Tujuan mempelajari

• Memahami fungsi katalitik ensim

• Pada sel hidup peka perubahan suhu, pH dll
• Memahami fenomena biologi pada
umumnya
Praktis :
-Pemurnian, penelitian
-Pembuatan obat-obatan
 PENGUKURAN AKTIVITAS ENSIM
Jumlah << ----- dasar aktivitas katalitiknya aktivitas
ensim (,
berdasarkan pada V yang dikatalisa

membandingkan dg V reaksi ensimatik yang

dikatalisa ensim murni jumlahnya diketahui
 jumlah ensim dpt diukur (ug).

E  dalam bentuk murni  unit - sulit

- mahal
Laju reaksi ensimatik
perubahan jumlah S / P persatuan waktu pada
keadaan ( suhu & pH ) tertentu
- AKTIVITAS ENSIM :

• Perubahan kadar substrat / produk dalam

suatu waktu ttt untuk suatu volume ttt dari
larutan ensim yang diperiksa.

-Untuk mengetahui aktivitas total ensim

perlu diketahui volume total.

- Unit / volume.
 UNIT AKTIVITAS ENSIM

- dalam mikromol substrat yg bereaksi atau mol

produk yg terbentuk per menit atau per jam
dlm kondisi yg telah ditentukan.

- menurut IUB
1 international unit (IU) ensim :
jumlah ensim yg mengkatalisa pembentukan
1 μmol produk permenit pada kondisi yang
ditentukan.
TEORI KINETIK

Molekul harus berbenturan & harus

mempunyai enersi kinetik cukup >>
untuk melampaui enersi rintangan
reaksi agar reaksi bisa berlangsung.

Energi Rintangan Reaksi

Peningkatan laju reaksi (V) ≠ selalu berbanding
lurus dg peningkatan konsentrasi , tapi
tergantung tingkatan reaksinya.

CONTOH :
Tingkat I
A  B, V = k.A
(P↑V ~ P↑A)
Tingkat II
A + B  AB , V = k AB
bila A&B menjadi 2x, V = k.2A.2B

jadi V=  4X
 VELOCITY

= Kecepatan ,
perubahan dari kwantitas sesuatu tiap satuan
waktu.

= Perubahan jumlah reaktan atau perubahan

jumlah produk tiap satuan waktu.
Reaksi bolak balik
nA + mB  An Bm
Laju reaksi Ke kanan V1 = K1 An Bm
Ke kiri V2 = K2 An Bm

Keadaan keseimbangan :
V1 = V2
K1 (A)n (B)m = K2 (AnBm).
K1 = (AnBm) = Keq.
K2 (A)n (B)m

Keq > I  kekn

< I  keki
Harga keq dpt dihitung bila : A,B,AnBm diketahui.
 MENGUKUR KECEPATAN REAKSI

- jumlah substrat yg diubah atau jumlah produk

yg terbentuk persatuan waktu.

- Percobaan
S1 : (substrat) mula-mula
E1 : ( ensim )

Perjalanan reaksi ensimatik didapat

ΔS ( Σ subtrat yg diubah )
ΔP ( Σ produk yg terbentuk )
ΔS/
ΔP

0 t1 t2 t3 t
Pada suatu reaksi kimia dijumpai grafik yg lurus,
velocity dari suatu reaksi akan berkurang ,.
Oleh karena

1. Σ Reaktan semakin ↓ ( V tgt S)

2. Produk yang terbentuk sering bereaksi kembali
menjadi senyawa semula
( reaksi bolak balik).Reaksi kekiri produk akan ↓
3. Produk yg terbentuk kadang menghambat reaksi
selanjutnya (inhibitor).
4. Faktor lain.
Velocity semakin turun grafik akan menyimpang dari
garis lurus.
Sebab :
Σ substrat makin lama

produk yang terbentuk

menghambat kerja ensim sebagai
mekanisme untuk mencegah
penumpukan produk.
 KECEPATAN SESAAT

• Kecepatan reaksi ensimatik pada suatu

waktu yang sangat pendek pada suatu titik
pada progress curve

• Kecepatan sesaat pada suatu titik

merupakan tanjakan (slope) yaitu:
tangens garis singgung terhadap grafik
pada titik tersebut (a,b,c).
V = limit – ΔS
Δt » o Δt

Atau:
V = - d(S) atau d(P)
dt dt

ΔS/
ΔP C

6
α
0 A t

KECEP.SESAAT PADA TTK A ≠ B ≠ C

Kecepatan sesaat pd titik A disebut : kecepatan awal (Initial velocity).
KECEPATAN RATA-RATA

Untuk mengukur kecepatan sesaat dari suatu

reaksi ensimatik pada suatu titik  sukar

Mudah :
mengukur kecepatan rata-rata pd titik tersebut.

V rata-rata = ΔS
Δt
 KECEPATAN AWAL (INITIAL VELOCITY)

• kadar substrat dapat diketahui cepat

• kadar ensim hanya pada keadaan
• suhu awal (initial point)
• pH

Bila disebut Kecepatan Reaksi Ensimatik (velocity)

pada umumnya adalah Kecepatan awal :
merupakan Kecepatan reaksi ensimatik
pada titik awal / titik o.
 KECEPATAN AWAL V = tg α = b
a

ΔS
(ΔP)

α a t
0

Padapertama kurva perjalanan kurva masih lurus,pengaruh berkurang S

/ bertambahnya P terhadap kecepatan reaksi ensimatik dapat diabaikan.

V : kecept.reaksi ensimatik sec.umum

v : kecept. awal reaksi ensimatik (vo)
 CARA MENGUKUR KECEPATAN AWAL
SUATU REAKSI ENSIMATIK
Kecepatan reaksi = ΔS/ ΔT
Initial velocity = LIM ΔS / ΔT
Praktis pengukuran t=o  Sulit hanya teoritis

A. Buat progres kurva/kurva perjalanan

(kurva yg menunjukan ΔS dg t).

B. Ambil bagian pertama dg PROGRES KURVA yang

masih berupa garis lurus(Buat grs singgung melalui
titik o pada kurva tsb).

C. Tentukan tg α = b/a ( α : seperti yang dibentuk

garis singgung dengan absis
• .
KECEPATAN REAKSI ENSIMATIK

DIPENGARUHI :
1. KADAR SUBSTRAT
2. KADAR ENSIM
3. SUHU
4. PH
5. LAIN-LAIN
- AKTIVATOR - RADIASI
- INHIBITOR - DLL.
- PROSES OKSIDASI/REDUKSI
 PENGARUH KADAR SUBSTRAT PD
REAKSI ENSIMATIK
Percobaan kondisi sama (substrat) beda
C
Vm
B ½ Vm

1/2 Vm
½ Vm

0
A 0 Km [s]
Grafik : hiperbola
Ttk A,B : ensim belum jenuh dengan substrat
Ttk C : ensim jenuh + substrat  P↑(S)≠V ↑,
harga V merupakan harga
V maksimal = V max.
 HIPOTESA MICHAELIS MENTEN

(E)+S [ ES] (E) + P

Dasar : E harus berikatan dulu, sebelum
membentuk [ES]
Perubahan S  P, ditentukan oleh
kecepatan perubahan [ES]  P + E
Bila kadar E tetap
Maka V pembentukan P tergantung S  hub.V
dg (S)  linier padahal sebetulnya tidak.
MICHAELIS MENTEN

1. REAKSI DLM KEAD.MANTAP (STEADY STATE) atau

[ ES ] = KONSTAN atau
V PEMBENTUKAN [ ES ] = V PEMECAHANYA.

2. KADAR PRODUK JAUH LBH<KDR SUBSTRATDPT

DIABAIKAN (P)O PD PERMUL REAKSI (ttk A)

3. KADAR S JAUH LEBIH > KDR E

4. ENSIM HANYA MEMPUNYAI 1 SUBSTRAT, MAKA

REAKSI sbb:
 Derivation of Michaelis-Menten Equation
k1 k3
• E+S  ES  E+P
k2 k4
rate limiting step is Pt = k3 [ES]
1. Rate of formation of ES complex ES t = k1 [E T - ES] [S]
2. Rate of destruction ES complex ES t = (k2 + k3) [ES]
3. Steady State Equilibrium k 1 [ET- ES] [S] = (k2+ k3) [ES]
4. Michaelis Constant (Km) ( k2+ k3) = [ET - ES] [S]
( k1) [ES]
down Km = ( k2+ k3) = [ET - ES] [S]
( k1) [ES]
5. Solve for [ES ] [ES] = [ET] [S]
(Km) + [S]
6. Substitute in above Pt = k3 [ES] v = k3 [ET] [S]
(Km) + [S]
7. Substitute Vmax for k3 [ET] v = Vmax [S]
Km + [S]
 Michaelis-Menten plot for an enzyme-
catalyze reaction.
• .v0 = Vmax[S]/(Km + [S])

The rate of enzyme reaction is refered to as the velocity of the reaction.

It is most common to express the velocity in amount of product formed per minute.
KURVA PERJALANAN
PROGRESS CURVE
 PENGARUH [S] TERHADAP V ?

٠ [S] < , pada persamaan Km + (S) , (S) dapat X

V = Vm (S)
Km
Vm & Km : K
V = [S]

٠ [S] > , HARGA Km X

V = Vm (S)
V = Vm (S)
(S)
V= Vm Km + (S)

٠ [S] = Km
V = Vm Km = Vm Km
Km Km 2 Km

٠ V = ½ Vm
 CARA MENENTUKAN HARGA Km :

Untuk membuat kurva saturasi :

Hub (v) dg (s) btk hiperbola tidak praktis

grafik bentuk linier

Penentuan harga Km mudah (cukup dengan

beberapa titik)

Double reciprocal atau LINEWEAVER BURK PLOT

 The LB equation
I = Km x I + I
v Vmax s Vmax

Y = ax + b

Slope= Km/Vmax

The intercept on the 1/v0 axis is 1/Vmax and the intercept on the 1/[S] axis is -1/Km.
The slope of the line on the plot is Km/Vmax.
 PENGARUH KADAR ENSIM

• Bila keadaan dibuat konstan & (S) > (E),

Maka : V ~ (E)

(E)
 KURVA PERJALANAN REAKSI ENSIMATIK
BERBEDA JUMLAH
I. = 1 UNIT
II = 2 UNIT
III = 4 UNIT III

mg substrat
Yg diubah II

30’
0 t2 20’
t1 10
MENIT
 to = grafik lurus, berarti Vo ~ (E)
t1 dan t2 = grafik tidak lurus

V rata-rata ≠ ~ (E) to

V rata2
Mg S permenit t1

t2

0
Unit ensim
V rata-rata pada t0,t1, t2
 PENGARUH SUHU
• ENSIM =PROTEIN ↑
• T >>  ENERGI KINETIK VO
• Pada t=0oC aktivitas E ↓, sebab pergerkan
molekul ↓
• Bila E Kinetik > E untuk mempertahankan
struktur protein

Struktur protein rusak

(sisi aktif berubah, ok mol E meng absorpsi enersi
>, tjd perubahan st. IVSt.III  st . II denaturasi
ensim  aktifitas berhenti (> 60oC)
% SUBSTRAT YG DICERNA
40ْ

27ْ

70ْ

0ْ

T

0  E BLM BEKERJA, ENERSI KINETIK <  ≠ DENATURASI

70  DENATURASI >
40  T OPT
T↑  Vo ↑  ENERSI  TA STABIL  DENATURASI
t OPT  TA SAMA
 PENGARUH pH

• Sifat aa terhadap perubahan pH, contoh :

R-C-COOH R-C-COO- R-C-COO-

H+ OH-

NH3+ NH3+ NH2

I II III

I : pH < isoelektrik
II : aa pada pH isoelektrik
III : pH > isoelektrik
 Pengaruh pH
• Ensim bekerja pada pH ttt
• Perubahan pH mengubah ikatan H dan
bentuk sisi aktif
• Menyebabkan S tidak bertahan lama
terikat dg sisi aktif
• Aktivitas ensim  menurun
• Sebagian > perubahan pH denaturasi E
 Hubungan pH dengan aktivitas
ensim
• 100

0 pH< pH opt pH>

pu pH optimum 5----9, kecuali : pepsin pH optimum 1—2,

lipase (usus) -basa
ΔS
pH 1

pH 2

pH3

pH4

t
0
pH OPTIMUM : Ph ΔS/t selalu lebih > dp pH lain. (pd percob ini ?)

pH optimum = pH di mana aktivitas ensim adalah optimal

Terbaik pada keadaan ttt, mis.suhu ttt
 denaturasi
• Pada umumnya ok panas
•  perubahan struktur III protein
•  perubahan susunan kimia
•  perubahan bentuk ensim
•  aktivitas biologi E hilang
• Denaturasi ok panas  Irreversibel
• Denaturasi ok perubahan pH reversibel
• Ensim bekerja pada t dan pH tertentu
• Human intracellular enzymes work best at
37oC and pH 7
 PENGARUH OKSIDASI REDUKSI
• Gugus sufhidril (-SH) Pd ensim terut. E
oksido-reduktase  aktivitas ensim !

Oksidasi-SH  disulfid (S-S)

 Aktivitas ensim hilang
 Perubahan konformasi ensim

• Ribonuklease
Reduksi ikatan disulfida 
aktivitas ensim hilang
 PENGARUH RADIASI

• Aktivitas ensim dalam sel hilang ok

rusaknya DNA

• Ensim sangat sensitif

♣ Sinar uv
♣ Sinar x
 PENGARUH INHIBITOR

• I x E

• PENGGOLONGAN
• BERDASARKAN SIFAT IKATAN E DAN I

1. INHIBITOR REVERSIBEL
E+I EI

2. INHIBITOR IRREVERSIBEL
E + EI
 BERDASARKAN SIFAT KINETIKNYA

• INHIBITOR KOMPETITIF
Efek I dapat dikurangi/dihilangkan
dengan penambahan substrat

• INHIBITOR NON KOMPETITIF

EfeK I tidak dapat dihilangkan dengan
penambahan substrat
 MEKANISME PENGHAMBATAN I
KOMPETITIF
I. I mempunyai struktur mirip S
Dapat terikat + active site pada permukaan
ensim. E yang sudah terikat tidak dapat terikat
atau sebaliknya

i S

i
S
ENSIM ENSIM

INHIBITOR ANALOG SUBST

 Suksinat
CONTOH dehidrogenase
• A SUKSINAT + FAD FUMARAT + FADH2

COOH H-C-COOH
L ll
CH2 HOOC-C-H
l
CH2
l
COOH
SUKSINAT DEHIDROGENASE DPT DIHAMBAT SEC.KOMPETITIF :

A.MALONAT A OKSALAT A GLUTARAT A PROPIONAT

COOH COOH COOH CH3
l l l l
CH2 COOH CH2 CH2
l l l
COOH CH2 COOH
l
INHIBITOR TERKUAT CH2
l
COOH
II. Inhibitor ≠ pada active site tapi terikat di
tempat
lain, namun pengikatan I
menghalangi S, ok terjadi halangan
pengikatan
sterik Inhibitor halangan sterik

S
I

I S
S

ENSIM ENSIM
 INHIBITOR KOMPETITIF
• Selalu reversibel
• Dapat mengikat ensim bebas (E), tetapi
tidak dapat mengikat (ES)

E + I EI X ES + I

K5 EI
K6
E
K1
K3
K2 ES E + P
K4
 V

Vm • TANPA I
• INHIBITOR

1/2Vm

0 Km Km’ S
 1/V

• TANPA I
1/Vm • INHIBITOR

HARGA Km ↑
Vm TETAP

-1/Km -1/Km’ 0 1/(S)

 OBAT-OBATAN MERUPAKAN INHIBITOR KOMPETITIF
TERHADAP ENSIM TERTENTU

1. SULFANILAMIDE & DERIVAT

UTK KEMOTERAPEUTIKUM, MEMILIKI STRUKTUR ~ PABA
DPT MENGHAMBAT A FOLAT SENY.YG DIBUTUHKAN BAKTERI

2. FISOSTIGMIN
MIRIP ASETILKOLIN, SHG MENGHAMBAT HIDROLISA A.C OLEH
ENSIM ASETIL KOLIN ESTERASE
UNTUK MIOTIKUM (M< PUPIL MATA)

3. ASETAZOLAMIDE (DIAMOX)
I ENSIM ANHIDRASE A.KARBONAT YG MENGKATALISA REAKSI

H2CO3 CO2 + H2O

DIGUNAKAN SEBAGAI DIURETIKUM

 INHIBITOR NON KOMPETITIF
• Reversibel/irreversibel
• I NK REVERSIBEL
* Dpt terikat dg (E) Bebas, (ES)
E+I EI ES + I ESI

* I Terikat dengan E pada tempat beda dengan

tempat pengikatan S & struktur ≠ mirip S

E
S

I
 Bila pengikatan S ≠ menghalangi pengikatan I &
sebaliknya pengikatan I≠ menghalangi S, maka :

k3
K1
E ES k4
E + P
K2
≠
k5 k6

k1
EI ESI ESI + P (<<<) DIABAIKAN
k2
 GRAFIK HUBUNGAN (S) -
V
V II
1/V

Vm
I I

V’m II 1/v’m
1/2Vm

1/2V’m 1/vm

(S) 1/Km 0 1/(S)

00 Km
(
I ≠ INHIBITOR S

II )
+ INHIBITOR
 Dari grafik

• INK REVERSIBEL tidak merubah harga Km, tetapi

merubah harga Vm (↓)

• INK REVERSIBEL seakan-akan menurunkan

(E) aktif

• peningkatan substrat tidak meniadakan efek

inhibitor
 INK
IRREVERSIBEL
• Irreversibel
• I Dapat mengubah konformasi seluruh molekul E
• Logam berat : Hg2+, Ag2+, Ba2+
• Mengubah konfigurasi tempat kegiatan yang
menyebabkan ensim in aktif
• sisa E yang tidak berikatan dengan I, tetap aktif
• Efek :
*M↓ E aktif, sulit dibedakan dg INK reversibel
*Harga Vm↓ , Km tetap
Inhibitor Uncompetitive
• E harus berikatan dulu dengan S
E + A EA

• diikuti EA + I EIA
• E + I X EI

• efek Km :
I dapat meningkatkan ikatan ES, tetapi Km↓
• efek Vm :
I tidak berkompetisi dng S, tetapi S hrs terikat E
dulu. I efektif pada (S) ↑  Vm ↓
.
Inhibitor Uncompetitive
 Mechanisme regulasi ensim
• Kontrol molekul ensim yang ada (gen)
• Pemisahan,
contoh : lisosom, mitokondria
• Pemecahan proteolitik, mengubah ensim
in aktif  aktif
contoh : hormon, ensim GIT
• Penyesuaian kecepatan reaksi ensim :
* kontrol stokiometri ( S <<)
* allosterik : ikatan dg ligand -20-40X
 Regulasi Allosterik

• Allosterik : 'other structure'.

• Modulator allosterik dapat berikatan pada
tempat lain selain aktive site dan menyebabkan
aktivasi atau inhibisi
• Modulator ini dapat termasuk substrat yang
berikatan dengan aktive site lain pada suatu
multi-subunit enzyme.
• Ensim allosterik hampir selalu merupakan
kompleks quaternary structure (multiple
subunits) dan menunjukkan non-Michaelis-
Menten kinetics.
 Phosphofructokinase (PFK) is regulated by:
High concentrations of ATP, which inhibit PFK
High concentrations of ADP, which stimulate PFK
High concentrations of AMP, which stimulate PFK
High concentrations of citrate, which inhibit PFK
Therefore ATP and citrate are allosteric inhibitors; and ADP
and AMP are allosteric activators

• .
 •Why the sigmoid shape?

• Ensim Allosterik adalah multi-subunit enzymes, masing2

mempunyai active site

• Menunjukkan cooperative respon terhadap substrat seperti

modulator, affinitas terhadap S ↑ ~ (S)

• Berarti :
V meningkat cepat dengan kadar (S) <, yang ditunjukkan
pada gbr grafik plateau.
 Haemoglobin is a 4 subunit protein (although it is not an enzyme) that binds
oxygen, and is often used as a model for allosteric regulation because it is a
good model for cooperation in the binding of multiple ligands. Myoglobin is a
closely related monomeric protein.
The % saturation with oxygen is equivalent to the saturation of the active site of
an enzyme: myoglobin shows normal saturation kinetics; but haemoglobin
shows sigmoid kinetics

• .
• .