Spektroskopi Luminesens

• Emisi radiasi dari suatu spesies setelah

Spektroskopi mengabsorbsi radiasi
Luminesens
Fluoresens

Spektroskopi
Fosforesens
luminesens
Rudi Heryanto & Mohamad Rafi
Bagian Kimia Analitik
Kemiluminesens
Departemen Kimia FMIPA IPB

1
 Spektroskopi Berdasarkan Spektroskopi Luminesens
Proses Emisi
• Tipe relaksasi
• Suatu elektron dalam keadaan – Deaktivasi vibrasional atau relaksasi nonradiatif 
tereksitasi akan memiliki energi melepaskan panas
(E2), yang lebih besar
dibandingkan saat pada berada
pada energi yang lebih rendah A* → A + panas
(E1). Saat elektron kembali ke
keadaan dasarnya (relaksasi) – Reaksi fotokimia  melepaskan panas
maka akan melepaskan energi
(ΔE)
A* → X + Y
ΔE = E2 – E1
A* + Z → X + Y
• Banyaknya waktu yang
dibutuhkan saat berada dalam
keadaan tereksitasi adalah 10-5- – Melepaskan foton dari radiasi elektromagnetik →
10-9 detik (eksitasi elektronik) fotoluminesens
atau 10-15 (eksitasi vibrasi)
A* → A + h

2
 Spektroskopi Luminesens
Luminesens  Fotoluminesens (fluoresens, fosforesens) dan
kemilumisens dll
Fluoresens emisi foton dari keadaan tereksitasi singlet ke
keadaan dasar singlet atau antara dua tingkat
energi dengan spin sama (umur rerata elektron
dalam keadaan tereksitasi 10-5-10-8 detik)
Fosforesens emisi foton dari keadaan tereksitasi triplet ke
keadaan dasar singlet atau antara dua tingkat energi
dengan spin yang berbeda (umur rerata elektron
dalam keadaan tereksitasi 10-4 – 104 detik)
Spektroskopi Luminesens
Kemiluminesens → didasarkan kepada emisi radiasi
dari spesies tereksitasi yang
terbentuk sebagai hasil dari suatu
reaksi kimia
• Tidak semua spesi kimia di alam memiliki sifat
luminesens
• Reaksi derivatisasi kadangkala diperlukan untuk
membuat senyawa non-luminesens menjadi
berluminesens
3
 Spektroskopi Luminesens Diagram Tingkat Energi
Diagram tingkat energi
Fluorimetri merupakan metode luminesens yang molekul pada gambar
umum digunakan. Phosphorimetry biasanya disamping
memerlukan suhu seperti nitrogen cair (77K) menggambarkan jalur
untuk relaksasi dari
keadaan tereksitasi
vr: vibrational relaxation
Istilah fluorimetry dan fluorometry digunakan (relaksasi vibrasi)
interchangeably (dapat dipertukarkan) pada ic: internal conversion
literatur kimia (konversi internal)
ec: external conversion
(konversi eksternal)
isc: intersystem crossing
(silang antarsistem)

4
 Fluoresens dan Fosforesens - 1
• Setelah mengabsorbsi radiasi, molekul
dapat kehilangan energi yang diabsorbsi
tersebut dengan cara yang berbeda. Cara
yang umum ditentukan oleh kinetika dari
beberapa reaksi yang bersaing
• Catatan: untuk slaid berikutnya 1- 10 anda
harus mengidentifikasi tiap slaid dengan
diagram tingkat energi pada slaid
sebelumnya
Fluoresens dan Fosforesens - 2
• Salah satu proses yang bersaing yaitu
relaksasi vibrasional yang melibatkan
transfer energi ke molekul disebelahnya
dengan cepat dalam larutan (10-13 detik).
– Pada fase gas, molekul yang bertumbukan
lebih sedikit sehingga lebih umum emisi foton
= energi yang diabsorbsi dalam suatu proses
yang disebut resonance fluorescence.
5
 Fluoresens dan Fosforesens - 3
• Dalam larutan, molekul mengendur
(relaxes) cepat menuju tingkat energi
vibrasional terendah suatu keadaan
elektronik dari keadaan eksitasi (dalam
kasus ini S2). Reaksi yang diinginkan
secara kinetik yaitu konversi internal yang
menggeser molekul dari S2 ke tingkat
energi eksitasi vibrasional S1
Fluoresens dan Fosforesens - 4
• Setelah konversi internal, molekul akan
kehilangan energi lebih lanjut melalui
relaksasi vibrasional. Akibat terjadinya
konversi internal dan relaksasi vibrasional,
kebanyakan molekul dalam larutan akan
meluruh menuju tingkat energi vibrasional
terendah dari keadaan elektronik singlet
terendah sebelum radiasi diemisikan
6
 Fluoresens dan Fosforesens - 6
Fluoresens dan Fosforesens - 5
• Molekul akan melepaskan radiasi foton
Ketika molekul telah mencapai tingkat
(energi) ke tingkat energi lainnya diantara
energi vibrasional terendah dari keadaan
tingkat elektronik singlet dan keadaan dasar
elektronik singlet terendah maka
→ Fluoresens
beberapa peristiwa dapat terjadi yaitu:
• Molekul dapat mengalami silang antarsistem
• Molekul akan kehilangan energi via (intersystem crossing) yang melibatkan kalak
konversi internal tanpa kehilangan radiasi (flip) spin elektron dari keadaan singlet ke
foton, akan tetapi cara ini paling sedikit triplet. Setelahnya molekul meluruh ke
terjadinya tingkat energi vibrasional terendah keadaan
triplet melalui relaksasi vibrasional

7
 Fluoresens dan Fosforesens - 7 Fluoresens dan Fosforesens - 8
• Molekul dapat melepaskan radiasi foton • Pada fluoresens, umur molekul dalam
(energi) ke tingkat energi lainnya diantara keadaan tereksitasi singlet adalah 10-9-10-
tingkat energi triplet terendah dan 7 detik

keadaan dasar yang dikenal sebagai

fosforesens • Pada fosforesens, umur molekul dalam
keadaan tereksitasi singlet adalah 10-6-10
detik (karena transisi dari T1 ke keadaan
dasar → spin forbidden)

8

Efisiensi Kuantum
• Fluoresens, fosforesens, dan konversi
internal merupakan proses yang
berkompetisi. Efisiensi kuantum
fluoresens maupun fosforesens
didefinisikan sebagai fraksi molekul yang
mengalami fluoresens maupun
fosforesens
Fluoresens dan Fosforesens
• Intensitas fluoresens (If) maupun fosforesens (IP)akan
proporsional terhadap jumlah radiasi dari keadaan tereksitasi
hasil absorbsi dan hasil kuantum
• Fluoresens secara umum akan teramati jika mengalami
transisi   * walaupun beberapa transisi n  *
menujukkan fluoresens yang lemah
• Molekul yang mengalami eksitasi elektron yang berada pada
tingkat energi vibrasi terendah dari keadaan tereksitasi triplet
umumnya berelaksasi ke keadaan dasar secara silang
antarsistem ke keadaan singlet atau dengan konversi
eksternal. Fosforesens akan teramati ketika relaksasi terjadi
dengan emisi foton
• Fosforesens lebih terjadi untuk transisi jenis n* yang
memiliki kemungkinan lebih besar untuk silang antarsistem
dibandingkan transisi   *
9
 KONSENTRASI DAN
INTENSITAS FLUORESENS
• Kekuatan radiasi fluoresens (F) proporsional
terhadap kekuatan radiasi yang diserap suatu
molekul untuk eksitasi dan mengalami
fluoresens:
F = K'(P0 - P)
dimana:
P0 = kekuatan sinar yang masuk
P = kekuatan sinar setelah melewati sampel
dengan ketebalan b
K' = konstanra yang bergantung pada faktor
eksperimen dan efisiensi kuantum fluoresens
KONSENTRASI DAN
INTENSITAS FLUORESENS
• Hukum Beer disusun kembali menjadi:
P/P0 = 10-bc
dengan A = bc adalah absorbans
substitusinya memberikan:
F = K'P0(1 - 10- bc)
• Ini merupakan hukum fluoresens
• Tidak seperti hukum Beer, fluoresens tidak
selalu linier hubungannya dengan
konsentrasi

10
 KONSENTRASI DAN KONSENTRASI DAN
INTENSITAS FLUORESENS INTENSITAS FLUORESENS
• Ekpresi tersebut dapat diekspansi menjadi (Taylor which demonstrates two important points:
series):

 (2.3bc) 2 (2.3bc)3  • that at low concentrations fluorescence

F = K P0 2.3bc -    intensity is proportional to concentration;
 2! 3! 
• Perkiraan yang baik jika bc kecil (< 0.05) • that fluorescence is proportional to the
sehingga hanya suku pertama saja dalam seri
tersebut yang signifikan maka persamaan di atas incident power in the incident radiation at
akan menjadi: the absorption frequency.

F = 2.3K'bcP0

11
 KONSENTRASI DAN Faktor Struktur Yang Mempengaruhi Fluoresens
INTENSITAS FLUORESENS 1. Fluoresens dapat terjadi pada molekul aromatik atau yang memiliki
konjugasi dengan derajat stabilitas resonansi yang tinggi
2. Fluoresens juga dapat terjadi pada sistem aromatik polisiklik
3. Substituen seperti –NH3, –OH, –F, – OCH3, – NHCH3, dan –
N(CH3)2 acapkali meningkatkan fluoresens
F
4. Dilain pihak, gugus berikut dapat menurunkan ataupun
memadamkan fluoresens: –Cl, –Br, –I, –NHCOCH3, – NO2, –
COOH.
For a
5. Kekakuan molekul dapat meningkatkan fluoresens. Zat akan
concentration
above c1 the berfluoresens lebih terang pada keadaan kekacaan atau larutan
calibration kental. Pembentukan kelat dengan ion logam dapat pula
curve is no menyebabkan fluoresens.
c1 longer linear.
6. Pengubahan sistem pH akan menyebabkan kromofor mengalami
Conc. of fluorescing species perubahan pula yang dapat mempengaruhi fluoresens

12
Faktor Struktur Yang Mempengaruhi Fluoresens
Molekul aromatik yang tidak
dapat mengalami fluoresens
Faktor Struktur Yang Mempengaruhi Fluoresens
Efek ketegaran molekul
terhadap hasil kuantum.
Molekul fluorena lebih
kaku dibandingkan bifenil
yang dapat berotasi
Efek kekakuan terhadap hasil
kuantum di senyawa kompleks.
8-hidroksikuinolina bebas dalam
larutannya sangat mudah
terdeaktivasi akibat benturannya
dengan pelarut dan tidak
berfluoresens.
Molekul aromatik yang dapat
mengalami fluoresens Kekakuan dari kompleks Zn 8-
hidroksikuinolina meningkatkan
fluoresens
13
Efek substituen terhadap fluoresens pada senyawa benzena Fluoresens dan Lingkungannya
1. Suhu: kenaikan suhu hampir selalu terikuti dengan turunnya
Substituen Perubahan pada  perubahan intensitas fluoresens karena frekuensi benturan yang lebih besar antar
fluoresens fluoresens molekul akan meningkatkan kemungkinan deaktivasi oleh
Alkil Tidak Tidak konversi internal dan relaksasi vibrasi
OH, CH3, OC2H5 Turun Naik 2. pH : perubahan dalam nilai pH mempengaruhi derajat ionisasi
COOH Turun Penurunan besar
yang dapat memberikan pengaruh tingkat konjugasi atau
aromatisitas senyawa
NH2, NHR, NR2 Turun Naik
NO2, NO - Padam
3. Oksigen terlarut: oksigen terlarut acapkali menurunkan
fluoresens secara dramatis dan merupakan pengganggu dalam
CN Tidak Naik
kebanyakan metode fluorometri. Molekul oksigen bersifat
SH Turun Naik paramagnetik (memiliki keadaan dasar triplet)  silang
F, Cl, Br, I Turun (F I) Naik ( F  I ) antarsistem dari keadaan singlet ke triplet pada molekul lain.
SO3H Tidak Tidak Umur yang lebih panjang pada keadaan triplet akan
meningkatkan peluang untuk terjadinya deaktivasi nirsinar. Zat
paramagnetik lain termasuk logam transisi akan memberikan
Hargis LG. 1988. Analytical Chemistry-Principles and Techniques. Prentice-Hall. halaman 435
efek yang sama

14
 Fluoresens dan Lingkungannya
4. Pelarut: pelarut mempengaruhi fluoresens lewat
kemampuannya menstabilisasi perbedaan keadaan dasar dan
tereksitasi, dengan cara demikian mengubah peluang dan
energi dari absorpsi dan emisi
Problem dalam pengukuran fluoresens
1) Material rujukan dapat berfluoresens seperti sampel
 kontamisasi oleh pengganggu
 hamburan Raman dan Rayleigh
2) Pembacaan Fluoresens yang tidak stabil
 Pengabutan pada kuvet ketika isinya lebih dingin
daripada suhu sekitar
 Noda cairan di permukaan luar kuvet
 Sinar melewati diatas meniskus larutan dalam kuvet
 Adanya gelembung udara dalam kuvet
 Pemadaman : molecular oxygen
3) Sensitivitas yang takpadan
Problem Fotolumisens
1) Pemadaman sendiri
Pemadaman sendiri dihasilkan ketika molekul yang
berluminesens berbenturan dan kehilangan energi
eksitasinya oleh transfer nirsinar. Penyebabnya: bahan
asing, oksigen terlarut, dan atom berat atau spesi
paramagnetik (zat aromatis adalah penyebab utama).
2) Absorpsi energi radiasi
Absorpsi salah satu dari radiasi yang mengeksitasi atau
luminesens akan mereduksi sinyal luminesens.
Perbaikannya melibatkan (a) melarutkan sampel, (b)
membaca luminesens di dekat permukaan depan sel, dan
(c) menggunakan metode standar adisi untuk
mengevaluasi sampel
15
 Problem Fotolumisens Spektrum Eksitasi Vs Emisi
Spektrum eksitasi: mengukur
3) Absorpsi sendiri intensitas luminesens pada panjang
Attenuation of the exciting radiation a sit passes through the gelombang tetap sementara
panjang gelombang eksitasi
cell can be caused by too concentrated an analyte. The
bervariasi
remedy is to dilute the sample and note whether the
luminescence increases or decreases. If the luminescence Spektrum emisi: eksitasi pada
increases upon sample dilution, one is working on the high- panjang gelombang tetap
concentration side of the luminescence maximum. This sementara pencatatan intensitas
region should be avoided. emisi sebagai fungsi panjang
gelombang
4) Pembentukan eksimer
Formation of a complex between the excited-state molecule Fosforesens umumnya terjadi pada
and another molecule in th ground state, called an excimer, panjang gelombang yang lebih
causes a problem when it dissociates with the emission of tinggi dibandingkan fluoresens.
Perbedaan panjang gelombang 
luminescent radiation at longer wavelengths than the normal
perbedaan energi antara keadaan
luminescence. Dilution helps lesson this effect.
triplet dan singlet

16
 Instrumentasi: Instrumentasi:
Spektrofotometer Fluoresens Spektrofotometer Fosforesens

17
 Instrumentasi Aplikasi
• The fluorescence is often viewed at 90° orientation (in
order to minimise interference from radiation used to excite 1) Pengukuran langsung --- kation logam yang dikelat sehingga
the fluorescence). berfluoresens
• The exciting wavelength is provided by an intense source 2) Pengukuran taklangsung:
such as a xenon arc lamp (remember F  P0).
fluoresens dari zat yang akan ditentukan diukur sebelum dan
• Because An intense monochromatic light source is sesudah pemadaman
required .
fluoresens dari zat yang ditentukan ditingkatkan dengan
• Lasers are an almost ideal light source for
menambahkan material yang dapat bereaksi
fluorimetry (laser-induced fluorescence) but are too
expensive and/or impractical for most routine 3) Teknik perunut --- bioengineered analysis.
applications. FISH(fluorescence in situ hybridization)
• Two wavelength selectors are required filters (in
5) SFS (spectral fluorescent signatures)
fluorimeters) and monochromators (in
spectrofluorometers).

18
 4-Bromometil-7-
metoksikumarin spesifik
Aplikasi untuk asam karboksilat

Fluoreskamina, spesifik
untuk amina primer dan
sekunder

OPA, spesifik untuk N-

metilkarbamat dan amina
primer

9-fluorenilmetoksikarbonil(FMOC)
Amina primer (contoh: Glufosinat)

Reaksi derivatisasi untuk deteksi fluoresens

19
Examples of naturally fluorescent organic compounds
Compound Wavelength or Range of em(nm) Compound Wavelength or Range of em(nm)

Aromatic hydrocarbons Drugs

Naphthalene 300-365 Asprine 335
Anthracene 370-460 Codeine 350
Pyrene 370-400 Diethylstibestor 435
1,2-Benzopyrene 400-450 Estrogens 546
Heterocyclic compound Lysergic acid diethylamide(LSD) 365
Quinoline 385-490 Phenobarbital 440
Quinine sulfate 410-500 Procaine 345
7-Hydroxycoumarine 450 Steroid
3-Hydroxyindol 380-460 Aldosterone 400-450
Dyes Cholesterol 600
Fluorescein 510-590 Cortisone 580
Rhodamine B 550-700 Prednisolone 570
Methylene Blue 650-700 Testosterone 580
Naphthol 516 Vitamines
Coenzymes, nucleic acids, pyrimidines Ribofravin(B2) 565 Kurva linear kalibrasi untuk
Adenine 380 Cyanocobalamin(B12) 305 fluoresens antrasena yang diukur Kurva kalibrasi untuk
Adenosine triphosphate(ATP) 390 Tocopherol(E) 340
Nicotinamide adenine
pada panjang gelombang penentuan triptofan secara
dinucleotide(NADH) 460 maksimum fluoresensnya spektrofluorometri dalam
Purine 370 protein
Thymine 380

20