Elektroforesis

Dr. Deddi Prima Putra, Apt

Jurusan Farmasi FMIPA
Universitas Andalas Padang
 Apa Itu Elektroforesis ?
Suatu Metoda Pemisahan
Analisis Kualitatif
Analisis Kuantitatif
Sudah masuk pada salah satu metoda dalam
Farmakope
Analisis obat untuk tujuan legal spt kualiti kontrol atau
alat diagnosa
ilegal seperti pembuktian pemalsuan dan kriminal
 Elektroforesis Bagian
Kromatografi
Macam Kromatogtafi Berdasarkan
Berdasarkan Fasa Gerak-
Fasa Diam Prinsip/Mekanisme
Kromatografi Gas-Padat Adsorpsi
(GC) Partisi
Kromatografi Cair-Padat
(Kolom normal, KLT/KKt, Gel Filtrasi
HPLC) Penukar Ion
Kromatografi Cair-Cair
(DCCC = Craig Counter Afinitas
Current Distribution)) Muatan molekul
Elektroforesis
 Sekilas Tentang Latar Belakang
Kromatografi
Michael Tswett (1872-1919)
memisahkan pigmen tumbuhan dengan batang kapur
dimana munculnya definisi Chromatography
Lederer (1930)
Berhasil memisahkan karotenoid dan Xantofil (pigmen tumbuhan)
Tiselius (1940), penerima Nobel th 1948
Membagi atas tiga jenis kromatografi dan memperkenalkan
elektroforesis
Martin dan Synge
Memperkenalkan prinsip partisi pada kromatografi
Mereka berdua menerima hadiah Nobel th 1952
 Prinsip Kromatografi
Menurut IUPAC Kromatografi didefinisikan sebagai metoda
pemisahan secara fisika dimana komponen zat terdistribusi
antara fasa diam dan fase gerak

Kromatografi Adsorpsi adalah metoda pemisahan dimana solut

atau zat terikat pada permukaan fasa diam melalui gaya Van der
Walls sedangkan fasa gerak dapat berupa zat cair atau gas.

Kromatografi partisi adalah metoda pemisahan yang meliputi

zat cair pada fasa diam terimmobilisasi pada material
adsorben. Solut terdistribusi antara fasa diam dan fasa gerak
sesuai dengan koefesien distribusinya
 Prinsip Kromatografi (Lanjutan)
Gel filtrasi merupakan prinsip kromatografi yang berdasarkan penapisan
molekul pada fasa diam yang berupa matrik makrofor. Fasa diam umumnya
berupa air atau pelerut polar lainnya (misalnya metanol)

Kromatografi ionik (penukar Ion) merupakan proses pemisahan yang

didasarkan pada penukaran zat berupa ion pada fasa diam dengan ion pada
fasa gerak.
Kromatografi afinitas merupakan pemisahan didasarkan pada solut yang
terikat pada fasa diam biomolekuler spesifik, misalnya pemisahan protein
yang terikat pada fasa diam yang mengandung antibodi.

Elektroforesis merupakan metoda pemisahan solut atau zat yang

didasarkan pada muatan molekul
 Elektroforesis (Instrument)
Fasa diam/supp media
Penutup/ termoregulator

Elektrolit

Sumber Daya
 Pembagian Elektroforesis

Planar/ Vertikal
Slab (Mendatar)

Vertikal
 Faktor Yang Mempengaruhi
Elektroforesa
pH
Pengaruh pH dapat menyebabkan molekul bermuatan + atau dan netral. pH
dimana molekul netral disebut pH isoelektrik sedangkan molekul/zatnya
disebut amfoter
Sumber Daya
Makin besar daya yang digunakan maka makin besar pula kecepakan migrasi
molekul
Muatan Molekul
Makin besar muatan molekul makin cepat migrasi molekul dalam
elektroforesis
Bobot Molekul
Makin besar bobot molekul makin lambat migrasi
Struktur Molekul
Struktur yang lebih komplek, makin memperlambat migrasi
 Macam-Macam Fasa Diam
Elektroforesis

Kertas, untuk molekul Agarosa (agar-agar

kecil misalnya hasil alam yang
hidrolisis protein dimurnikan)
Pati/Amilum Polimer Akrilamid
Dekstran (hidrolisis
parsial pati
 Teknik Elektrofiresis
Elektroforesis Voltase Isoelektrik Focusing
Randah (~ 5 V/cm) Immunoelektroforesis
Elektroforesis Voltase Discontinu
Tinggi (~ 100 V/cm) Elektroforesis
SDS Page
 Isolasi Makromolekul
Sampel dihancurkan
dengan N2 cair
Tambahkan pelarut
pengekstraksi yang
mengandung senyawa
protektan spt :
Antioksidan merkaptoetanol
Gliserin dan
Pendapat
Dilakukan sentrifus 20000
rpm
Pisahkan larutan dan endapan
Larutan dipekatkan dg dialisa
Ditambahkan marker
compound untuk langsung
dielektroforesa
Larutan/ Ekstrak dapat pula
difraksinasi dengan
pengemdapan ammonium
sulfat, didialisa dan kmd baru
dielektroforesis
 Skema Isolasi Protein
(Makromolekul)
Sampel Biologis
+ N2 cair, gerus
+ pel pengekstraksi, disentrifugasi 20000 rpm

Larutan
Ampas
Difraksinasi
Dialisa Dg ammonium sulfat: 20%, 40%, 60% dan 80%

Dianalisis Fr. 20%

Fr. 40% Fr. 60%
Fr.80%
Dialisa
 Elektroforesis Kapiler
Metoda terkini dalam teknik elektroforesis
Performannya sebanding dengan HPLC dan memiliki
keunggulan dalam kecepatan analisis,dan ekonomis
dalam opresionalnya
Menggunakan Kapiler Sebagai Wadah Fasa Diam dan
Fasa geraknya, sehingga jumlah sampel yang dianalisis
sangat sedikit ( dpt hingga 1 nL)
Instrumens Elektroforesis Kapiler
Kapiler
Detektor
Sampel Komputer/
Sistim controler

Elektrolit

Sumber Daya
 Prosedur Elektroforesis Kapiler
Teori Dasar :
Aliran digerakkan oleh EOF dlm kapiler
Dipengaruhi oleh pH, medan listrik, suhu dan
Senyawa lain (EOF) modifier
Detektor (UV-Vis)
langsung dan Tidak Langsung
Sistim Injeksi
Hidrodinamik
Elektrokinetik
Tekanan (Positif dan reduksi)
 Prosedur Elektroforesis

Capilari Zone Elektroforesis (CZE)

Misellar Elektrokinetik Capilari
Chromatografi (MECC)
Capilari Gel Elektroforesis
Isoelektric Focusing
Isotachophoresis
 Capilari Zone Elektroforesis (CZE)

Kapiler yang diisi dengan elektrolit

Molekul bergerak bebas dlm kapiler dan
hanya dipengaruhi oleh EOF
Banyak digunakan untuk pemisahan
molekul sederhana
Dapat digunakan sistim deteksi UV_Vis
langsung dan tidak langsung
 Misellar Elektrokinetik Capilari
Chromatografi (MECC)
Didalam elektrolit terdapat surfaktan
Tercapainya pembentukan misel (sesuai dengan
CMC)
Peningkatan resolusi untuk senyawa yang sukar
larut dalam basis elektrolit.
Sebagai surfaktan dapat digunakan :
SDS (Sodium duodesil sulfat) : anionik
CTAB (Cetiltrimetil Amonium Bromida) : kationik
 Capilari Gel Elektroforesis

Elektrolit berisikan gel semi-solid

Digunakan untuk meningkatkan efisiensi
pemisahan molekul karena ada interaksi zat
dengan matrik gel yang ada didalam
elektrolit.
Baik untuk pemisahan DNA
 Isoelektric Focusing

Prinsipnya sama dengan Isoelektrik

focusing pada gel normal
Untuk meningkatkan efisiensi pemisahan
molekul dengan memanfaatkan pH
isoelektrik dan selanjutnya pemisahan
dengan elektroforesis kapiler normal
Molekul lebih dahulu sdh terdispersi dalam
kapiler sesuai dengan pH isoelektriknya
 Isotachophoresis

Suatu metoda baru dengan menggunakan

dua tipe elektrolit : leading dan trailing
elektrolit yang berbeda kekuatan EOFnya
(mobilitasnya)
Mampu menghasilkan puncak yang sangat
tajam
Molekul dipaksan mampat didalam kapiler
akibat perbedaan mobilitas elektrolit.
Thank You!