Metode gel-clot (reaksi gel-clot) melibatkan penggunaan clotting protein oleh enzim clotting yang

diaktifkan, pada titik mana produk pembelahan tidak larut bergabung dengan interaksi ion untuk
membentuk gel. Meskipun seluruh reaksi belum ditentukan, dapat dipahami bahwa reaksi untuk
pembentukan clot melibatkan kaskade langkah aktivasi enzim. Tes LAL dilakukan dengan menambahkan
100 μL dari Pyrotell rekonstitusi (Associates dari Cape Cod, Incorporated, Falmouth Massachusetts)
hingga 100 μL dari specimen uji dalam 10 x 75 mm tabung reaksi (soda kapur) (Produk # T100, Charles
River Endosafe, Charleston, Carolina Selatan). Larutan reaksi dicampur secara menyeluruh dan
ditempatkan segera dalam inkubator 37˚C ± 1˚C selama 60 ± 2 menit. Pada akhir masa inkubasi, tabung
dikeluarkan dari inkubator dan terbalik. Jika gel telah terbentuk dan tetap utuh di bagian bawah reaksi
tabung setelah inversi 180 derajat, tes positif. SEBUAH uji positif menunjukkan bahwa konsentrasi
endotoksin dalam tabung lebih besar atau sama dengan sensitivitas Pyrotell. Keadaan lain dari
campuran reaksi merupakan tes negatif, yang menunjukkan konsentrasi endotoksin kurang dari Pyrotell
kepekaan. Tes ini dianggap negatif jika gel telah terbentuk tetapi rusak ketika terbalik. 3

Metode gel-clot sering dianggap sebagai metode yang paling akurat dan prosedur sensitif
untuk menguji kandungan endotoksin dalam produk injeksi karena lebih sedikit false-positive dan hasil
false-negatif. Meskipun beberapa obat berinteraksi dengan zat yang digunakan dalam metode gel-clot,
penghambatan atau tes awal harus dilakukan untuk menentukan apakah uji tersebut menghambat,
meningkatkan, atau tidak berpengaruh pada reagen tes. Banyak obat meningkatkan atau menghambat
reagen tes tersebut untuk menghasilkan false-positive atau hasil negatif palsu. Meskipun metode gel-
clot sejauh ini tes yang paling akurat, juga memakan waktu yang banyak. Tidak ada sistem otomatis yang
menggunakan metode gel-clot. Faktor lain yang dapat mempengaruhi hasil metode gel clot termasuk
inhibitor kimia (misalnya, etilenadiaminetetraasetat) acid [EDTA]) yang menyebabkan khelasi divalent
kation yang diperlukan untuk reaksi LAL, denaturasi protein dari agen seperti fluorescein, gangguan pH
(yaitu, nilai pH tidak dalam kisaran 6,0 hingga 7,5), dan inhibitor fisik yang dapat menyerap endotoksin
atau menghasilkan viskositas
Metode kromogenik dikembangkan pada tahun 1977 oleh Jepang yang menentukan bahwa LAL yang
diaktifkan endotoksin akan membelah situs pembelahan asam amino yang mengandung peptida
kromogenik. Metode ini didasarkan pada pembelahan peptida koagulogen, yang disebabkan oleh
serangkaian langkah aktivasi enzim. Produk pembelahan tidak larut termasuk koagulogen dan koagulin,
yang menyatu oleh interaksi ionik. Ketika cukup jumlah koagulin hadir, larutan uji menjadi keruh dan
membentuk gumpalan gel

Di hadapan endotoksin, komponen LAL adalah diaktifkan dalam kaskade proteolitik yang
menghasilkan pembelahan substrat peptida tiruan tidak berwarna hadir dalam Pyrochrome LAL.
Pembelahan proteinolitik substrat membebaskan p-nitroaniline (pNA), yang berwarna kuning dan
memiliki daya serap 405 nm. Tes dilakukan dengan menambahkan volume Pyrochrome ke volume
spesimen dan menginkubasi campuran reaksi pada 37˚C. Semakin tinggi konsentrasi endotoksin dalam
spesimen, semakin cepat produksi pNA.5 Ketika metode kromogenik digunakan, dua metode untuk
mengukur konsentrasi endotoksin dalam sampel tersedia. Metode kinetik bergantung pada jumlahnya
waktu yang dibutuhkan untuk sampel untuk mencapai absorbansi tertentu (405 nm). Waktu onset
ditentukan oleh konsentrasi endotoksin dalam sampel. Misalnya, interval reaksi yang lebih pendek
menunjukkan konsentrasi endotoksin yang lebih tinggi dalam sampel. Dalam metode kromogenik titik
akhir, pengukuran pNA setelah periode inkubasi yang ditetapkan digunakan untuk menentukan
konsentrasi endotoksin. Baik metode kinetik dan titik akhir Metode kromogenik membutuhkan kurva
standar untuk ditentukan jumlah endotoksin hadir dalam sampel.

Keuntungan menggunakan metode kromogenik banyak. Ada sistem otomatis yang tersedia yang
mengurangi jumlah waktu yang diperlukan untuk melakukan tes (dan karenanya menambah jumlah tes
yang dapat dilakukan). Ketika banyak tes untuk endotoksin harus dilakukan, metode kromogenik
otomatis adalah solusi terbaik. Metode itu sangat user-friendly, dan hasilnya bisa dihitung dengan
mudah. Perhatian harus diambil saat zat yang mendenaturasi protein, ion chelate, mengikat endotoksin,
atau mengubah keadaan hidrofobik dari endotoksin yang diuji; zat-zat itu dapat mengganggu tes.
Beberapa serin protease (mis. trypsin, faktor darah teraktivasi) menyebabkan kepalsuan hasil kecuali
mereka telah didenaturasi oleh panas sebelumnya pengujian. Serum hewan, albumin, plasma, dan zat-
zat lainnya dapat mengganggu tes kromogenik berbasis pNA karena warna kuning mereka. Kekeruhan
berlebih dalam sampel juga dapat mengganggu dengan tes, kecuali kekeruhan dapat dikurangi kosong
atau sampel dapat diolah untuk menghilangkan kekeruhan
Metode turbidimetri hamper mirip dengan metode kromogenik membutuhkan perhitungan yang
serupa. urutan prosedur yang terjadi dalam metode turbidimetri sebanding dengan gel-clot dan
kromogenik metode, pengecualian dari langkah terakhir. Bahwa langkah melibatkan pembelahan
protein pembekuan dengan diaktifkan enzim pembekuan. Produk belahan dada menyatu sebagai akibat
dari interaksi ionik yang terjadi setelah belahan dada dan menyebabkan campuran reaksi menjadi keruh.

Metode turbidimetri dapat digunakan untuk menentukan endotoksin isi sampel dalam dua cara.
Keduanya membutuhkan penggunaan dari kurva standar tetapi berbeda dalam titik akhir untuk
pengukuran. Konsentrasi endotoksin dapat ditentukan dengan menggunakan optic pengukuran
kepadatan untuk membandingkan sampel dengan otentik standar untuk mengukur tingkat peningkatan
kekeruhan, durasi waktu hingga tingkat kekeruhan yang diinginkan tercapai atau tingkat kekeruhan
setelah periode inkubasi yang ditentukan. Sistem otomatis yang membantu throughput tersedia untuk
metode ini serta metode kromogenik. Seperti kromogenik metode, metode turbidimetri dapat diubah
dengan menguji darah, serum, albumin, plasma, dan bahan serupa. Metode turbidimetri sensitif
terhadap suspensi atau keruh bahan dan dapat menghasilkan false positive jika sampel tidak disiapkan
dengan benar. Trypsin adalah contoh lain dari sampel yang, ketika diuji, dapat menyebabkan hasil positif
palsu kecuali sampel didenaturasikan dengan benar
Kesimpulan

Ketiga metode pengujian endotoksin dijelaskan dalam artikel ini telah disetujui oleh USP untuk
digunakan dengan obat suntik dan produk lainnya. Meskipun masing-masing metode memiliki kelebihan
dan Kerugiannya, semua dapat digunakan untuk menentukan secara akurat dan efektif kehadiran
endotoksin dalam berbagai produk. Banyak ilmuwan percaya bahwa metode gel-gumpalan adalah yang
paling akurat metode penentuan konten endotoksin. Saat gel-gumpalan Metode yang digunakan, lebih
sedikit interaksi yang dapat menghambat reaksi terjadi, tetapi proses persiapan yang lama dapat
menunda hasil. Itu metode turbidimetri dapat dilakukan dengan otomatis sistem. Ini juga mudah
dilakukan, tetapi banyak orang merasakannya hasil false-positif sering terjadi ketika metode itu
digunakan. Metode kromogenik sangat user-friendly dan dapat dilakukan dengan sistem otomatis,
tetapi banyak senyawa bisa berinteraksi ketika metode itu digunakan. Akibatnya, kromogenik Metode
tidak dapat digunakan dalam banyak kasus. Selain kekurangannya dari masing-masing tiga metode yang
direkomendasikan oleh USP, kesalahan yang dibuat oleh teknisi dan kesalahan interpretasi hasil juga
merupakan masalah umum. Apapun metode yang digunakan digunakan, laboratorium dan apotek harus
memastikan bahwa mereka teknisi terlatih dengan baik dan terdidik dalam pengujian endotoksin
metode pilihan.
LAL-test „ The Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis
kuantitatif endotoksin bakteri. „ Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik gel-clot dan
turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri)

Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan adanya endotoksin „ Metode kinetik
turbidimetri : menggunakan kecepatan pembentukan gel untuk menentukan kandungan endotoksin „
Metode Kromogenik : menggunakan substrat kromogenik sintetik, dengan adanya LAL dan endotoksin,
menghasilkan warna kuning dan secara linier ekuivalen dengan konsentrasi endotoksin yang ada

Metode Gel-Clot „ Pada metode ini, hasil akhir dapat dideteksi berupa spot pada slide, atau microplate „
Perlu pembanding, berupa Control Standard Endotoxin (CSE) „ Peralatan gelas yang digunakan harus di
“de-pirogenasi” Prinsip uji dan prosedur „ 100 ul CSE dimasukkan ke dalam tabung gelas depirogen
(positive control) „ LAL reagent water (negative control) „ Sampel jumlah sama „ + 100 ul lysate „
Inkubasi 37°C di atas penangas air selama 1 jam „ Tabung lalu dibalik perlahan (180° ) untuk melihat
solid clot yang terjadi Hal yang harus diperhatikan dalam metode gel-clot „ Untuk membuat alat-alat
depirogen : pemanasan pada 180°C, selama 4 jam atau 250°C selama 30 menit „ Teknik pengerjaan pada
saat membalik tabung kira-kira selama 2 detik „ pH sampel 7,0 – 8,0. Jika diperlukan pH diatur
menggunakan asam atau basa depirogen

Sensitivitas Lisat pada Gel-Clot „ Diperlukan untuk menentukan konsentrasi minimum endotoksin yang
menyebabkan terjadinya gel „ Satuan dinyatakan dalam EU atau IU „ Dibuat 1 seri pengenceran
endotoksin (dalam EU/mL) dan percobaan dilakukan rangkap 4 (quadruplicate) „ Titik akhir pengenceran
(end-point dilution) ditentukan pada pengenceran terakhir yang masih memberikan reaksi positif

Metode kromogenik „ Metode kromogenik merupakan metode LAL test yang paling banyak digunakan
saat ini karena lebih mudah dan murah „ Sesuai untuk jumlah produk yang diuji tidak banyak dan tidak
sering (infrequent) „ Digunakan untuk uji sampel serum pada uji klinis Prinsip uji dan prosedur „
Endotoksin akan mengkatalisis aktivasi suatu proenzim „ Enzim yang teraktivasi akan mengkatalisis
terpecahnya PNA dari substrat Ac-Ile-GluAla-Arg-PNA „ PNA yang dilepaskan diukur secara
spektrofotometri pada 405 nm „ Nilai absorbans sebanding dengan jumlah endotoksin , dibandingkan
terhadap endotoksin standard menggunakan kurva standard New Discoveries „ Alternatif thp LAL saat
ini telah berhasil diteliti di India dan China, yaitu pereaksiTAL, or Tachypleus amoebocyte lysate,
fungsinya mirip dengan LAL, juga untuk deteksi gram-negative bacteria. „ Scientists di Singapore tengah
meneliti cloning gene pendeteksi toxin dalam darah horseshoe crab. Jika gen tsb dapat di klon derivat
LAL dapat dibuat tanpa harus menggunakan horseshoe crabs untuk ekstraksi darahnya.