PIROGEN DAN

DEPIROGENISASI
definisi

■ Pirogen di definisikan sebagai suatu produk yang bersifat

termostabil, dapat difiltrasi (filtrable) dan larut air dari sisa
bakteri pada sediaan injeksi yang dapat menghasilkan reaksi
pirogenik.
■ Dapat berupa antigen atau kompleks polisakarida bakteri
■ Dapat dihasilkan oleh bakteri, kapang dan khamir
Efek pirogen bagi tubuh

• demam
• rusaknya sel-sel endotelial
• permeabilitas pembuluh darah
berubah sehingga menyebabkan
turunnya tekanan darah
Sumber pirogen

■ Air destilasi yang terkontaminasi bakteri yang terbawa oleh

udara yang dapat tumbuh dan memproduksi endotoksin
■ Permukaan Wadah yang digunakan
■ Zat terlarut (dextrosa atau NaCl yang dapat mengandung
pirogen.
depirogenisasi

■ Solvent → destilasi
■ Solute → rekristalisasi
■ Alat →
■ Produk → Penggunaan adsorben → Adsorpsi permukaan
■ Filter asbestos
filtrasi melalui filter pad
■ Arang aktif
0,1 % serbuk arang aktif → aduk 5-10 menit → dekantasi
atau difiltrasi.
 Uji pirogen
■ Uji pirogen pada kelinci
■ menggunakan kelinci dewasa yang sehat untuk menentukan ada
atau tidaknya pirogen dalam produk yang dapat di toleransi oleh
kelinci.
■ Tiga kelinci digunakan; tiapnya diberikan 10 mL larutan uji/kg
secara injeksi melalui vena telinga, pemberian injeksi harus
diselesaikan < 10 menit. Suhu rektal dicatat pada 1,2 dan 3 jam
setelah injeksi. Syarat hasil uji :
Larutan uji tidak memenuhi syarat jika
Larutan uji memenuhi syarat jika jumlah
Jumlah kelinci jumlah respon melebih (oC)
respon tidak melebih (oC)

3 1,2 2,7

6 2,8 4,3

9 4,5 6,0

12 6,6 6,6
Perkembangan regulasi
tentang uji pirogen

◼ Bacterial endotoxin test (BET) merupakan

salah satu uji yang penting terhadap produk
parenteral dan alat kesehatan
◼ 1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode
kelinci (Rabbit test)
◼ Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942
sampai 40 tahun kemudian
◼ 1980 : metode baru diterapkan yaitu
Limulus amoebocyte lysate (LAL) test
LAL-test

◼ The Limulus amebocyte lysate (LAL)

test adalah uji in vitro untuk deteksi
dan analisis kuantitatif endotoksin
bakteri.
◼ Metode analisis LAL yang dilakukan
mencakup teknik gel-clot dan
turbidimetri kinetik dan kromogenik
(kolorimetri)
Metode LAL yang direkomendasi FDA

◼ Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL

menggumpal dengan adanya endotoksin
◼ Metode kinetik turbidimetri : menggunakan
kecepatan pembentukan gel untuk
menentukan kandungan endotoksin
◼ Metode Kromogenik : menggunakan
substrat kromogenik sintetik, dengan
adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan
warna kuning dan secara linier ekuivalen
dengan konsentrasi endotoksin yang ada
Prinsip LAL test
• Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari
kepiting landam kuda terhadap invasi bakteri gram
negatif.
• Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit
kepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein,
faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi
menyebabkan koagulasi
• Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi
proenzim dalam lisat amubosit Limulus. Kecepatan
awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi
endotoksin
◼ Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim
koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam
suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga
terdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkan
koagulin.
◼ Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan
bergabung dengan sendirinya dan membentuk
suatu gumpalan/bekuan seperti gel
Mengapa LAL test?

◼ Limulus amebocyte lysate (LAL) test

adalah metode alternatif terhadap
rabbit pyrogen test yang difokuskan
pada deteksi senyawa pirogen dalam
produk, untuk menghindari
penggunaan hewan/binatang dalam
percobaan
◼ Metode lebih akurat
Limulus amebocyte lysate
◼ Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda
(Limulus polyphemus)

◼ Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal

dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri
gram negatif pada Limulus polyphemus
menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah.

◼ Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan

bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi
antara endotoksin dan protein yang dapat
menggumpal dalam amubosit.
◼ Solum (1970, 1973) dan Young (1972),
melakukan pemurnian dan karaterisasi
protein yang dapat bergumpal dari reaksi
LAL dan menunjukkan bahwa reaksi
dengan endotoksin merupakan reaksi
enzimatik.
Limulus
polyphemus
(horseshoe crab)
Cara memperoleh lysate
◼ Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang
berukuran besar ditangkap, cek kesehatannya, lalu
darahnya diambil dengan menggunakan jarum
suntik. Darah kepiting ini lalu disentrifuga untuk
memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya.
◼ Amoebocyte lalu di freeze-dried dan diproses untuk
digunakan. Harganya : One quart of LAL is worth
$15,000!
◼ Tiga perusahaan USA :
 Associates of Cape Cod: http://www.acciusa.com
 Cambrex: http://www.cambrex.com/default.asp
 Charles River Endosafe:
http://www.criver.com/products/endotoxin/index.html