ENDOTOKSIN

PENDAHULUAN

Produk
farmasi Steril Sterilisasi Endotoksin
parenteral
 Bagaimana Produk Parenteral
dapat Terkontaminasi Endotoksin?

Endotoksin
Bakteri gram Endotoksin stabil
Sterilisasi
negatif lisis keluar terhadap
panas
 Endotoksin dan Pirogen

• Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh bakteri

gram negatif
• Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan kenaikan
suhu tubuh akibat penggunaan produk farmasi yang
diberikan secara intravena
• Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak semua
senyawa pirogen itu merupakan endotoksin
• Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida(LPS),
umumnya terikat pada protein dan fosfolipid. LPS ini
menyusun membran luar bakteri gram negatif.
 Sumber Pirogen

Pembagian Pirogen

Pirogen eksogen Pirogen Endogen

 Efek Endotoksin Bagi Tubuh

• Demam
• Aktivasi sistem sitokin
• Rusaknya sel-sel endotelial
• Permeabilitas pembuluh darah berubah
sehingga menyebabkan turunnya tekanan
darah
 Cara Depirogenasi
Cara menghilangkan endogen :
1.Menginaktivasi
2.Menghilangkan endogen
 1. Cara Menginaktivasi
a. Hidrolisis asam basa
Depirogenasi menggunakan hidrolisis asam
basa/alkali menurunkan atau menghilangkan
aktivasi biologi dari lippolisakarida bakteri
dengan aktivasi lemak A.
b. Oksidasi
Pengetahuan tentang inaktivasi oksidasi dari
endotoksin dapat ditemukan ketika Hanrd
melaporkan bahwa sel Salmonella typosa
menghilangkan kapasitas produksi demam
ketika dicuci dengan H2O2
 1. Cara Menginaktivasi
c. Alkilasi
Endotoksin dilaporkan dengan bahan pengalkil
menurunkan pirogenitas endotoksin, dihilangkan
dengan asam anhidrat
d. Perlakuan dengan panas kering
e. Perlakuan dengan panas lembab
f. Radiasi ionisasi
g. Polimiksin B
h. LAL (Limolas Amobacyte Lisate)
2. Cara Menghilangkan Endotoksin

a. Pembilasan
b. Destilasi
c. Ultrafiltrasi
d. Osmosa bolak balik
e. Karbon aktif
f. Daya tarik elektrosatik dengan jalan modifikasi
media
g. Daya tarik hidrofobik pada media hidrofobik
 Perkembangan Regulasi tentang Uji
Pirogen
• Bacterial endotoxin test (BET) merupakan salah
satu uji yang penting terhadap produk parenteral
dan alat kesehatan
• 1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode
kelinci (Rabbit test)
• Digunakan dalam USP XII pada tahun1942 sampai
40 tahun kemudian
• 1980 : metode baru diterapkan yaitu Limulus
amoebocyte lysate (LAL) test
 LAL-Test

• The Limulus amebocyte lysate (LAL) test

adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis
kuantitatif endotoksin bakteri.
• Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup
teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan
kromogenik (kolorimetri)
 LAL-Test

Metode Gel • LAL menggumpal karena endotoksin

Clot
Metode Kinetik • Kecepatan pembentukan gel

Turbidimetri
Metode • Menggunakan substrat kromogentik
sintetik
Kromogenik • Menghasilkan warna kuning
 Mengapa LAL test?

LAL-Test

Metode alternatif untuk menghindari

penggunaan hewan percobaan

Lebih akurat
 LAL-Test

• Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda

(Limulus polyphemus)
• Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari
pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri gram
negatif pada Limulus polyphemus menyebabkan
koagulasi intravaskular yang parah.
• Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan
bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi
antara endotoksin dan protein yang dapat
menggumpal dalam amubosit.
 LAL-Test

• Solum (1970, 1973) dan Young (1972),

melakukan pemurnian dan karaterisasi protein
yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan
menunjukkan bahwa reaksi dengan
endotoksin merupakan reaksi enzimatik.
 Cara memperoleh lysate

Kepiting laman
Cek kesehatan Darahnya diambil
kuda ditangkap

Disentrifugasi
Amoebpcytes di (memisahkan
freeze-dried amoebocytes dan
plasma cair)

Harganya : One quart of LAL is worth $15,000

 Prinsip LAL Test

• Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari

kepiting landam kuda terhadap invasi bakteri
gram negatif.
• Bahan-bahan yang terkandung dalam
amubosit kepiting landam kuda terdiri dari
berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion
yang berinteraksi menyebabkan koagulasi
 Prinsip LAL Test

Endotoksin Hidrolisis ikatan Koagulin

mengkatalisis spesifik pada bergabung dan
aktivasi proenzim protein membentuk
dalam LAL penggumpal gumpalan
 LAL-Test

• 1983 : FDA menentukan batasen dotoksin berdasarkan

dosis maksimum sediaan obat untuk manusia atau
kelinci
• Dan penyesuaian batas endotoksin untuk semua obat
(kecuali intratekal) dari 2,5 EU/kg sampai 5,0 EU/kg
• EU = Endotoxin Unit
• Batas deteksi untuk beberapa produk diperoleh dari
monografi USP atau EP. Kalau tidak dinyatakan dalam
farmakope, batas endotoksin harus dihitung dari dosis
maksimum manusia
 Perhitungan LAL Test

EL = K/M

• EL = Endotoksin Limit
• K = konstanta= 5 EU atau IU per kg berat badan
• M = dosis maksimum untuk manusia per kg per
jam.
• Umumnya dinyatakan sbb:
Batas endotoksin untuk berat badan rata-rata 70
kg = 350 EU per jam (5 EU/kg)
Perhitungan LAL Test
Perhitungan LAL Test
 Contoh

• Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosis

maksimum 2 unit per kg dan sensitivitas lisat
0,125 unit/ml, maka
• MVD = 100 x 5 = 1: 2000
0,125 x 2
• Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC
• MVD = potensi sediaan/MVC
 Metode Gel-Clot (LAL Test)

• Pada metode ini, hasil akhir dapat dideteksi

berupa spot pada slide, atau microplate
• Perlu pembanding, berupa Control Standard
Endotoxin (CSE)
• Peralatan gelas yang digunakan harus di“de-
pirogenasi”
Metode Gel-Clot (LAL Test)
100 μl CSE (kontrol positif)
LAL Reagent water (kontrol negatif)
Sampel jumlah sama

+ 100 μl Lysate

Inkubasi pada suhu 37ºC

selama 1 jam

Tabung dibalik perlahan

(180º)

Amati terjadinya gumpalan

 Hal-Hal yang Harus Diperhatikan

• Untuk membuat alat-alat depirogen:

pemanasan pada 180°C, selama 4 jam atau
250°C selama 30 menit
• Teknik pengerjaan pada saat membalik tabung
kira-kira selama 2 detik
• pH sampel 7,0 –8,0. Jika diperlukan pH diatur
menggunakan asam atau basa depirogen
Menggunakan Hewan Uji (Rabbit Test)
 Alat dan Pengencer
• Alat suntik, jarum dan alat kaca dibebas
pirogenkan dengan pemanasan pada suhu
250º C selama tidak kurang dari 30 menit
• Lakukan uji pirogen terhadap pengencer dan
larutan pencuci dan pembilas secara berkala.
• Apabila digunakan injeksi NaCl sebagai
pengencer, gunakan injeksi yang mengandung
larutan NaCl PO 9 %.
 Termostar
• Gunakan alat pengukur suhu yang teliti seperti
termometer klinik atau termistor atau alat sejenis
yang telah dikalibrasi
• Ketelitian skala kurang lebih 0,1
• Pembacaan suhu maximum tercapai < 5 menit
• Masukkan alat pengukur suhu kedalam anus
kelinci dengan kedalam tidak < 7,5 cm dan
sesudah jangka waktu tidak kurang dari yang
telah ditetapkan sebelumnya, tekan suhu tubuh
kelinci.
 Hewan Uji
• Tempatkan kelinci satu ekor dalam satu kandang
dalam ruang dengan suhu yang seragam antara
20-23º dan bebas dari gangguan yang
menimbulkan kegelisahan
• Adaptasikan kelinci tidak boleh lebih dari tujuh
hari
• Kelinci tidak boleh digunakan untuk uji pirogen
lebih dari sekali dalam waktu 48 jam sebelum 2
minggu setelah digunakan untuk uji pirogen bila
menunjukkan kenaikan suhu maksimal 0,6o atau
lebih
 Prosedur
• Kelinci tidak diberi makan selama waktu
pengujian
Tentukan suhu awal Hangatkan larutan
kelinci (tidak boleh sebelum
lebih dari 39,8º penyuntikkan 37±2º

Catat kenaikan suhu Suntikkan 10 ml/kg

jam ke 1 dan jam ke BB melalui vena
2 telinga
 Penafsiran Hasil
• Sediaan memenuhi syarat apabila tak seekor
kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0,5º atau
lebih.
• Jika ada kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu
0,5º atau lebih. Lanjutkan pengujian dengan
menggunakan lima ekor kelinci.
• Jika tidak lebih dari tiga ekor dari 8 ekor kelinci
masing-masing menunjukkan kenaikan suhu 0,5º
atau lebih dan jumlah kenaikan suhu maksimal 8
ekor kelinci tidak lebih dari 3,3º sediaan
dinyatakan memenuhi syarat bebas pirogen.