SPEKTROFLUOROMETRI

Hamburan SPEKTROFOTOMETRI
REM RAMAN

Absorpsi SPEKTROFOTOMETRI UV/

Vis
Absorpsi FLUORESENSI
DAN FOSFORESENSI
dan Emisi
 Pendahuluan
• Fluororesensi dan fosforesensi adalah
fotoluminisensi
• luminesen: emisi foton dari tingkat
eksitasi secara elektronik pada atom,
molekul, dan ion
• fotoluminisen: Peristiwa st seny obat
dapat dieksitasi oleh REM dan
memancarkan kembali λ (sama atau
beda)
 Fluoresensi :

• Pemancaran kembali sinar oleh

molekul obat yang telah menyerap
energy sinar yang tjd dlm wkt singkat
stlh penyerapan (10—8 detik ).
• Fluoresensi: rata-rata lifetime dari
<10—10 sampai 10—7 detik dari tingkat
singlet
 Fosforesensi
• Pemancaran kembali sinar oleh
molekul obat yang telah menyerap
energy sinar yang tjd dlm wkt
singkat stlh penyerapan (10—4 detik
).
• Fosforesensi: Rata-rata lifetime
dari 10—5 sampai >10+3 detik dari
tingkat triplet tereksitasi
 TEORI DASAR
• Kebanyakan molekul dalam
keadaan dasar (ground state)
mempunyai e berpasangan
• E ini menempati orbital yang
sama dg arah spin yang
berlawanan
• Jika e sepasang dengan spin
berlawanan disebut electron
singlet So
• Adanya penyerapan energi
dapat menyebabkan electron
dipromosikan ke tingkat E yang
lebih tinggi
MF = 2 | s | + 1 = 1
MF = 2 | s | + 1 = 1
MF = 2 | s | + 1 = 3
 Teori ikatan
• Bila 2 buah atom saling mengikat menjadi st
molekul maka pasangan electron yg
membentuk ikatan antara kedua atom
dianggap menempati st orbital molekul yang
saling tumpang tindih dari 2 atom
pembentuknya
• Dari kombinasi tsb akan tbtk orbital molekul
bonding dan anti bonding yang digambarkan
dengan tingkat2 energy vibrasi
• Jika molekul menyerap sinar mk akan tjd
transisi dr tingkat energy ikatan dan anti ikatan
yang diukuti oleh transisi energy vibrasi
 Teori ikatan
• Kebanyakan molekul punya jlh electron genap.
Elektron akan menempati orbital dengan
berpasangan harus mempunyai spin yang
berlawanan (Diamagnetik)
• Tingkat energy di dlm molekul berpasangan
disebut tingkat energy electron singlet
• Bila satu electron keadaan singlet menyerap
energy cahaya (tereksitasi) maka
kemungkinan yang terjadi
 Teori ikatan
1. Transisi ke tingkat energy electron tereksitasi
singlet (S) yang mana spin nya masih dalam
keadaan berlawanan
2. Transisi ke tingkat energy electron tereksitasi
triplet (T) yang mana spin nya berubah yang
keadaan semula berlawanan menjadi searah
 Sifat-sifat molekul dlm keadaan S dan T
1. S bersifat diamagnetic (berpasangan) dan T
paramagnetic
2. Kebolehjadian transisi ST < daripada SS
karena transisi ST harus disertai perubahan
tingkat energy electron. Shg lifetime eksitasi T
>S
3. Keadaan teraksitasi T dapat diisi dg eksitasi S
disebut inter system crossing (dasar dari
fosforisensi)
 Stlh mengalami transisi, molekul
akan mengemisikan energinya
(Kompetisi relaksisi)

Eksitasi e dr So ke S2

Perpindahan E vibrasi ke molekul

Perpindahan energy vibrasi molekulterdekat
dengan molekul terdekat, di dalam
larutan, dll (S2-S1) Internal Convertion

Eksitasi e dr
So ke S2
 Stlh mengalami transisi, molekul
akan mengemisikan energinya
(Kompetisi relaksasi)
Singlet mengalami Penyilangan menjadi Triplet

Eksitasi e dr So ke S2
Pembalikan Spin terlarang

Perpindahan E vibrasi ke molekul

Perpindahan energy vibrasi molekulterdekat
dengan molekul terdekat, di dalam
larutan, dll (S2-S1) Internal Convertion

Eksitasi e dr
So ke S2
 Mekanisme relaksasi
• Relaksasi/Pengendoran vibrasi: Kelebihan E
Vibrasi akan dilepas dg tabrakan dg pelarut.
Suhu jd naik
• Konversi internal: Perpindahan tingkat energy
dalam 1 molekul dari E tinggi ke rendah
(S2S1, S1S0, T2T1)
• Konversi ekternal: Perpindahan energy dari
proses interaksi dg molekul2 lain
• Penyilangan intersystem (intersystem
crossing): Pembalikan arah spin e yang
tereksitasi. ST atau sebaliknya
 Intensitas fluoresensi
If = k фf (P0 – PT)

If = intensitas fluoresensi
K = konstanta pengukuran efisiensi
emisi fluoresens
Фf = quantum yield fluoresensi
 Hk Beer

• Po = kekuatan sumber eksitasi

• C = konsentrasi spesi yg
berfluoresensi
• ε =absorptivitas molar
• b =tebal kuvet
Struktur yang dapat berfluoresensi

1. Struktur ikatan rangkap

terkonjugasi.
Contoh struktur aromatik
2. Gugus substituen pada molekul,
gugus pengarah orto dan para.
3. Struktur rigid
 Faktor yang mempengaruhi
intensitas fluoresens
1) Suhu
semakin tinggi suhu, intensitas fluoresensi semakin
rendah karena tabrakan molekul atau dg antar pelarut
lbh sering terjadi shg E molekul teraksitasi dilepaskan
ke mol pelarut
2) Pelarut
Pelarut polar akan menurunkan E transisi π  π* shg
< dr n  π* intensitas fluor lbh besar.
Pelarut yang mengandung atom berat akan membuat
gerakan orbital dan spin lbh byk shg memperbesar laju
SIC menurunkan fluoresensi tp memperbesar pospo
3) pH
Analit yang bersifat asam atau basa bentuk ionsisasi
dan tdk.
 Faktor yang mempengaruhi
intensitas fluoresens
1) Struktur rigid
intensitas fluoresensi semakin tinggi. Bifenil dan
fluoren. Fluoren lebih tinggi
2) Oksigen terlarut
Oks bersifar paramagnetic shg menyebabkan
quenching (pemadaman sendiri)
3) Pemadaman sendiri
Terjadi krn tabrakan antar molekul itu sendiri
 Keuntungan fluoresens dan
fosfoforensi dibanding absorbsi biasa
1) Fluorimetri lebih peka
Pengukuran dilakukan scr lgsg thd intensitas fluoresens tnp
perbandingan Io. Juga penempatan detector tegak lurus dg
sinar pengeksitasi. Kepekaan ini dipertinggi dengan
memperkuat intensitas sinar eksitasi
2) Lebih selektif
Pada absorbs biasa, hampir semua senyawa menyerap
3) Mengurangi gangguan spectral
Dilakukan dengan merubah λ eksitasi atau emisi.
Gangguan spectral: Gangguan yang ditimbulkan oleh
senyawa lain yang melakukan absorbs dan emisi pada
λ senyawa yang dianalisis
 Instrument
Bedanya memiliki dua sistem optik
Komponen alat :
1. Sumber Cahaya
2. Filter Primer (Monokromator Eksitasi)
3. Sample cell
4. Filter Sekunder (Monokromator Emisi)
5. Fotodetektor
6. Data
Komponen Dasar Alat
• Kategori instrumen fluoresens :
1. Filter Fluorometer (Fluorimeter)
2. Spektrofluorometer

Fluorimeter  filter (selector λ), fixed λ,

spektral atom
Spektrofluorometer  2 monokromator,
scan, range spektral luas (Spektrum
Emisi dan Spektrum eksitasi)
 Sumber Cahaya

• Lampu busur merkuri (365-734nm)

• Lampu busur xenon (250-600nm)
• Keduanya memberi Intensitas yang
lebih kuat drpd deuterium dan tungsten
 Monokromator
• Fungsi sama pada Spektro Uv/ Vis: menyeleksi
radiasi
• Grating: Agar lebih terseleksi dalam memilih
radiasi eksitasi maupun emisi
• Biasanya memakai kromator ganda. Fungsinya
untuk mdptkn kemurnian radiasi, mencegah radiasi
sesatan, radiasi hamburan
• Monokromator pada eksitasi dan emisi
(spektrofluorometer jauh lebih mahal)
 Kisi monokromator
• Scan λ terpilih (200-800 wilayah
fluoresens)
• Analis dapat melihat jalannya sinar dgn
membandingkan spektrum sampel dan
spektrum blank
• Mengecek pergeseran puncak
fluoresens atau munculnya puncak2
baru
 Kuvet

• Wadah sampel
• Dapat berbentuk silinder atau persegi seperti
pada UV/Vis
• Terbuat dari gelas atau silica
• Tempat ruang sampel harus terhindar dari
radiasi sesatan shg perlu pakai tutup
 Detektor

• Karena kecilnya intensitas pendar yang

ditangkap oleh detector maka akan
memberikan tanggapan detector yang
sangat lemah
• Butuh penguat yang memadai
• Dua macam: PMT (Photo Multiplier Tube)
dan PDA (Photo Diode Array)
• Analisis kuantitatif  memilih λ
eksitasi dan emisi yang diinginkan
dan dibandingkan intensitas
fluoresens relatif dari standar dan
sampel yang tidak diketahui

• Monokromator emisi sebaiknya dapat

memisahkan dua line spektral 1,0 nm
 selektifitas baik
 Molekul –molekul yang
berfluoresensi
• Substitusi dapat menunjukkan senyawa berfluoresensi.
Ex: Adrenalin (ada gugus metil)vs noradrenalin (tdk ada
metil). Noradrenalin 20x lbh kuat intensitas
fluoresensinya.
• Masuknya gugus kromofor diperpanjang. Ex.
Etinilekstranadiol. Steroid dengan kromofor diperpanjang
muncul 2 lamda eksitasinya.
• Gugus pendorong e terikat pada ikitana pi akan
meningkatkan intensitas fluoresensi. Penarik e
mengurangi intensitas
• Rangkap terkonjugasi meningkatkan intensitas
Jenis senyawa berfluoresensi
1. Senyawa-senyawa berfluoresensi intrinsic (scr alami
dapat berpendar)
2. Senyawa-senyawa yang diubah akhirnya
berfluoresensi.
Melalui
• Induksi kimia (radiasi UV, hidrolisis, dehidrasi as kuat)
• Pengkoplingan/ penggabungan: Rx antara molekul obat
dg reagen fluorometrik (fluoresamin, o-ftaldehid, dansil
klorida) fluorofor
 Hubungan Struktur Mol dg
Fosforisensi
• Eksitasi e yang tidak berpasangan
(non bonding e, n)
• Substitusi pada mol oleh halogen,
logam berat, gugus nitro
GF ini dapat mendorong transisi e dari
keadaan s*  t*
 Penggunaan Fluor dan
Fosforesensi dlm Bdg Farmasi
Keuntungan Fluo dan Fosfo:
• Fluorometri lbh peka. Pengukuran intensitasnya
langsung tanpa membandingkan dengan Io
• Florumetri lbh selektif. Hanya sdkt seny yg dapat
memancarkan kembali sinar fluoresen dan fosforesen
• Gangguan spectral dapat dikurangi: Gangguan yang
ditimbulkan oleh seny lain yg ikut menyerap dan
mengemisi sinar fluoresens pada lamda yang sama dg
seny yang dianalisis