 Pada proses sterilisasi produk parenteral

(menggunakan panas), bakteri gram negatif

yang mungkin ada dalam produk, akan mati
dan lisis terjadi, endotoksin akan terlepas dan
tetap tinggal dalam produk
 Sifatnya stabil terhadap panas (heat stable)
 Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi
tidak semua senyawa pirogen itu merupakan
endotoksin
 Endotoksin bakteri terdiri dari
Lipopolisakarida (LPS), umumnya terikat pada
protein dan fosfolipid. LPS ini menyusun
membran luar bakteri garam negatif
 Contoh : LPS dari Salmonella terdiri dari
bagian lipid A yang hidrofob terikat pada
suatu daerah inti yang mengandung molekul
2-keto-3-deoksioktanat (KDO)
 Demam
 Aktivasi sistem sitokin
 Rusaknya sel-sel endotelial
 Permeabilitas pembuluh darah berubah
sehingga menyebabkan turunnya tekanan
darah
 Dll
 Pengujian dapat dilakukan dengan 2 cara :
1. Pengujian pirogen
2. Pengujian endotoksin bakteri (BET, bacterial
endotoxin test)
 BET (Farmakope Indonesia) memanfaatkan
protein yang berada dalam sitoplasma sel-sel
tertentu (amoebocytes) yang biasa terdapat
dalam sirkulasi darah kepiting landam kuda.
 Prinsip : injeksi IV ke tubuh kelinci dibawah
kondisi tertentu dan selanjutnya dipantau dan
dicatat temperatur 3 kelinci dalam jangka
waktu tertentu
 FI  suatu sediaan dinyatakan memenuhi
syarat, jika kenaikan suhu ketiga kelinci tidak
melebihi batas tertentu; dan tidak memenuhi
syarat jika total kenaikan suhu ketiga kelinci
melebihi batas tertentu (lihat tabel)
 Kelinci yang digunakan temperaturnya tidak
boleh berbeda lebih dari 1º satu dengan yang
lainnya
Jumlah Sediaan uji memenuhi syarat Sediaan uji tidak memenuhi
kel3inci jika jumlah respon tidak syarat jika jumlah respon
melebihi (ºC) melebihi (ºC)
3 1,20 2,70
6 2,80 4,30
9 4,50 6,00
12 6,60 6,60
 The Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test
adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis
kuantitatif endotoksin bakteri
 LAL diperoleh dari ekstrak cair amebosit
horseshoes crab (limulus polyphemus atau
Tachypleus tridentatus)
 Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup
teknik gel-clot dan tubidimetri kinetik dan
kromogenik (kolorimetri)
 Reagen lisat mengandung protein yang
mengikat LPS bereaksi 
mengkoagulasikannya.
 LAL test : metode alternatif terhadap rabbit
pyrogen test yanng difokuskan pada deteksi
senyawa pirogen dalam produk untuk
menghindari penggunaan hewan / binatang
dalam percobaan
 Metode lebih akurat
 Pembentukan gel padat pada titik akhir reaksi sebagai
hasil reaksi antara LAL dan endotoksin
 Reagen LAL + larutan uji dalam tabung reaksi dengan
volume yanng sama
 Inkubasi 37o selama 60 menit
 Reaksi (+) : gel stabil dan melekat pada dasar tabung
bila dibalikkan 180oC

Alat : tabung reaksi, pipet ukur, pengocok vorteks, oven

inkubator
Reagen LAL : ekstrak amebosit dalam kepiting landam
kuda, Limulus polyphemus (atlantic horseshoecrab)
Reagen TAL : Tachypleus Amebocyte tridentatus
(japanese horseshoes crab atau chines)
 Pengujian penggumpalan didasarkan pada
interpretasi visual titik akhir  menunjukkan
pembentukan penggumpalan gel.
 Hal ini bersifat subjektif dan merupakan hasil
kualitatif.
 Metode lain  menggunakan instrumen yang
secara otomatis menentukan titik akhir
 Pengujian khromogenik  menggunkan
modifikasi reagen lisat mengandung suatu
khromofor yang diaktivasi oleh reaksi lisat-
endotoksin
 Metode turbidimetri  didasarkan pada
pengukuran otomatis densitas optik
pembentukan gel
 Metode kinetik  secara otomatis menentukan
pembentukan warna (khromogenik) maupun
 Penggunaan instrumen :
1. Lebih akurat
2. Untuk pengujian sampel secara simultan
3. Menghindari kesalahan manusia
4. Harus divalidasi
 Teknik kinetik-turbidimetri
 Endotoksin mengaktifkan enzim pada LAL
menghasilkan gelatinasi koagulin dalam LAL,
sehingga meningkatkan turbiditas sampel
 Perubahan transitans selama kurun waktu
tertentu diukur (kinetik) untuk mengukur
waktu gelatinasi dari awal sampai akhir reaksi
 Gelation time (waktu gelatinasi)_ secara
langsung berhubungan dengan jumlah
endotoksin dalam sampel
1. Pengujian lebih sensitif
2. Pengujian lebih cepat
3. Memerlukan material uji dalam jumlah kecil
4. Kontrol positif dan negatif, dapat dilakukan
untuk setiap pengujian
5. Tidak menyebabkan kelinci mengandung
bahan radioaktif  keamanan radiologi
6. Lebih murah dan mudah disimpan