1.

Pembagian metode LAL Test

Tiga jenis metode pengujian endotoksin LAL (metode gel-gumpalan, metode
kromogenik, dan metode turbidimetri) telah disetujui oleh Farmakope Amerika Serikat
untuk evaluasi obat injeksi produk akhir, peralatan medis, dan bahan baku.
a. Metode Gel-Gumpalan
Metode gel-gumpalan (reaksi gel-gumpalan) melibatkan penggunaan protein
pembekuan yang dibelah oleh enzim pembekuan yang diaktifkan, di mana titik
produk pembelahan tidak larut bergabung dengan interaksi ionik untuk
membentuk gel. Meskipun seluruh reaksi belum ditentukan, dipahami bahwa reaksi
yang mengarah ke pembentukan bekuan melibatkan kaskade langkah aktivasi
enzim.3
Tes LAL dilakukan dengan menambahkan 100 μL Pyrotell yang dilarutkan
(Associates of Cape Cod, Incorporated, Falmouth, Massachusetts) ke 100 μL dari
spesimen uji dalam tabung reaksi gelas batu kapur depyrogenated 10 x 75 mm
(Produk # T100, Charles River Endosafe, Charleston, Carolina Selatan). Larutan
reaksi dicampur secara menyeluruh dan ditempatkan segera dalam inkubator blok
kering atau penangas air non-sirkulasi pada suhu 37 ±C ± 1˚C selama 60 ± 2 menit.
Pada akhir masa inkubasi, tabung dikeluarkan dari inkubator dan dibalik. Jika gel
telah terbentuk dan tetap utuh di bagian bawah tabung reaksi setelah inversi 180
derajat, tes positif.
Tes positif menunjukkan bahwa konsentrasi endotoksin dalam tabung lebih
besar atau sama dengan sensitivitas Pyrotell. Keadaan lain dari campuran reaksi
merupakan tes negatif, yang menunjukkan konsentrasi endotoksin kurang dari
sensitivitas Pyrotell.
Tes ini dianggap negatif jika gel telah terbentuk tetapi pecah atau runtuh
ketika terbalik.3
Metode gel-gumpalan sering dianggap sebagai prosedur yang paling akurat
dan sensitif untuk menguji kandungan endotoksin dalam produk injeksi farmasi
karena lebih sedikit false-positive dan false- hasil negatif diamati ketika metode itu
digunakan. Meskipun beberapa obat berinteraksi dengan zat yang digunakan dalam
 metode gel-gumpalan, penghambatan atau tes awal harus dilakukan untuk
menentukan apakah artikel uji menghambat, meningkatkan, atau tidak berpengaruh
pada reagen tes. Banyak obat meningkatkan atau menghambat pereaksi tes untuk
menghasilkan hasil positif palsu atau negatif palsu. Meskipun metode gel-gumpalan
sejauh ini merupakan tes yang paling akurat, itu juga yang paling memakan waktu
untuk dilakukan. Tidak ada sistem otomatis yang menggunakan metode gel-
gumpalan yang tersedia.
Faktor-faktor lain yang dapat mempengaruhi hasil metode gelclot termasuk
inhibitor kimia (misalnya, asam etilenadiaminetetraasetat [EDTA]) yang
menyebabkan chelation kation divalen yang diperlukan untuk LALreaction,
denaturasi protein dari agen seperti fluorescein, gangguan pH (yaitu, Nilai pH tidak
dalam kisaran 6,0 hingga 7,5), dan inhibitor fisik yang dapat menyerap endotoksin
atau menghasilkan viskositas.

b. Metode Kromogenik
Metode kromogenik dikembangkan pada tahun 1977 oleh para peneliti
Jepang yang menentukan bahwa LAL yang diaktifkan endotoksin akan membelah
situs pembelahan asam amino yang mengandung peptida kromogenik.
Metode itu didasarkan pada pembelahan peptida koagulogen, yang
disebabkan oleh kaskade langkah aktivasi enzim. Produk pembelahan tidak larut
termasuk koagulogen dan koagulin, yang bergabung dengan interaksi ionik. Ketika
jumlah yang cukup dari koagulin hadir, larutan uji menjadi keruh dan membentuk
gumpalan gel. Di hadapan endotoksin, komponen-komponen LAL diaktifkan dalam
kaskade proteolitik yang menghasilkan pembelahan substrat peptida artifisial tidak
berwarna yang ada dalam Pyrochrome LAL. Pembelahan proteinolitik substrat
membebaskan p-nitroaniline (pNA), yang berwarna kuning dan memiliki
absorbansi 405 nm.
Pengujian dilakukan dengan menambahkan volume Pyrochrome ke volume
spesimen dan menginkubasi campuran reaksi pada suhu 37˚C. Semakin tinggi
konsentrasi endotoksin dalam spesimen, semakin cepat produksi pNA.5 Ketika
metode kromogenik digunakan, dua metode untuk mengukur konsentrasi
 endotoksin dalam sampel tersedia. Metode kinetik bergantung pada jumlah waktu
yang diperlukan untuk sampel untuk mencapai absorbansi tertentu (405 nm).
Waktu onset ditentukan oleh konsentrasi endotoksin dalam sampel. Misalnya,
interval reaksi yang lebih pendek menunjukkan konsentrasi endotoksin yang lebih
tinggi dalam sampel. Dalam metode kromogenik titik akhir, pengukuran pNA
setelah periode inkubasi yang ditetapkan digunakan untuk menentukan konsentrasi
endotoksin. Baik metode kinetik dan metode kromogenik titik akhir membutuhkan
kurva standar untuk menentukan jumlah endotoksin yang ada dalam sampel.
Keuntungan menggunakan metode kromogenik banyak. Ada sistem otomatis
yang tersedia yang mengurangi jumlah waktu yang diperlukan untuk melakukan tes
(dan karenanya menambah jumlah tes yang dapat dilakukan). Ketika banyak tes
untuk endotoksin harus dilakukan, metode kromogenik otomatis adalah solusi
terbaik. Metode itu sangat user-friendly, dan hasilnya dapat dihitung dengan mudah.
Perhatian harus diambil ketika zat yang mendenaturasi protein, ion khelat,
mengikat endotoksin, atau mengubah keadaan hidrofobik endotoksin diuji; zat-zat
itu dapat mengganggu tes.
Beberapa protease serin (misalnya, trypsin, faktor darah teraktivasi)
menyebabkan hasil positif palsu kecuali jika telah didenaturasi oleh panas sebelum
pengujian. Serum hewani, albumin, plasma, dan zat lain dapat mengganggu tes
kromogenik berbasis pNA karena warnanya yang kuning. Kekeruhan berlebih dalam
sampel juga dapat mengganggu pengujian, kecuali kekeruhan dapat dikurangi dari
kekosongan atau sampel dapat diperlakukan untuk menghilangkan kekeruhan.

c. Metode Turbidimetri
Metode turbidimetri agak analog dengan metode kromogenik dan
membutuhkan perhitungan yang sama. Urutan peristiwa yang terjadi dalam metode
turbidimetri, yang sebanding dengan metode bekuan-gel dan kromogenik, tidak
diketahui dengan pengecualian pada langkah terakhir. Langkah itu melibatkan
pembelahan protein pembekuan oleh enzim pembekuan yang diaktifkan. Produk
pembelahan menyatu sebagai hasil dari interaksi ionik yang terjadi setelah
pembelahan dan menyebabkan campuran reaksi menjadi keruh.
 Metode turbidimetri dapat digunakan untuk menentukan kandungan
endotoksin dari sampel dalam dua cara. Keduanya membutuhkan penggunaan
kurva standar tetapi berbeda dalam titik akhir untuk pengukuran. Konsentrasi
endotoksin dapat ditentukan dengan menggunakan pengukuran kerapatan optik
untuk membandingkan sampel dengan standar otentik untuk mengukur tingkat
peningkatan kekeruhan, durasi waktu hingga tingkat kekeruhan yang diinginkan
tercapai, atau tingkat kekeruhan setelah periode inkubasi yang ditentukan. Sistem
otomatis yang membantu throughput tersedia untuk metode ini serta metode
kromogenik. Seperti metode kromogenik, metode turbidimetri dapat diubah dengan
menguji darah, serum, albumin, plasma, dan bahan serupa. Metode turbidimetri
sensitif terhadap bahan tersuspensi atau keruh dan dapat menghasilkan false
positive jika sampel tidak disiapkan dengan benar.
Tripsin adalah contoh lain dari sampel yang, ketika diuji, dapat menyebabkan
hasil positif palsu kecuali sampel didenaturasi dengan benar.

2. Cara menghilangkan pirogen

Cara menghilangkan pirogen adalah sebagai berikut:
1.    PTM: 139
Pirogen dapat dipindahkan dari suatu larutan melalui destilasi dan ini
merupakan  metode paling tua untuk memperoleh air bebas progen, dasar untuk
memperoleh atau memproduksi parenteral volume besar bebas pirogen dalam
skala besar. Ultrafiltrasi sampai 100 KD adalah alat yang efektif dari penyaringan
endotoksin yang mempunyai BM kira-kira 20 KD tetapi pada kenyataannya
ukuran agregat paling kurang 1000 KD. Osmosa balik juga efektif memindahkan
partikel samapai 1 nm, meliputi endotoksin. Disisi lain, norit aktif, serat asbes dan
polipropilen atau politeffiber atau permukaan, seluruhnya efektif menyerap
pirogen, utamanya melalui interaksi hidrofobik. Pirogen atau endotoksin yang
diadsorbsi dalam permukaan lebih sulit untuk di pindahkan. Permukaan
elestomerik seperti pada segel dan penutup tidak dapat dipanaskan. Pirogen
disini disyaratkan untuk dipindahkan melalui pembilasan dengan air pirogenik.
Banyak permukaan logam atau gelas dapat diolah secara kimia, kebanyakan
 bahan pengoksidasi seperti peroxid atau permanganat menjadi efektif. Sterilisasi
panas kering tidak efektif, tekanan pada 20 psig disyaratkan selama paling
kurang 5 jam untuk menghancurkan kebanyakan endotoksin. Metode
depirogenisasi ini di pilih untuk permukaan adalah panas kering pada suhu
sekitar 160-250oC paling kurang 30 menit kondisi yang baik yang telah diset.
Pengolah ini mengasumsikan  bahwa peralatan pada bagian permukaan dapat
dipanaskan, dan tentu saja sangat sedikit produk yang dapat diolah dengan cara
ini. Wadah gelas, setelah pencucian dengan air untuk injeksi, dikeringkan dan
dipanaskan di bawah kondisi aliran laminar pada oven berkesinambungan suhu
250oC atau lebih tinggi. Kondisi ini meliputi kombinasi pengeringan, oksidasi dan
pembakaran untuk menghancurkan bahan pirogen.
2.    SDF: 46-47
Pirogen dipindahkan dari air dengan destilasi, pirogen tidak menguap.
Destilasi bebas pirogen dikumpulkan dalam wadah steril dan bebas pirogen. Air
untuk injeksi, ketika dikumpulkan dalam wadah bebas pirogen dan steril, harus
digunakan kurang dari 24 jam untuk sediaan produk parenteral yang disterilkan
pada periode ini. Jika air untuk injeksi disimpan untuk waktu lebih panjang, air
untuk injeksi dapat disimpan dalam wadah bebas pirogen dan steril pada suhu 5-
80oC suhu dimana mikroorganisme tidak akan tumbuh, kemungkinan
menghilangkan pirogen. Pirogen dapat dihilangkan dari wadah logam dan gelas
melalui panas kering. Ketika metode tidak praktis untuk ukuran wadah atau
bukan metode pilihan untuk alat-alat pada panas kering, pirogen dapat
dihilangkan melalui pembilasan wadah dengan baik dengan air untuk injeksi
bebas pirogen, pirogen larut air, dipindahkan melalui pembilasan yang diulang.
3.  RPS 18th: 1850
Pirogen dapat dihancurkan melalui pemanasan pada temperatur tinggi.
Prosedur yang direkombinasikan untuk depirogenasi gelas dan peralatan adalah
pemanasan pada suhu 250oC selama 45 menit. Telah dilaporkan bahwa 650 oC
selama 1 menit atau selama 4 jam diharapkan dapat menghancurkan pirogen. Hal
itu dipastikan bahwa pencucian yang teliti dengan deterjen akan menjadikan
wadah gelas bebas pirogen jika dilindungi selama proses produksi dan
 penyimpanan dari kontaminasi pirogen berat. Putaran autoklaf biasa tidak bisa
melakukan hal ini. Pemanasan dengan alkali kuat dan atau larutan oksidasi akan
menghancurkan pirogen. Suatu metode yang digunakan untuk memindahkan
pirogen dari larutan adalah adsobsi dalam bahan adsortif. Namun, karena
fenomena adsorbsi juga dapat menyebabkan pemindahan selektif dari bahan
kimia dari larutan dan filtrat dapat dikontaminasi dengan bahan, metode ini
dibatasi penggunaannya.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta: Depkes RI.

Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi.  Jakarta: UI Press.

Aulton, Michael. 1990. Pharmaceutical Practice. London: Oritic Livingston.

Ganong, W.F. 2002. Pengaturan Sentral Fungsi Visera. Dalam : Widjajakusumah M.D., Editor. 
Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 20. Jakarta: EGC.

Gennaro, A. R, et al. 1990. Remingons Pharmaceutical Science 18 th Edition. Pensylvania:

Marck publishing company.

Joiner, T.J., Paul F.K. dan Thomas C.K., 2002, Comparison of Endotoxin Testing Methods for
Pharmaceutical Products, International Journal of Pharmaceutical Compoundin, Vol.
6 (6).

Lachman, et al. 1986. Teori dan Praktek Industri Farmasi Third Edition. Philadelphia:  Lea
and Febiger.

Parrot, L. Eugene. 1971. Pharmaceutical Technology Fundamental Pharmaceutics.

Minnepolis: Burgess Publishing Company.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi kesehatan. Yogyakarta: Kanisius.

Suwandi. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyt Lysate. Cermin Dunia
Kedokteran  no.52.

Turco, Salvatore dan Robert E. 1974. Sterile Dosage Forms. London  : Published in Great
Britain by Henry Kimpton Publishers.

Walter F., PhD. Boron. 2003. Medical Physiology: A Cellular And Molecular Approaoch.
Elsevier/Saunders. p. 1300. ISBN 1-4160-2328-3. Jenkins, G.L. Scoville's:The Art of
Compounding. USA: Burgess Publishing.