Mikrobiologi Farmasi

Uji Endotoksin

Oleh: M. Ikhwan Setiawan

Sekolah Tinggi Teknologi Industri & Farmasi

1
Produk Farmasi Parenteral
• Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena
pemberian langsung ke sistem sirkulasi pembuluh
darah

2
Produk Farmasi Parenteral
• Salah satu tahap : Sterilisasi
• Produk parenteral terkadang terkontaminasi oleh
ENDOTOKSIN

3
Bagaimana produk parenteral
dapat terkontaminasi endotoksin?
• Pada proses sterilisasi produk parenteral (menggunakan
panas), bakteri gram negatif yang mungkin ada dalam
produk, akan mati dan terjadi lisis, kemudian endotoksin
akan terlepas dari sel bakteri dan tetap tinggal di dalam
produk parenteral tsb.
• Sifat endotoksin: stabil
terhadap panas (heat-
stable)

4
 Pemantauan Endotoksin

Pengujian endotoksin dilakukan pada bahan baku yang

digunakan maupun pada produk akhir
5
Endotoksin & Pirogen
Endotoksin adalah toksin yang merupakan bagian
membran luar dinding sel bakteri gram negatif
Pseudomonas
aeruginosa

6
Endotoksin & Pirogen
• Pirogen (dari kata Pyro: “demam”, gen=“menghasilkan”)
• Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan kenaikan suhu
tubuh akibat penggunaan produk farmasi yang diberikan secara
intravena.

7
Klasfikasi Pirogen
Sifat Pirogen
• Thermostabil, proses sterilisasi > 200ºC.
• Larut dalam air. Sehingga tidak bisa memakai
penyaring bakteri.
• Tidak dipengaruhi oleh bakterisida yang biasa.
• Tidak menguap
• Berat molekul (BM) antara 15.000 – 4.000.000
• Ukuran umumnya 1 – 50 milli-µm

9
Endotoksin vs Exotoksin
Karakteristik Endotoksin Exotoksin
Pelepasan toksin Lisis sel sel yang baik

Komposisi Protein = Antigen Protein

  Polisakarida = Zat Imun  
  Lipida = Toksin  
Stabilitas terhadap
panas Lebih stabil kurang stabil

Pewarnaan Gram Negatif Positif

Toksisitas Kurang toksik lebih toksik

Penyebab demam ya tidak

10
Endotoksin & Pirogen
• Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak
semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin
• Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida (LPS),
umumnya terikat pada protein dan fosfolipid. LPS ini
menyusun membran luar bakteri gram negatif.

11
Endotoksin
Struktur LPS
Contoh: LPS dari Salmonella terdiri dari bagian Lipid A yang
hidrofob yang terikat pada suatu daerah inti yang mengandung
molekul KDO (2-keto-3-deoksioktonat)

13
Efek endotoksin bagi tubuh
• Menyebabkan demam
• aktivasi sistem sitokin
• rusaknya sel-sel endotelial
• permeabilitas pembuluh darah berubah
sehingga menyebabkan turunnya tekanan
darah
• dll.

14
Perkembangan regulasi tentang uji
pirogen
• Bacterial Endotoxin Test (BET) merupakan salah satu uji yang
penting terhadap produk parenteral dan alat kesehatan
• 1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode kelinci (Rabbit test)
• Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942 sampai 40 tahun
kemudian
• 1980 : metode baru diterapkan yaitu Limulus amoebocyte lysate
(LAL) test

16
LAL Test
• Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test adalah uji in vitro
untuk deteksi dan analisis endotoksin bakteri.

Metode Gel-Clot
• Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik
gel-clot, turbidimetri kinetik, dan kromogenik
(kolorimetri) 17
Mengapa LAL test?
• LAL test merupakan metode alternatif terhadap rabbit pyrogen
test yang difokuskan pada deteksi senyawa pirogen dalam
produk, untuk menghindari penggunaan hewan/binatang dalam
percobaan
• Metode lebih akurat

18
 Apa LAL?
• Adalah ekstrak dari sel darah kepiting tapal kuda yang
menggumpal bila bereaksi dengan endotoksin dari
bakteri gram negatif.

• Limulus ............... spesies dari kepiting

• Amebocyte ......... Sel darah
• Lysate .................. Bahan terbentuk dari
proses lisis sel

19
Limulus amebocyte lysate
Lisat diperoleh dari amubosit kepiting ladam kuda
(Limulus polyphemus)

20
Limulus amebocyte lysate
• Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari
pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri gram negatif
pada Limulus polyphemus menyebabkan koagulasi
intravaskular yang parah.

• Th 1964, Levin and Bang

kemudian menunjukkan
bahwa penggumpalan itu
merupakan hasil reaksi
antara endotoksin dan
protein yang dapat
menggumpal dalam
amubosit.

21
Limulus amebocyte lysate
• Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian
dan karaterisasi protein yang dapat bergumpal dari reaksi LAL
dan menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin merupakan
reaksi enzimatik.

22
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Fosil Limulus polyphemus

23
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Ukuran bervariasi

24
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Penangkapan oleh nelayan
• Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang berukuran besar
ditangkap.

25
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Pengumpulan

26
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Pembersihan, cek kesehatan

27
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Darah diambil dengan jarum suntik

28
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Dilepas kembali 70-80 mil dari tempat ditangkap

29
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Isolasi dan sentrifuge untuk mendapat amoebocyte

30
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
sentrifuge

31
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Pengisian dengan filling machine

32
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Amoebocyte lalu di freeze-dried dan diproses untuk
digunakan.

33
Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Quality Control sebelum release

34
Metode LAL yang direkomendasi
oleh FDA – USA
1. Gel-Clot
2. Kinetik turbidimetri
3. Kromogenik

35
Metode LAL yang direkomendasi
oleh FDA – USA
1. Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan
adanya endotoksin
2. Metode kinetik turbidimetri : menggunakan kecepatan
pembentukan gel untuk menentukan kandungan endotoksin
3. Metode Kromogenik : menggunakan substrat kromogenik
sintetik, dengan adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan
warna kuning dan secara linier ekuivalen dengan konsentrasi
endotoksin yang ada

36
Metode LAL yang direkomendasi
oleh FDA – USA
# Metode kromogenik ada 2 :
 End point chromogenic
 Kinetic chromogenic

• Pemilihan metode tergantung pada penggunaan, volume uji,

dan tipe produk

37
Nama Indonesia
• Kepiting Ladam Kuda
• Kepiting Tapal Kuda

38
Prinsip LAL test
1. Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari kepiting landam
kuda terhadap invasi bakteri gram negatif.
2. Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting
landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan
ion-ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi
3. Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi proenzim dalam
lisat amubosit Limulus. Kecepatan awal aktivasi ditentukan oleh
konsentrasi endotoksin

39
Prinsip LAL test ..2
4. Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim koagulase)
menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal
(koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus
menghasilkan koagulin.
5. Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan
sendirinya dan membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel

40
Skema reaksi enzimatik pada
penggumpalan LAL

41
Penetapan batas endotoksin
• 1983 : FDA menentukan batas endotoksin berdasarkan dosis
maksimum sediaan obat untuk manusia atau kelinci
• dan penyesuaian batas endotoksin untuk semua obat (kecuali
intratekal) dari 2,5 EU kg -1 sampai 5,0 EU kg -1
• EU = Endotoxin Unit
• Batas deteksi untuk beberapa produk diperoleh dari monografi
USP atau EP. Kalau tidak dinyatakan dalam farmakope, batas
endotoksin harus dihitung dari dosis maksimum manusia

42
Beberapa istilah lain untuk
batas deteksi endotoksin
• EL: Endotoksin Limit
• MAEC: Maximum Allowable Endotoxin
Concentration
• „ERL: Endotoxin Release Limit
• „ELC: Endotoxin Limit Concentration

43
Endotoksin Limit

EL = Endotoksin Limit
K = konstanta, 5 EU atau IU per kg berat badan,
M = dosis maksimum untuk manusia per kg per jam.

Umumnya dinyatakan sbb :

• Batas endotoksin untuk berat badan rata-rata 70 kg = 350 EU
per jam (5 EU kg-1)

44
LAL test untuk alat kesehatan
• Kadar endotoksin pada alat kesehatan diperoleh
dengan prosedur ekstraksi, yaitu dengan cara
merendam sejumlah alat pada cairan pengekstraksi
bebas pirogen.
• Nilai batas 20 EU per alat dinyatakan dalam USP, jadi
batas maksimum konsentrasi endotoksin yang diijinkan
dalam cairan hasil ekstraksi dihitung dengan rumus:
• ERL = K x N/V
K = 20 EU, N = jumlah alat, V = total volume larutan ekstraksi

45
Metode Gel-Clot
• Pada metode ini, hasil akhir dapat dideteksi berupa
pembentukkan gel permanen (tidak tumpah saat
dibalikkan 180 derajat)
• Perlu pembanding, berupa Control Standard Endotoxin
(CSE)
• Peralatan gelas yang digunakan harus di “depirogenasi”

46
Prinsip uji dan prosedur
• 100 ul CSE dimasukkan ke dalam tabung gelas depirogen
(positive control)
• LRW = LAL Reagent Water (air bebas pirogen)
• Sampel jumlah sama
• + 100 ul lysate
• Inkubasi 37°C di atas penangas air selama 1 jam
• Tabung lalu dibalik perlahan (180° ) untuk melihat Gel padat
yang terbentuk

47
Hal yang harus diperhatikan dalam
metode gel-clot
• Untuk membuat alat-alat depirogen : pemanasan pada 180°C,
selama 4 jam atau 250°C selama 30 menit
• Teknik pengerjaan pada saat membalik tabung kira-kira selama
2 detik
• pH sampel 7,0 – 8,0. Jika diperlukan pH diatur menggunakan
asam atau basa bebas pirogen.

48
Metode kromogenik
• Metode kromogenik merupakan metode LAL test yang banyak
digunakan saat ini karena lebih mudah dan murah
• Sesuai untuk jumlah produk yang diuji tidak banyak dan tidak
sering (infrequent)
• Digunakan untuk uji sampel serum pada uji klinis

49
Prinsip uji dan prosedur
• Endotoksin akan mengkatalisis aktivasi suatu proenzim
• Enzim yang teraktivasi akan mengkatalisis terpecahnya PNA dari
substrat.
• PNA yang dilepaskan diukur secara spektrofotometri pada 405
nm
• Nilai absorbans
sebanding dengan
jumlah endotoksin ,
dibandingkan
terhadap
endotoksin standard
menggunakan kurva
standard
50
Aplikasi Endotoksin Testing
• Obat Injeksi
• Alat Kesehatan
• Produk Biologi
• Media Kultur Jaringan
• Larutan Hemodialisa
• Produk Air
• Uji Air Murni untuk industri
semi konduktor
• Makanan/minuman
• Penelitian klinik
51
Selesai