DNA dengan kit komersial ini sama dengan isolasi DNA secara
umum. Tahapan isolasi DNA yaitu pengeluaran DNA dari nukleus dan mitokondria
dengan cara dilisiskan kemudian DNA dipisahkan dari kontaminan lain (Fatchiyah et
al., 2011). Pelisisan tersebut dilakukan dengan penambahan bufer lisis yaitu Nucleic
Lysis Solution berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barier dinding sel.
Senyawa kimia tersebut antara lain EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid), Tris
HCl, NaCl (Natrium Klorida), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) (Fatchiyah et al.,
2011; Utami et al., 2012).
EDTA berfungsi untuk melindungi DNA dari aktivitas endogenous nuclease
karena EDTA merupakan agen pengkhelat ion yang diperlukan sebagai kofaktor
sebagian besar nuclease dengan cara mengikat kation divalen (Muladno, 2010).
Sedangkan SDS merupakan deterjen kationik yang dapat melarutkan komponen lipid
dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada membran sel
(Kesmen et al., 2009).

28
Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau
kontaminan yang tidak diinginkan seperti RNA, protein, polisakarida, dan lipid.
Reagen yang digunakan untuk menghilangkan RNA adalah enzim RNase yang dapat
mendegradasi RNA tanpa merusak struktur DNA (Fatchiyah et al., 2011). Sedangkan
untuk mengendapkan protein ditambahkan Protein Precipitation Solution (PPS). PPS
biasanya mengandung garam berkonsentrasi tinggi seperti 0,25 M natrium asetat atau
0,1 M natrium klorida, ammonium asetat, ammonium sulfat; pelarut organik seperti
fenol, kloroform atau isoamil alkohol (Fatchiyah et al., 2011).
Proses presipitasi protein dengan penambahan garam dengan konsentrasi yang
tinggi mengakibatkan kelarutan protein akan turun dan mengendap jika konsentrasi
garam jenuh. Mekanisme ini dinamakan salting-out. Pada konsentrasi tinggi,
kekuatan ionik garam semakin kuat sehingga garam lebih dapat mengikat molekul
air. Dengan demikian, tidak cukup banyak air yang terikat pada protein sehingga gaya
tarik-menarik antarprotein lebih menonjol daripada antar air dan protein (Fatchiyah et
al., 2011). Sedangkan ketika ditambahkan pelarut organik, molekul air yang terikat
dengan protein berkurang, dan terjadi presipitasi protein. Pelarut organik mengurangi
konstanta dielektrik medium yang memicu presipitasi protein (Vasudevan et al.,
2011).
Pemisahan DNA dari presipitat protein yaitu dengan sentrifugasi (Fatchiyah et
al., 2011). Prinsip sentrifugasi didasarkan pada fenomena bahwa partikel yang
tersuspensi di dalam suatu wadah akan mengendap ke dasar suatu wadah karena
pengaruh gravitasi (Yuwono, 2009). Presipitat protein dibuang dan diambil bagian
supernatan.
Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan presipitasi DNA
dengan menggunakan isopropanol. Alternatif lain, yaitu dengan penambahan etanol
absolut. Isopropanol kurang polar dibandingkan etanol absolut sehingga separuh
volume isopropanol menghasilkan efisiensi presipitasi yang sama dengan etanol
absolut. Hal ini membantu untuk proses pengerjaan dengan volume sampel yang
banyak (Madhad dan Sentheil, 2014). DNA tidak larut dalam etanol maupun
isopropanol sehingga akan terjadi presipitasi DNA (Madhad dan Sentheil, 2014).

29
Dengan demikian, saat dilakukan sentrifugasi, maka DNA akan mengendap dan
terpisah dari senyawa-senyawa atau bahan lain (Fatchiyah et al., 2011). Beberapa
garam dan molekul kecil kurang larut dengan isopropanol sehingga perlu dilakukan
pencucian kembali dengan etanol 70% (Ausubel, 2003). Kemudian dilakukan
pencucian kembali DNA yang diperoleh dengan penambahan etanol 70%. Pelet DNA
dikeringkan dan diresuspensi dengan DNA Rehydration Solution yang mengandung
Tris HCl dan EDTA.
Isolat DNA yang diperoleh dianalisis menggunakan spektrofotometri UV DNA
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. DNA dapat menyerap cahaya UV pada
260 nm, sedangkan kontaminan protein akan menyerap cahaya pada 280 nm. Oleh
karena itu, kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm
dibagi 280 nm (Å260/Å280) dan nilai kemurnian DNA berkisar 1,8-2,0 (Fatchiyah et
al., 2011).
Tabel 4.1 Isolat DNA

No. Sampel Daging Konsentrasi Kemurnian
Kambing Babi (ng/µl) (Å260/Å280)
Kontrol
1 100% - 22,53 1,70
2 - 100% 6,36 1,75
Simulasi A
3 100% - 19,32 1,60
4 50% 50% 25,26 1,54
5 10% 90% 11,25 2,02
6 1% 99% 13,78 1,88
7 0,5% 99,5% 9,28 1,97
8 0,1% 99,9 11,67 1,80
Simulasi B
9 - 100% 10,86 1,96
10 50% 50% 25,26 1,54
11 90% 10% 21,25 1,50
12 99% 1% 35,26 1,80
13 99,5% 0,5% 14,11 1,61
14 99,9 0,1% 30,08 1,67

30
Pengukuran kemurnian DNA (tabel 4.1) menunjukkan bahwa DNA yang

dihasilkan dari metode kit komersial masih terdapat pengotor lain ditunjukkan oleh
nilai rasio Å260/Å280 di bawah 1,8. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh adanya
kontaminan protein karena kurangnya proses pencucian menggunakan isopropanol
(Akhmad, 2016). Isopropanol dapat meningkatkan kemurnian DNA dengan
mengoptimalkan proses pembuangan residu protein (Bettelheim et al., 2013). Namun,
isolat DNA yang memiliki kemurnian di atas 1,0 masih dapat diterima dan dapat
dilanjutkan ke proses amplifikasi pada real-time PCR (Kusumadewi et al., 2012).
Kadar isolat DNA terendah yang diperoleh 6,36 ng/µl. Konsentrasi isolat yang
rendah kemungkinan dikarenakan sampel yang digunakan berupa jaringan sehingga
DNA relatif lebih sulit diisolasi daripada DNA dari sampel cairan tubuh. Selain itu,
elemen genetik ini bisa hilang saat proses isolasi atau pemindahan serial (Fatchiyah et
al., 2011). Namun, konsentrasi isolat DNA tersebut masih dapat dilanjutkan hingga
ke tahap amplifikasi DNA pada real-time PCR. Hal ini dikarenakan real-time PCR
cukup sensitif dan dapat mendeteksi sampai dengan kadar 1 pg (Cai et al., 2011).
Pada kelompok simulasi A, campuran daging yang memiliki konsentrasi DNA
dari yang terbesar hingga yang terkecil berturut-turut yaitu daging kambing 50% >
100% > 1% > 0,1% > 10% > 0,5%. Sedangkan kelompok simulasi B yaitu daging
babi 1% > 0,1% > 50% > 10% > 0,5% > 100%. Masing-masing suspensi DNA
tersebut terdapat DNA kambing dan babi sehingga perbedaan konsentrasi tersebut
kemungkinan dapat mempengaruhi hasil amplifikasi DNA.
4.2 Analisis Uji Spesifisitas Primer

Penelitian ini mengunakan dua pasang primer yang berbeda. Masing-masing
primer dianalisis menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (NCBI) dan
ditentukan data spesies yang memiliki kecocokan 100% terhadap urutan sekuens
primer yang dianalisis (lampiran 5). Primer kambing yang digunakan didesain dengan
menggunakan software ProbeFinder (Roche®), sedangkan primer babi seperti yang
digunakan pada penelitian Vesty (2017), masing-masing dengan target gen DNA
mitokondria.

31
Beberapa hal yang mendukung penggunaan mtDNA sebagai target untuk

analisis dibandingkan DNA nukleus yaitu mtDNA memiliki ribuan kopi per sel dan
memiliki beberapa titik mutasi yang membedakan spesies yang berdekatan (Lockley
and Bardsley, 2000). Kecepatan mutasi yang sangat tinggi dari DNA mitokondria
(sepuluh kali lebih besar daripada DNA nukleus) membantu titik mutasi untuk
terakumulasi dengan sangat cepat, sehingga menghasilkan diskrimanasi presisi yang
lebih tepat (DiPinto et al., 2005).
Primer kambing yang digunakan yaitu untuk mengamplifikasi gen DNA
mitokondria daerah 12S rRNA. Gen 12S rRNA mengkode protein esensial
mitokondria sebagai rRNA yang diperlukan dalam translasi intramitokondria
(Andrews et al., 1999; Foury et al., 1998; dalam Legros et al., 2004). Desain primer
spesifik untuk gen mitokondria daerah 12S rRNA telah berhasil digunakan untuk
membedakan antara DNA daging kambing dan domba menggunakan PCR
konvensional dengan sensitivitas tinggi (Saderi et al., 2013). Hasil BLAST
menunjukkan bahwa kedua primer kambing yang digunakan memiliki kecocokan
100% dari primer forward dan reverse untuk kambing (Capra hircus) saja tidak
terhadap babi (Sus scrofa). Demikian pula primer babi forward dan reverse memiliki
kecocokan 100% untuk babi saja tidak terhadap kambing.
4.3 Amplifikasi DNA Menggunakan Primer Kambing dan Babi pada Real-
time PCR
Amplifikasi DNA dilakukan terhadap daging kambing, daging babi, dan
simulasi campuran antara daging kambing dan babi, menggunakan real-time PCR
dengan UPL probe. UPL probe diketahui telah berhasil digunakan dalam berbagai
studi qPCR (Segawa et al., 2013). UPL probe hanya terdiri 8-9 nukleotida dengan
dilabeli pewarna fluoresens (FAM) pada ujung 5’ dan quencher pada ujung 3’. UPL
probe memiliki fleksibelitas, ketersediaan, dan penerimaan yang sama seperti SYBR
Green, serta memiliki spesifisitas seperti Hydrolysis Probe (Roche®, 2009). UPL
probe mudah dirancang TaqMan real-time PCR assay sehingga dapat dilakukan

32
running pada kondisi PCR yang identik yang esensial untuk analisis real-time PCR
(Ishii, Satoshi et al., 2013).
Konsentrasi akhir UPL probe yang digunakan pada penelitian ini yaitu 0,2 µM
sesuai dengan rentang konsentrasi yang cocok untuk Hydrolysis Probe yaitu 0,05-0,2
µM. Konsentrasi probe optimal merupakan konsentrasi terendah yang menghasilkan
CP terendah dan fluoresens adekuat untuk konsentrasi target yang digunakan
(Roche®, 2009). Sedangkan konsentrasi akhir primer yang digunakan yaitu 0,1 µM,
masih dalam rentang konsentrasi primer yang direkomendasikan yaitu 0,05-0,3 µM
(Lazaro dan Hernandez, 2013). Hal ini sesuai didasarkan pada hasil optimasi Vesty
(2017).
Konsentrasi primer yang lebih tinggi dapat memicu terjadinya mispriming,
primer-dimer, dan terakumulasinya produk non-spesifik, sedangkan konsentrasi yang
terlalu rendah dapat mengakibatkan primer exhaustion (Lazaro dan Hernandez,
2013). Primer-dimer merupakan proses saling berikatannya primer yang
teramplifikasi dan terkuantifikasi sehingga menghasilkan data false-positive (Pestana
et al., 2010). Sedangkan mispriming adalah penempelan primer diluar sekuens DNA
target (Izzah, 2014). Munculnya primer-dimer dan produk non-spesifik dapat
dikurangi dengan optimasi kondisi running (Altshuler, 2006).
Analisis kurva amplifikasi dilakukan terhadap nilai CP (crossing point, siklus
PCR) yaitu siklus di mana fluoresens mencapai threshold. Hal ini berhubungan
dengan siklus di mana terjadi peningkatan fluoresens yang signifikan secara statistik
yang pertama kali terdeksi. Oleh karena itu, nilai CP berhubungan dengan jumlah
DNA yang terdapat pada sampel (Lazaro dan Hernandez, 2013). Semakin tinggi
DNA yang terekstrak maka semakin cepat mencapai garis basement-threshold saat
proses amplifikasi berjalan (Apllied Biosystems, 2015).
4.3.1 Ampilifikasi DNA Menggunakan Primer Kambing pada Real-time PCR

a. Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Babi, dan NTC Menggunakan
Primer Kambing

33
Pengujian spesifisitas primer perlu dilakukan untuk menentukan kemampuan

primer dalam membedakan DNA daging target dengan daging lain (Akhmad, 2016).
Untuk mengonfirmasi spesifisitas primer kambing, maka dilakukan amplifikasi
terhadap daging kambing (kontrol positif), daging babi (kontrol negatif), dan no
template control (NTC) sebagai blanko seperti yang tertera pada gambar 4.1.
Parameter yang diamati adalah pola kurva amplifikasi. Perpotongan kurva amplifikasi
yang dihasilkan dengan basement-threshold menghasilkan nilai CP. Spesifisitas
primer ditunjukkan oleh tidak adanya amplifikasi dari DNA lain, dalam hal ini DNA
dari daging babi (Akhmad, 2016).
Menggunakan Primer Kambing.
Keterangan: PK K (primer kambing terhadap daging kambing); PK B (primer kambing
terhadap daging babi); NTC (no template control).
Berdasarkan pola kurva amplifikasi (gambar 4.1), hanya DNA daging kambing
yang teramplifikasi, sedangkan DNA daging babi dan NTC tidak teramplikasi. Nilai
CP hanya muncul pada daging kambing yaitu 12,61. Hal ini mengindikasikan bahwa

34
primer kambing yang digunakan telah spesifik terhadap DNA daging kambing dan
tidak terjadi primer-dimer, mispriming, maupun produk non-spesifik.
Hasil analisis kurva amplifikasi telah sesuai dengan hasil BLAST yang
menunjukkan bahwa kecocokan 100% dari primer forward dan reverse untuk
kambing saja tidak terhadap babi. Kondisi running yang dipakai dapat mendeteksi
DNA daging kambing dengan hasil amplifikasi yang baik sampai siklus 45.
Sehingga, dapat dikatakan bahwa adanya produk hasil amplifikasi pada DNA daging
lain sebelum siklus ke-45 mengindikasikan hasil positif adanya daging kambing
(Akhmad, 2016). Primer kambing dapat digunakan untuk analisis selanjutnya.
b. Amplifikasi DNA Sampel Simulasi A Menggunakan Primer Kambing

Kelompok simulasi A terdiri dari campuran antara daging kambing dan daging
babi yang dibuat yaitu masing-masing dengan konsentrasi daging kambing 100%;
50%; 10%; 1%; 0,5%; dan 0,1%. Tujuan dari amplifikasi kelompok simulasi A
adalah untuk mengetahui kemampuan primer kambing dalam mendeteksi daging
kambing yang dicampur dengan daging babi.
Hasil amplifikasi (gambar 4.2) menunjukkan bahwa semua kelompok simulasi
A teramplifikasi. Sedangkan pada sampel babi 100% dan NTC tidak teramplifikasi.
Adapun nilai CP dari yang paling kecil hingga yang terbesar berturut-turut yaitu
14,88; 17,92; 21,85; 23,63; 24,00; 26,06 dengan konsentrasi daging kambing masing-
masing yaitu 100%; 50%; 10%; 1%; 0,5%; dan 0,1%.
Berdasarkan literatur, semakin tinggi DNA yang terekstrak maka semakin cepat
mencapai garis basement-threshold saat proses amplifikasi berjalan (Apllied
Biosystems, 2015). Semakin banyak amplikon yang terbentuk, maka akan semakin
meningkatkan akumulasi fluoresens yang terbaca. Akumulasi fluoresens tersebut
akan membentuk kurva sigmoidal (Akhmad, 2016).
Jika dihubungkan dengan hasil tahap konfirmasi spesifisitas primer kambing
(kontrol), adanya produk hasil amplifikasi pada DNA daging lain sebelum siklus ke-
45 mengindikasikan hasil positif adanya daging kambing. Dengan kata lain,

35
kelompok sampel A positif mengandung daging kambing. Primer kambing dapat

mendeteksi daging kambing 0,1% dalam campuran dengan daging babi.
Gambar 4.2 Amplifikasi Simulasi Sampel A.

Keterangan: NTC PK (no template control); PK B 100 (primer kambing terhadap daging babi
100%); PK K 100 (primer kambing terhadap daging kambing 100%); PK K 50 (primer
kambing terhadap daging kambing 50%); PK K 10 (primer kambing terhadap daging
kambing 10%); PK K 1% (primer kambing terhadap daging kambing 1%); PK K 0,5 (primer
kambing terhadap daging kambing 0,5%); PK K 0,1 (primer kambing terhadap daging
kambing 0,1%).
4.3.2 Ampilifikasi DNA Menggunakan Primer Babi pada Real-time PCR

a. Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Babi, dan NTC Menggunakan
Primer Babi
Amplifikasi DNA menggunakan primer babi dilakukan terhadap daging babi
(kontrol positif), daging kambing (kontrol negatif), dan NTC (blanko). Hal ini
bertujuan untuk mengonfirmasi spesifisitas primer babi yang digunakan. Hasil
amplifikasi (gambar 4.3) menunjukkan hanya daging babi yang teramplifikasi dengan
nilai CP yaitu 24,78.
Hasil amplifikasi mengindikasikan bahwa primer babi yang digunakan telah
spesifik terhadap DNA daging babi dan tidak terjadi primer-dimer maupun

36
mispriming. Hasil analisis kurva amplifikasi telah sesuai dengan hasil BLAST yang
menunjukkan bahwa kecocokan 100% dari primer forward dan reverse untuk babi
saja tidak terhadap kambing.
Menggunakan Primer Babi.
Keterangan: PB K (primer babi terhadap daging kambing); PB B (primer babi terhadap
daging babi); NTC PB (no template control primer babi).
Kondisi running yang dipakai dapat mendeteksi DNA daging babi dengan hasil
amplifikasi yang baik sampai siklus 45 (gambar 4.3). Oleh karena itu, dapat dikatakan
bahwa adanya produk hasil amplifikasi pada DNA daging lain sebelum siklus ke-45
mengindikasikan hasil positif adanya daging babi (Akhmad, 2016). Primer babi dapat
digunakan untuk analisis selanjutnya.
b. Amplifikasi DNA Sampel Simulasi B Menggunakan Primer Babi

Kelompok simulasi B terdiri dari campuran antara daging kambing dan daging
babi yang dibuat yaitu masing-masing dengan konsentrasi daging babi 100%; 50%;
10%; 1%; 0,5%; dan 0,1%. Tujuan amplifikasi kelompok simulasi B adalah untuk

37
mengetahui kemampuan primer babi dalam mendeteksi DNA daging babi dalam
campuran daging kambing dan babi dengan konsentrasi daging babi seperti yang
telah ditentukan. Hal ini didasarkan pada pola kurva amplifikasi (Akhmad, 2016).
Gambar 4.4 Amplifikasi Simulasi Sampel B.

Keterangan: NTC PB (no template control primer babi); PB K 100 (primer babi terhadap
daging kambing 100%); PB B 100 (primer babi terhadap daging kambing 100%); PB B 50
(primer babi terhadap daging babi 50%); PB B 10 (primer babi terhadap daging babi 10%);
PB B 1 (primer babi terhadap daging babi 1%; PB B 0,5 (primer babi terhadap daging babi
0,5%); PB B 0,1 (primer babi terhadap daging babi 0,1%).
Berdasarkan pola kurva amplifikasi (gambar 4.4), semua kelompok simulasi B

teramplifikasi. Sedangkan pada daging kambing 100% dan NTC tidak terjadi
amplifikasi. Nilai CP pada kelompok simulasi B dari yang terkecil hingga terbesar
berturut-turut yaitu 20,92; 22,89; 23,75; 30,76; 32,49; dan 32,90 dengan konsentrasi
daging kambing masing-masing yaitu 100%; 50%; 0,1%; 10%; 1%; dan 0,5%.
Secara teoritis, semakin tinggi DNA yang terekstrak maka semakin cepat
mencapai garis basement-threshold saat proses amplifikasi berjalan (Apllied
Biosystems, 2015). Namun, terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil
amplifikasi sehingga dapat memberikan hasil yang berbeda. Faktor tersebut antara

38
lain adanya pengaruh komponen lain, baik yang disebabkan karena pengaruh saat
isolasi DNA, pemindahan serial, maupun pengaruh saat proses amplifikasi real-time
PCR (Dadkhah et a.l, 2012; Camma et al., 2012). Hal ini diperkirakan sebagai faktor
yang mempengaruhi hasil amplifikasi yang telah diperoleh. Adapun konsentrasi DNA
campuran babi 0,1% yaitu 30,08 ng/µl; lebih besar dibandingkan babi 10% dan 0,5%
yaitu masing-masing 21,25 dan 14,11. Hal ini kemungkinan mempengaruhi nilai CP
campuran babi 0,1% muncul lebih awal.
Berdasarkan tahap konfirmasi spesifisitas primer babi, bahwa adanya produk
hasil amplifikasi sebelum siklus ke-45 dapat dikatakan positif adanya daging babi.
Jadi, dapat disimpulkan bahwa kelompok simulasi B positif mengandung daging
babi. Primer babi yang digunakan dapat mendeteksi campuran dengan daging babi
hingga konsentrasi daging babi 0,1%.

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan sebagai berikut.
a. Metode isolasi DNA menggunakan kit komersial dapat menghasilkan DNA
genom yang murni dan kuantitas yang cukup baik untuk analisis autentifikasi
daging kambing terhadap cemaran daging babi.
b. Analisis amplifikasi DNA menggunakan primer kambing dan primer babi
dengan target gen DNA mitokondria dapat digunakan untuk mengautentifikasi
daging kambing terhadap cemaran babi.
5.2 Saran
a. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan sampel daging kambing yang
beredar di pasaran tradisional.
b. Perlu dilakukan analisis kuantitatif pada simulasi campuran daging kambing
dan babi dengan konsentrasi yang lebih kecil untuk mengetahui limit
konsentrasi DNA daging yang dapat teramplifikasi.
c. Perlu dilakukan penentuan konsentrasi daging kambing berdasarkan analisis
nilai CP pada kurva amplifikasi.

DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, S. 1996. Research and Development on Functional Foods in Malaysia.

Nutrition Reviews. Vol. 54 No.11, p. S169.
Akhamd, Murtaqi Arif. 2016. Pengembangan Analisis Listeria monocytogenes untuk
Jajanan Pempek Dengan Real-time Polymerase Chain Reaction(RT-PCR).
Thesis. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Alberts, Bruce et al.. 2015. Molecular Biology of The cell 6th Edition. New York:
Garland Science.
Altshuler ML. 2006. PCR Troubleshooting: The Essential Guide. Caister Academic
Press. Moscow.
Applied Biosystems (AB). 2015. Essentials of Real Time PCR. US.
Ausubel, F. M. et al. 2003. Current Protocols in Molecular Biology. USA: John
Willey & Sons, Inc.
Awan, J. A. 1988. Islamic Food Laws. I. Phylosophy of the Prohibition of Unlawful
Foods. Sci. Technol. Islam. World, 6(3), 151.
Aw, T.G., dan Rose, J.B.2012. Detection of Phatogens in Water: from Phylochips to
qPCR to Pyrosequencing. Curr. Opin. Biotechnol. 23: 422-430.
Bettelheim FA, et al.. 2013. Introduction to General, Organic, and Biochemistry.
Australia: Brooks/Cole.
Bintang, Maria. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga.
Bridge,D., Cunningham,C.W., Schierwater,B., Desalle, R. and Buss, L.W.1992.
Class-Level Relationships in the Phylum Cnidaria: Evidence from
Mitochondrial Genome Structure. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89, 8750–8753.
Cai, H. et al.. 2012. Real-time PCR Assays for Detection and Quantitation of Porcine
and Bovine DNA inGelatine Mixtures and Gelatin Capsules. USA: Journal of
Food Composition and Analysis. 25:83-87.
Camma C, Domenico MD, Monaco F. 2012. Development and Validation of Fast
Real-time PCR Assays for Species Identification in Raw and Cooked Meat
Mixtures. Food Control. 23: 400-404.

41
Cawthraw, S., Saunders, G. C., Martin, T. C., Sawyer, J., Windl, O., & Reaney, S. D.
2009. Real-time PCR Detection and Identification of Prohibited Mammalian
and Avian Material in Animal Feeds. Journal of Food Protection. 72,
1055e1062.
Chatterjea, MN, dan Shinde, Rana. 2012. Medical Biochemistry Eighth Edition. New
Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd.
C. Garrido, M. Carbú, F. J. Fernández-Acero, N. Boonham, et al. 2009. Development
of Protocols for Detection of Colletotrichum Acutatum and Monitoring of
Strawberry Anthracnose Using Real-time PCR. Plant Pathology. Vol. 58, pp.
43-51.
C. S. Pelosi, M. V. Lourenco, M. Silva, A. Z. Santos, S. C. Franca, dan M. Marins.
2013. Development of a Taqman real-time PCR assay for detection of leifsonia
xyli subsp xyli,” Tropical Plant Pathology. vol. 38, no. 4, pp. 343-345.
Dadkhah H, Bassami MR, Hashemi S, Shahraz F, Hosseini H, Karatzas KAG,
Khaksar R. 2012. Evaluation and Comparison Of SYBR Green I Real-time
PCR and Taqman Real-Time PCR Methods for Quantitative Assay of Listeria
Monocytogenes in Nutrient Broth and Milk. African Journal of Microbiology
Research. 69: 1908-1917.
Di Pinto A, Forte VT, Conversano MC, Tantillo GM (2005) Duplex polymerase
chain reaction for detection of pork meat in horse meat fresh sausages from
Italian retail sources. Food Control 16:391–394.
Fatchiyah, et al. 2011. Biologi Molekular: Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.
Fumière, O., Veys, P., Boix, A., von Holst, C., Baeten, V., & Berben, G. 2009.
Methods of Detection, Species Identification and Quantification of Processed
Animal Proteins in Feedingstuffs. Biotechnology, Agronomy, Society and
Environment. 13, 57e68.
Hasler, C.M. 1998. Functional Foods: Their Role in Disease Prevention and Health
Promotion. Food Technology. Vol. 52 No. 11, pp. 63-70.
Gaffar, Shabrani. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: FMIPA
Universitas Padjajaran.

42
Giglio S, Monis PT, Saint CP. 2003. Demonstration of Preferential Binding of SYBR
Green I to Specific DNA Fragments in Real-time Multiplex PCR. Nucleic Acids
Res. 31:e136.
Hermann, GJ, dan Shaw, JM. 1998. Mitochondrial Dynamics in Yeast. Annu Rev Cell
Dev Biol.14:265-303.
Higgs, J. D. (2000). The Changing Nature of Red Meat: 20 Years of Improving
Nutritional Quality. Trends in Food Science & Technology. 11(3), 85–95.
http://dx.doi.org/ 10.1016/S0924-2244(00)00055-8.
Hussaini, M. M., dan Sakr, A. H. 1983. Islamic dietary Laws and Practices. Islamic
Food and Nutrion Council of America. Bedford Park, IL.
Ishii, satoshi et al. 2013. Simultaneous Quantification of Multiple Food- and
WaterbornePathogens by Use of Microfluidic Quantitative PCR. Division of
Environmental Engineering, Faculty of Engineering, Hokkaido University,
Sapporo, Hokkaido, Japana; Transdisciplinary Research Integration Center,
NationalInstitute of Polar Research, Tokyo, Japan.
Izzah, Afifah Nurul. 2014. Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metoode
Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin dan DNA Gelatin Babi dengan
Menggunakan Real-time PCR. Skripsi. Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah.
Keddie, E.M., Higazi,T. and Unnasch, T.R. 1998. The MitochondrialGenome of
Onchocerca volvulus: Sequence, Structure and Phylogenetic Analysis. Mol.
Biochem. Parasitol. 95, 111–127.
Kesmen, Z., Gulluce, A., Yetim, H. 2009. Identification of Meat Species by Taqman-
based Real-time PCR Assay. Meat Science 82: 444-449.
Kusumadewi et al.. 2013. Analisis DNA Jaringan Lunak Manusia yang Terpapar
Formalin dalam Interval Waktu 1 Bulan Selama 6 Bulan pada Lokus D13S317
dengan Metode STR-PCR. Surabaya: JBP Vol.14 (2): 115-121.
Laelasari, Ela. 2014. Islam dan Keamanan Pangan. Ciputat: UIN Press.
Lazaro, David Rodriguez, dan Hernandez, Marta. 2013. Real-time PCR in Food
Science: Introduction. Curr Issue Mol Bio. 15: 25-38.

43
Legros, Frederic et al.. 2004. Organization and Dynamics of Human Mitochondrial

DNA. Paris: Institue de Myologie.
Lockley, A.K., dan Bardsley, R.G. 2000. DNA-based Methods for Food
Authentication. Trends Food Sci. Technol. 11: 67-77.
Madhad, Vaibhavi J., dan Sentheil, K. P. 2014. The Rapid and Non-enzimatic
Isolation of DNA from The Human Peripheral Whole Blood Suitable for
Genotyping. India: Department of Biotechnology Saurashtra University.
Milner, J.A. 1999. Functional Foods and Health Promotion. Journal of Nutrition. Vol.
129 No. 7, p. S1395.
Moritz,C., Dowling,T.E. and Brown,W.M. 1987. Evolution of Animal Mitochondrial
DNA: Relevance for Population Biology and Systematics. Annu. Rev. Ecol.
Syst., 18, 269–292.
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: IPB Press.
Nelson, David L., dan Cox, Michael M. 2005. Lehninger Principles of Biochemistry
Fourth Edition. USA: University of Wisconsin Press.
Ngili, Yohanis. 2013. Biokimia Dasar. Bandung: Rekayasa Sains.
Pardal, SJ. 2010. Menguji Ekspresi Gen Menggunakan Real-time PCR. Warta
Penelitian dan Pengembangan Pertanian. 32:13-14.
Passarge, Ebenhard. 2007. Color Atlas of Genetics. Third Editions. New York:
Thieme.
Pereira, P.M.C.C., dan Vicente, A.F.R.B. 2013. Meat Nutritional Composition and
Nutritive Role in The Human Diet. Portugal: Centro de Investigacao Egas
Moniz. Meat Science 93 (2013) 586–592.
Pestana EA, Belak S, Diallo A, Crowther JR, Viljoen GJ. 2010. Early, Rapid, and
Sensitive Veterinary Molecular Diagnostics Real-Time PCR Application.
Springer. Dordrecht.
Pighin, Dario et al. 2016. A Contribution of Beef to Human Health: A Review of the
Role of the Animal Production Systems. Riview Article. Hindawi Publishing
Corporation The Scientific World Journal.

44
Poulsen, J.B. 1999. Danish Consumers’ Attitudes Towards Functional Foods. MAPP
Working Paper No. 62, TheAarhus School of Business, Aarhus University,
Aarhus.
Riaz, Mian N., dan Chaudry, Muhammad M. 2004. Halal Food Production. New
York: CRC Press LLC.
Roche. 2009. Real Time Ready Universal ProbeLibrary: Redefining and
Revolutionizing Real-time qPCR Assays. Roche Diagnostic GmbH. Germany.
Diakses dari www.universalprobelybrary.com pada tanggal 23 Februari 2017
pukul 23.37.
Sabrani, Gaffar. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molecular. Bandung: Universitas
Padjajaran.
Saderi, M., Saderi, A. H., dan Rahimi, G. 2013. Identification of Bovine, Ovine and
Caprine Pure and Binary Mixtures of Raw and Heat Processed Meats Using
Species Specific Size Markers Targeting Mitochondrial Genome. Iran:
Department of Genetics and Animal Breeing, Faculty of Animal Science and
Fisheries, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University.
Sakr, A. H. 1993a. Current Issues of Halal Foods in Nourth America. Light,
May/June. 3(3), 22-24.
Sakr, A. H. 1994b. Halal and Haram Definied. In: Understanding Halal Foods-
Fallacies and Facts. Foundation for Islamic Knowledge. Bedford Park, IL.
Schoenian, S. 2014. Small Ruminant Info Sheet. The truth about grain: feeding grain
to small ruminants.
Segawa T, Takeuchi N, Rivera A, Yamada A, Yoshimura Y, Barcaza G,Shinbori K,
Motoyama H, Kohshima S, Ushida K. 2013. Distribution of antibiotic
resistance genes in glacier environments. Environ. Microbiol. Rep. 5:127–134.
Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA) dalam
Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. Bogor: FMIPA-
IPB.
Sherwood, Lauralee. 2010. Human Physiology From Cells to Systems. United State:
Brooks/Cole, Cengage Learning.

45
Triana, Vesty Anis. 2017. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Sosis Sapi
yang Beredar di Wilayah Bumi Serpong Damai Menggunakan Metode Real
Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Skripsi. Jakarta: UIN Syarif
Hidayatullah.
Tribun News. 2016. “Terungkap, Konsumen Daging Oplosan Sapi Dicampur babi
dari Berbagai Kalangan”. 2 Juni. Jawa Barat. Diakses dari
www.jabar.tribunnews.com pada tanggal 14 Maret 2017 pukul 21.05.
Utami, Annisa et al. 2012. Variasi Metode Isolasi DNA Daun Temulawak (Curcuma
xanthorrhiza Roxb.). Bogor: Departemen Biokimia FMIPA IPB.
Vasudevan, DM et al.. 2011. Textbook of Biochemistry for Medical Students Sixth
Edition. New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers P (LTD).
Yancy, H. F., Washington, J. D., Callahan, L., Mason, J. A., Deaver, C. M., Farrell,
D. E., et al.. 2009. Development, Evaluation, and Peer Verification of a Rapid
Real-time PCR Method for the Detection of Animal Material. Journal of Food
Protection, 72, 2368e2374.
Yuwono, Triwibowo. 2009. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.

Lampiran 1 Kerangka Penelitian
Daging Kambing Daging Babi
Isolasi DNA
Isolat DNA
Analisa Isolat DNA dengan

Spektrofotometri UV DNA (Denovix®)
Amplifikasi dengan Real-time PCR
Analisa Kurva Amplifikasi

Real-time PCR (Kualitatif)
Ya Kurva amplifikasi naik? Ada nilai CP? Tidak
Positif Kesimpulan Negatif

47
Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA
No. Sampel Konsentrasi

Kontrol
1 Daging
kambing
Konsentrasi (ng/µl) = 22,53

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,70
2 Daging
babi

Kemurnian (Å260/Å280)= 1,75

48
Simulasi A
3 Daging
kambing
100%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,60
4 Daging
kambing
50%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,54
5 Daging
kambing
10%

Kemurnian (Å260/Å280) = 2,02

49
6 Daging
kambing
1%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,88
7 Daging
kambing
0,5%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,97
8 Daging
kambing
0,1%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,80

50
Simulasi B
9 Daging
babi
100%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,96
10 Daging
babi 50%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,54
11 Daging
babi 10%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,50

51
12 Daging
babi 1%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,80
13 Daging
babi
0,5%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,61
14 Daging
babi
0,1%

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,67

52
Lampiran 3 Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe
1. Pembuatan larutan primer 50 µM dari larutan induk 100 µM

V1 x M1 = V2 x M2
V1 x 100 µM = 100 µl x 50 µM
5000 µl µM
V1 =
100 µM
= 50 µl
Jadi, 50 µl diambil dari masing-masing primer 100 µM dan ditambahkan 50 µl
ddH2O.
2. Pembuatan larutan primer 5 µM

V1 x M1 = V2 x M2
V1 x 50 µM = 30 µl x 5 µM
150 µl µM
V1 =
50 µM
= 3 µl
Jadi, 3 µl diambil dari masing-masing primer 50 µM dan ditambahkan 27 µl
ddH2O.
3. Rekomendasi primer yaitu 0,05-0,3 µM, dipilih konsentrasi 0,1 µM.

V1 x M1 = V2 x M2
V1 x 5 µM = 20 µl x 0,1 µM
2 µl µM
V1 =
5 µM
= 0,4 µl
4. Rekomendasi konsentrasi probe (LightCyler® 480) adalah 0,05-0,2 µM, dipilih

konsentrasi 0,2 µM.
V1 x M1 = V2 x M2
V1 x 10 µM = 20 µl x 0,2 µM
4 µl µM
V1 =
10 µM
= 0,4 µl

53
Lampiran 4 Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer
Rumus Tm = 2°C (A+T) + 4°C (G+C)
1. Primer Kambing
 Primer kambing forward
Tm = 2°C (2+8) + 4°C (4+6) = 60°C
 Primer kambing reverse
Tm = 2°C (5+6) + 4°C (6+4) = 62°C
 Tm rata-rata primer kambing
Tm = (60+62)/2 = 61°C
2. Primer Babi
 Primer kambing forward
Tm = 2°C (1+9) + 4°C (10+0) = 60°C
 Primer kambing reverse
Tm = 2°C (5+9) + 4°C (2+9) = 72°C
 Tm rata-rata primer kambing
Tm = (60+72)/2 = 66°C

54
Lampiran 5 Campuran Reaksi Master Mix untuk Amplifikasi DNA
Konsentrasi Konsentrasi Jumlah yang

Awal Akhir Digunakan
Primer Forward 5 µM 0,1 µM 0,4 µl
Primer Reverse 5 µM 0,1 µM 0,4 µl
UPL 10 µM 0,2 µM 0,4 µl
Lightcycler®480 2x 1x 10 µl
Hydrolysis Probe
ddH2O - - 3,8 µl
DNA Template - - 5 µl
Total Volume Reaksi 20 µl

55
Lampiran 6 Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI
1. Primer Kambing
Primer Forward: 5’-CGCCGTATTCCTGTTAGCTT-3’
Primer Reverse: 5’-ACCAGGGTTGGTAAATCTCGT-3’
2. Primer Babi
Primer Forward: 5’-TGGGGTGTTTAGTGGGTTTG-3’

56
Primer Reverse: 5’-TCCTTGTACTATTCTCACCAGACCT-3’

57
Lampiran 7 Kurva Amplifikasi DNA Kontrol, Simulasi A (1), dan Simulasi A (2)
Menggunakan Primer Kambing

58
Keterangan:
NTC PK : no template control primer kambing
PK B 100 : primer kambing terhadap daging babi 100%
PK K 100 : primer kambing terhadap daging kambing 100%
PK K 0,5 : primer kambing terhadap daging kambing 0,5%
PK K 0,1 : primer kambing terhadap daging kambing 0,1%

59
Lampiran 8 Kurva Amplifikasi DNA Kontrol, Simulasi B (1), dan Simulasi B (2)
Menggunakan Primer Babi

60
Keterangan:
NTC PB : no template control primer babi
PB K 100 : primer babi terhadap daging kambing 100%
PB B 100 : primer babi terhadap daging babi 100%
PB B 0,5 : primer babi terhadap daging babi 0,5%
PB B 0,1 : primer babi terhadap daging babi 0,1%

61
Lampiran 9 Alat dan Bahan yang Digunakan dalam Penelitian
Daging kambing Daging babi Mikropipet
Mikropipet dan tip Spektrofotometri UV Reagen yang

DNA (Denovix®) digunakan
Multiwellplate

Afri Yanti-FKIK

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Afri Yanti-FKIK

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AUTENTIFIKASI DAGING KAMBING TERHADAP

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UJI AUTENTIFIKASI DAGING KAMBING TERHADAP

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

Nama : Afri Yanti

Tanggal : 17 Juli 2017

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Nama : Afri Yanti

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul : Uji Autentifikasi Daging Kambing Terhadap Cemaran Daging Babi

Pembimbing I, Pembimbing II,

Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D.

Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt.

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Skripsi ini diajukan oleh

Nama : Afri Yanti

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul : Uji Autentifikasi Daging Kambing Terhadap Cemaran Daging Babi

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai

Pembimbing I : Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. ( )

Pembimbing II : Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D. ( )

Penguji I : Dr. Endah Wulandari, M.Biomed. ( )

Penguji II : Imam Prabowo, M.Farm., Apt. ( )

Tanggal : 17 Juli 2017

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Nama : Afri Yanti

Kata Kunci: Real-time PCR, daging, UPL probe

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Name : Afri Yanti

Keyword: Real-time PCR, meat, UPL probe

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Jakarta, Juli 2017

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

UJI AUTENTIFIKASI DAGING KAMBING TERHADAP CEMARAN DAGING

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Lampiran 1 Kerangka Penelitian............................................................................ 46

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

AFL : Arbitrary Fluorescence Level

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

1.1 Latar Belakang

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Kontaminan dapat terjadi secara sengaja (kecurangan pedagang) maupun tidak

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

1.2 Rumusan Masalah

1.3 Tujuan Penelitian

1.4 Manfaat Penelitian

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.1 Babi dan Keharamannya

5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Semua sel tersusun atas komponen-komponen kimiawi utama yaitu protein,

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.3 Deoxyribonucleic Acid (DNA)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gambar 2.3 Struktur DNA Double Helix (Albert et al., 2015).

Ikatan antarnukleotida menghasilkan rantai DNA dengan polaritas kimia. Gula