BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

TENTANG
 PENDAHULUAN

Ada dua metode ekstraksi asam nukleat yaitu ekstraksi DNA dan RNA. Kedua metode
tersebut hampir mirip dalam prosesnya, namun molekul RNA relatiif lebih pendek dan
lebih rusak dengan shearing sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan lebih
agresif. Meskipun molekul RNA relatif pendek, tetapi RNA sangat mudah didigesti oleh
RNAse yang terdapat endrogen dengan konsentrasi yang bervariasi di dalam sel dan
di eksogen di jari. Sehingga, untuk ekstraksi RNA harus menggunakan sarung tangan
dan medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung detergen kuat untuk
segera mendenaturasi RNAse yang ada. Proses deprotenisasi harus dilakukan secara
lebih agresif karena RNA sering berikatan dengan protein.
Dalam sel eukariotik terdapat molekul DNA (deoxyribonucleic acid) juga diidentifikasi
molekul RNA (Ribonuleic acid) yang menunjukkan beberapa jenis. Keberadaan semua
jenis RNA di atas diperlukan untuk sintesis protein. Tahap sintesis protein antara sel
prokariotik dan sel eukariotik terdapat perbedaan.
Hal ini disebabkan karena molekul DNA pada sel prokariotik berada dalam sitoplasma,
sedangkan pada sel eukariotik molekul DNA dipisahkan oleh membrane nuclearis.
 A. PENGERTIAN RNA

 Asam ribonukleat Acid(RNA) merupakan senyawa bahan genetik dan memiliki peran
utama dalam ekspresi gen. Dalam dogma pokok (central dogma) genetika molekuler,
RNA menjadi perantara antara informasi yang dibawa DNA dan ekspresi fenotip yang
diwujudkan dalam bentuk protein.

Asam ribonukleotida (RNA) adalah salah satu molekul asam nukleat yang dibentuk oleh asam
dioksiribonukleotida (DNA) yang berfungsi untuk mensintesis protein di dalam inti sel.
 B. PERBEDAAN DNA DAN RNA

secara umum dapat diketahui bahwa DNA mengandung polimer yang lebih panjang dari
RNA. DNA (Deoxyribonucleic acid) merupakan tempat penyimpanan informasi genetic.
Struktur DNA beruntai ganda. frances crick dan Watson (1953) berhasil menemukan DNA
berstruktur heliks. DNA heliks mengandung makromolekul plinukleotida yang tersusun
secara berulang dari polimer nukleotida. Susunan rangkap membentuk haliks ganda yang
menghadap ke kanan.
- Terdapat tiga gugus molekul dalam setiap nukleotida yaitu:
a. Gugus folat
b. Gula 5 karbon
c. Basa nitrogen atas purin serta adenine
- DNA mempunyai letak struktur di mitokondria, sentriol, kloroplas dan inti sel. RNA
mempunyai letak struktur di sitoplasma, ribosom, dan inti sel
- Bentuk DNA adalah polinukleotida ganda dan terpilin ganda, sedangkan pada RNA
berbentuk tunggal dan polinukleotida pendek. Di dalam DNA terdapat gula yang
bernama deoxyribosa dan ribose dalam RNA.
DNA dan RNA mempunyai fungsi yang berbeda. DNA mempunyai fungsi sebagai sentesis
RNA, yang dilanjutkan pada sintesis protein, setra sebagai pengontrol sifat yang mulai
menurun. RNA mempunyai fungsi hanya untuk sintesis protein.
Ketidak samaan struktur pada DNA dan RNA menjadikan perbedaan antara keduanya,
namun keduanya sama-sama tersusun dari nukloetida. Yaitu:
a. Deoksiribosa adalah gula penyusun DNA, sedangkan gula RNA disusun oleh ribosa
b. Timin dimiliki oleh DNA dan Uracyl adalah milik RNA.
Basa nitrogen yang terkandung dalam DNA disusun oleh purin yang berasal dari
susunan Guanin (G) dan Adenin(A) serta pirimidin yang berasal dari susunan
Cytocine(C) dan Timin (T). Sedangkan basa nitrogen RNA disusun oleh purin Guanin (G)
dan Adenin(A), serta Pirimidin Uracyl(U) dan Cytocine(C).
c. DNA mempunyai rantai panjang dan ganda berpilin (double helix), sedang rantai
tunggal dan pendek dimiliki oleh RNA.
d. DNA dapat dijumpai di kloroplas, mitokondria, dan nukleus. RNA dapat dijumpai di
ribosom (r-RNA), sitoplasma (t-RNA), dan di nukleus (m-RNA)
e. DNA mempunyai peranan mewariskan sifat serta mensintesis protein. Sedang RNA
mempunyai peranan hanya untuk mensintesis protein.
f. Sel DNA mempunyai sel tetap, sedangkan kadar RNA berubah-ubah. Hal ini
disesuaikan dengan jumlah sintesis protein yang dibutuhkan
 C. STRUKTUR RNA

RNA merupakan rantai tunggal berbentuk pita dan tidak berpilin. Tiap rantai RNA
merupakan polinukleotida yang terdiri atas banyak ribonukleotida. Tiap
ribonukleotida terdiri dari 3 gugus molekul, yaitu
1. Gugus pentosa (gula ribosa);
2. Gugus fosfat, dan
3. Basa nitrogen.
Basa nitrogen dibedakan menjadi dua jenis, diantaranya meliputi:
 Basa purin yang susunannya sama seperti DNA, terdiri dari Adenin (A) dan Guanin (G);
 Basa pirimidin yang berbeda dengan DNA yaitu tersusun atas Sitosin (S) dan Urasi (U).
RNA memiliki berat molekul antara 25.000 sampai dengan beberapa juta. Meskipun pada
dasarnya, RNA berisi rantai polinukleotida tunggal, tetapi
rantai yang biasa terlipat membentuk daerah heliks ganda yang mengandung
pasangan basa A:U dan G:C.
FUNGSI DAN MEKANISME KERJA RNA
RNA berfungsi sebagai penyimpan informasi. Namun, peran utama RNA dan berlaku pada
semua makhluk hidup ialah sebagai perantara antara DNA dan protein dalam proses
ekspresi genetik. Dalam menjalankan peran tersebut, RNA diproduksi sebagai salinan kode
urutan basa nitrogen DNA dalam tahapan trankskripsi DNA.
1. RNA genetik
RNA genetik mengambil andil sebagaimana kerja DNA dan hanya dimiliki oleh makhluk hidup
tertentu yang tidak memiliki DNA, seperti beberapa jenis virus.
2. RNA non genetic
RNA non genetik merupakan molekul yang dimiliki oleh makhluk hidup yang materi genetiknya
diatur oleh DNA.Berdasarkan letak dan fungsinya, RNA non genetik terbagi menjadi tiga
macam, diantaranya:
RNA messenger (mRNA)
RNA ribosomal (rRNA)
RNA transfer (tRNA)
Jenis-jenis atau tipe-tipe RNA
RNA terdapat tiga tipe utama atau tiga jenis utama yaitu sebagai berikut..
1. Transfer RNA (tRNA)
RNA yang dibentuk dari dalam nukleus, tetapi menempatkan diri dalam sitoplasma. tRNA
merupakan RNA yang terpendek dan bertindak sebagai penerjemah kodon dari mRNA. tRNA
mempunyai proporsi nukleosida yang lebih relatif tinggi. Transfer RNA (transfer-Ribonucleic acid)
atau asam ribonukleat transfer adalah molekul yang menginterpretasikan pesan genetik
berupa serangkaian kodon yang disepanjang molekul mRNA dengan cara mentransfer asam-
asam amino ke ribosom dalam proses translasi.
 Jenis-jenis atau tipe-tipe RNA

Jenis-jenis atau tipe-tipe RNA

RNA terdapat tiga tipe utama atau tiga jenis utama yaitu sebagai berikut..
1. Transfer RNA (tRNA)
RNA yang dibentuk dari dalam nukleus, tetapi menempatkan diri dalam sitoplasma. tRNA
merupakan RNA yang terpendek dan bertindak sebagai penerjemah kodon dari mRNA. tRNA
mempunyai proporsi nukleosida yang lebih relatif tinggi. Transfer RNA (transfer-Ribonucleic
acid) atau asam ribonukleat transfer adalah molekul yang menginterpretasikan pesan genetik
berupa serangkaian kodon yang disepanjang molekul mRNA dengan cara mentransfer asam-
asam amino ke ribosom dalam proses translasi.
2. Ribosomal RNA (rRNA)
rRNA merupakan ribosom yang mengandung protein dengan massa yang hampir mirip.
Molekulnya berupa pita tunggal, tak bercabang dan fleksibel. rRNA terdiri dari 80 persen total
RNA yang dalam sel dan pada sel-sel tidak memiliki inti sejati yang terdiri dari beberapa tipe
rRNA yaitu 23S rRNA, 16S rRNA, dan 5S rRNA.
3. Mesengger RNA (mRNA)
mRNA merupakan polinukleotida yang berbentuk pita tunggal linier dan disintetis oleh DNA di
dalam nukleus. mRNA berupa rantai tunggal yang relatif panjang. Panjang pendeknya mRNA
 D. Proses pembentukan RNA
Proses pembentukan RNA berkaitan erat dengan fungsi DNA. Seperti pembahasan kita
sebelumya mengenai definisi RNA yang merupakan hasil transkripsi dari suatu fragmen DNA.
Tahapan pembentukan RNA meliputi:
1. Transkripsi
Dalam tahap transkripsi, dengan menggunakan DNA sebagai cetakan disistesis RNA
messenger. Proses ini terdiri atas 3 tahap, yaitu:
a. Inisisasi
b. Elongasi
c. Terminasi
2. Translasi
Translasi merupakan tahapan penerjemahan beberapa triplet/ kodon dari mRNA menjadi
asam amino yang akhirnya membentuk protein.
a. Iniasiasi
b. Elongasi
c. Terminasi
 E. Prinsip dari isolasi RNA.

Sel didalamnya terdapat protein, DNA dan RNA. RNA terdiri atas tRNA, rRNA dan mRNA yang jumla
merupakan biomolekul yang berisikan untai panjang unit nuklotida. Seperti nuklotida RNA tersususn
dan phosphate. RNA mirip dengan DNA, akan tetapi berbeda jika melihat stukturnya.
Isolasi RNA yang harus diperhatikan adakah aktivitas RNAase dan struktur RNA yang utas tunggal. R
mempunyai kemampuan untuk mendegradasi RNA. Struktur RNA yang utas tunggal jika terdapat s
terdegradasi.
Secara umum penanganan isolasi RNA adalah dalam segala aktivitasnya menggunakan sarung ta
dimana-mana dan jumlahnya banyak. Tetap selalu jaga kebersihan dengan cara menggunakan a
 Setelah dilakukan isolasi RNA, maka tahapan selanjutnya yakni karakterisasi molekular suatu
gen yang dapat dilakukan dengan langkah berikut:

Penjelasan bagan tersebut yakni setelah isolasi RNA dilakukan, maka proses selanjutnya adalah
pengukuran konsentrasi RNA yang telah diisolasi menggunakan spektrofotometri pada
panjanggelombang λ260. Kemudian dilakukan sintesis copy DNA (cDNA) menggunakan Reverse
Trancriptase PCR (RT-PCR). RT-PCR berbeda dengan PCR biasa karena ada penambahan enzim
Reverse Trancriptase pada proses PCRnya. Penambahan enzim Reverse Trancriptase bertujuan agar
RNA yang telah diisolasi dapat digandakan dalam bentuk cDNA. Proses PCR ini tidak jauh berbeda
dengan PCR pada umumnya, yaitu meliputi denaturation, annealing, dan elongation (Silahkan dibaca
tulisan tentang Teknik PCR).
 F. Prinsip dari Polymerase Chain Reaction (PCR).
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase adalah metode enzimatis
untuk melipatgandakan (amplification) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu
secara in vitro. Metode ini ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1985, seorang saintis dari
perusahaan CETUS Corporation. Metode PCR ini pada awalnya hanya digunakan untuk
melipatgandakan molekul DNA, akan tetapi dalam perkembangannya dapat digunakan
untuk melipatgandakan molekul mRNA.
Prinsip Dasar PCR
 Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni (1) DNA cetakan, (2)
oligonukleotida primer, (3) deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP,
dGTP, dTTP, dan (4) enzim polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis
rantai DNA.
 Proses PCR terdiri dari tiga tahap, yakni denaturasi, penempelan (annealing), dan
amplifikasi. Pada tahap denaturasi, suatu fragmen DNA (duoble strand) dipanaskan pada
suhu 95 0C selama 1-2 menit sehingga akan terpisah menjadi rantai tunggal (single strand).
Kemudian dilakukan penempelan (annealing) pada suhu 55 0C selama 1-2 menit, yakni
oligonukleotida primer menempel pada DNA cetakan yang komplementer dengan sekuen
primer. Setelah dilakukan penempelan, suhu dinaikkan menjadi 72 0C selama 1,5 menit.
Pada suhu ini, enzim DNA polimerase akan melakukan poses polimerasi, yakni rantai DNA
Gambar 1. Proses PCR
Reaksi-reaksi seperti diatas dapat diulangi sampai 25-30 kali (siklus) sehingga akan didapatkan
molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru. Banyaknya amplifikasi tergantung pada
konsentrasi DNA target yang akan digunakan. Setelah diperoleh molekul-molekul DNA dalam
jumlah yang sesuai, maka DNA tersebut dapat diamati dengan menggunakan cara
elektroforesis gel, analisis fragmen restriksi, atau metode Sanger.
G. Teknik dalam mengisolasi RNA
Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
Teknik RT-PCR dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul RNA hasil transkripsi
yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam sel. Sebelum teknik ini dikembangkan,
analisis terhadap molekul mRNA biasanya dilakukan dengan metode hibridisasi in situ,
northern blot, dot blot atau slot blot, analisis menggunakan S1 nuklease atau dengan metode
pengujian proteksi RNase (RNase protection assay). Metode hibridisasi in situ bersifat sangat
sensitive sehingga dapat digunakan untuk analisis molekul mRNA yang terdapat dalam
jumlah sangat sedikit, tetapi teknik ini cukup sulit untuk dilakukan. Metode-metode yang lain
meskipun lebih mudah dilakukan, tidak cukup sensitif. Oleh karena itu, kemudian
dikembangkan teknik RT-PCR untuk mengatasi kelemahan-kelemahan metode yang lain
Gambar 2. Sintesis cDNA

Teknik RT-PCR memerlukan enzim transkriptase balik (reverse

transcriptase). Enzim transkriptase balik adalah enzim DNA polimerase
yang
menggunakan molekul RNA sebagai cetakan untuk menyintesis
molekul DNA
(cDNA) yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Beberapa
enzim
transkriptase balik yang dapat digunakan antara lain mesophilic viral
reverse
transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus avian myoblastosis (AMV)
maupun oleh virus moloney murine leukemia (M-MuLV) dan Tth DNA
polimerase. RTase yang dikode oleh AMV maupun M-MuLV bersifat
sangat prosesif dan mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 10
kb, sedangkan Tth DNA polymerase mampu menyintesis cDNA sampai
sepanjang 1 -2 kb
 Transformasi dapat terjadi secara alami maupun karena
induksi. Dalam proses transformasi secara alami, misalnya
Pneumococcus, sel dapat menerima DNA untai ganda
berbentuk linier. Agar DNA tersebut dapat direplikasikan dan
diturunkan ke sel anakan, maka donor tersebut harus
diintegrasikan dengan mekanisme rekombinasi pada daerah
gen yang homolog pada sel penerima.

Plasmid yang dapat digunakan untuk transformasi

semacam ini biasanya adalah plasmid yang dapat
melakukan replikatif secara independen sehingga tidak
perlu ada proses rekombinasi dengan genom sel
Pada bakteri lain, misalnya Bacillus subtilis, penerima. Pada umumnya sel penerima yang digunakan
transformasi biasanya dilakukan dalam transformasi secara induksi adalah sel yang tidak
mampu melakukan rekombinasi (recA). Hal ini
dengan metode transformasi protoplas. Dalam hal ini,
dimaksudkan agar tidak terjadi proses penyusunan
dinding sel dihilangkan genom kembali (rearrangements). Meskipun demikian,
terlebih dahulu dengan enzim tertentu. Penghilangan dalam beberapa prosedur kloning gen, kadang-kadang
dinding sel tersebut dilakukan di dalam larutan juga digunakan plasmid yang tidak mampu melakukan
tertentu, misalnya sukrosa pada konsentrasi tertentu, replikasi secara independen sehingga plasmid tersebut
untuk mempertahankan tekanan osmose sehingga harus diintegrasikan ke dalam genom sel penerima
protoplas yang terbentuk tidak akan lisis. (integratting plasmid) agar gen yang dibawa oleh
Transformasi dapat juga dilakukan dengan metode plasmid dapat direplikasikan. Pada bakteri E. coli, induksi
elektroporasi yaitu dengan menggunakan pulsa listrik transformasi dapat dilakukan dengan menginkubasikan
 H. Contoh Metode dalam mengisolasi RNA.
1.Isolasi RNA dari Candida albicans
Alat : tabung eppendorf, mikropipet, vortex merk “Beckmen”, sentrifuge
Bahan : Trizol 1 ml, Kloroform 200 µl, iso-propyl alcohol 500 µl, etanol 1 ml, RNAase free water
Cara Kerja : Tambahkan 1 ml Trizol ke dalam sampel Candida Albicans.
Tambahkan 200µl kloroform ke dalam 1 ml Trizol. Inversi selama 15 detik.Inkubasi pada suhu
ruang (15-30 oC) selama 3 menit. Sentrifus 3.000 rpmselama 30 menit pada suhu 4oC. Ambil
lapisan bagian atas (colorless) lebih kurang 60% total suspensi trizol, pindahkan ke tabung
baru. Tambahkan 0,5 ml iso-propyl alcohol dalam setiap trizol yang digunakan. Inkubasi 15-
30oC. (suhu ruang) selama 10 menit. Sentrifus 3.000 rpm selama 20 menit padasuhu 4oC.
presipitat RNA tampak seperti gel di sisi dasar/ tepi tabing. Buangsupernatant. Cuci pellet RNA
dengan 1 ml etanol 75%. Vortex sebentar.Sentrifus pada 3.000 rpm selama 5 menit. Buang
supernatant, keringanginkan pellet selama 10 menit. Larutkan RNA dalam RNAase free water
20µl.simpan dalam suhu -80oC.
2. Pengukuran konsentrasi RNA hasil isolasi
a. Alat : mikropipet, spektrofotometer
b. Bahan : RNA hasil isolasi, RNAase free water, aquadest
c. Cara Kerja : Ambil 2 µl RNA hasil isolasi, masukkan dalam cuvet,
3. Pembuatan cDNA – Reverse Transcriptase PCR
a. Alat : tabung eppendort, mikropipet, alat PCR “Gene AMP PCR system 2400”
b. Bahan : hasil isolasi RNA, Anchored-oligo (dT) 18 primer, RNA template,
RNAase free water, Spesific reverse primer, RNA template, transcriptionbuffer, protector
RNAase inhibitor, deoxynucletid mix, transcriptionn RT enzyme
c. Cara kerja :
1) Siapkan sampel isolasi RNA
Kelompok 1 : 996
Kelompok 2 : 662
2) siapkan campuran template RNA dan primer pada tabung PCR 0,2 ml
dengan komposisi sebagai berikut :
Kelompok 1 Jml (µl) Kelompok 2 Jml (µl) Anchored-oligo (dT) 18 primer 1 Spesific reverse
primer 3 RNA template 5 RNA template 5 RNAase free water 7 RNAase free water 5total 13
total 13
4. Elektroforesis hasil RT-PCR
a. Alat : Erlenmeyer, timbangan analit, Microwave, Cetakan Gel Agarose, sisir
cetakan, Alat elektroforesis, Mikropipet, Tabung Eppendorf
b. Bahan : agarose 2 gram, TAE, ethidium bromide 4µ
c. Cara kerja : buat agarose dengan konsentrasi 2 % dengan cara menimbang 2 gram
agarose,, tambahkan 100 ml TAE. Panaskan dalam oven selama 2 menit (tiap 30 detik
Erlenmeyer dikeluarkan + digoyang-goyang). Tambahkan ethidium bromide 4µl. campur.
Pasang sisir dalam cetakan. Tuangkan agarose dalam cetakan, tunggu sampai beku. Copot
sisir + pasang gel pada alat. Tambahkan buffer TAE sampai gel terendam. Masukkan sampel
yang akan dirunning. Run pada 100 volt. Visualisasi dengan UV
5. Transformasi
a. Alat : mikropipet, tabung ependorf, sentrifuge, vortex, incubator + shaker,
batang drugalski/ batang L, bunsen
b. Bahan : E.coli DH5 , plasmid PUC 19, LB medium, larutan MOP, CaCl2,α
RbCl, LB padat yang mengandung amphicilin
c. Cara kerja : Tumbuhkan bakteri E.coli DH5 dalam LB medium semalam.α
Culture diambil 200 µl dimasukkan dalam LB medium 5 ml. inkubasi pada
37˚C selama 2-3 jam dengan goyangan (OD=0,54). Ambil 1.5 ml culture
bakteri, dimasukkan dalam eppendorf. Sentrifus selama 5 detik. Supernatant
TERIMAH KASIH