LAL TEST

Uji LAL adalah metode spesifik untuk bakteri endotoksin, hanya untuk pirogen yang
signifikan pada kebanyakan pabrik farmasetikal dan peralatan medis. Test didasarkan pada
mekanisme primitif penggumpalan darah dari kepiting seperti Kuda Amerika (Limulus
polyphemus)(Aulton, 1990).

Ada empat metode LAL saat ini dilisensi oleh FDA. Metode analisis LAL yang
dilakukan mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri). Yang
pertama, disebut sebagai metode gel-clot didasarkan pada kenyataan bahwa LAL gumpalan di
hadapan endotoksin. Metode turbidimetrik kinetik adalah metode kuantitatif yang digunakan
LAL kekeruhan penampilan untuk menentukan konten endotoksin. Metodologi yang ketiga dan
keempat, disebut sebagai chromogenic assaysemploy, sebuah chromogenic substrat sintetis yang,
di hadapan LAL dan endotoksin, menghasilkan warna kuning yang berhubungan linier terhadap
konsentrasi endotoksin.

1. The gel-clot end point test" (Uji penggumpalan gelatin)

 Prosedur
 Reagensia LAL dicampur dengan sampel larutan uji dalam tabling galas masing-masing
dengan volume sama yaitu 1,0 ml.
 Setelah dicampur, tabung gelas tersebut diinkubasi pada temperatur 37°C ± 2°C selama
60 menit ± 1 menit.
 Pembacaan pengujian larutan yaitu tabung galas dari inkubator diambil dengan hati-hati,
kemudian membaliknya 180°, sehingga permukaan atas tabung berada di bagian bawah.
 Hasil pembacaan adalah :

Positif (+) jika terbentuk gelatin padat yang tetap, berarti contoh larutan tersebut
mengandung sedikitnya sama dengan sensitivitas reagensia yang digunakan.

Negatif (-) jika tidak terbentuk·gelatin padat yang tetap, berarti bahwa contoh larutan uji
tersebut tidak mengandung endotoksin atau lebih sedikit daripada sensitivitas reagensia
yang digunakan (Usman, 1988)

Dalam menginterpretasikan hasil pembacaan untuk memperkirakan kandungan

endotoksin dalam contoh, tergantung pada sensitivitas reagensia. Oleh karena itu dalam
melakukan pengujian perlu memilih reagensia yang sesuai dengan kebutuhan, karena begitu
banyak macam reagensia dengan sensitivitas bermacam-macam. Hampir setiap reagensia me-
merlukan penanganan dan penyimpanan yang berlainan. Demikian juga tentang persiapan dan
pelaksanaan pengujian LAL. Sebagai contoh perbandingan tentang variasi pengelolaan dari
berbagai reagensia dalam pengujian LAL. Pemakaian reagensia dan contoh larutan uji dengan
volume 0,1 ml, selanjutnya dikenal sebagai metode makro. D. Kruger (1982) dalam artikelnya
menyebutkan bahwa saat ini telah dikembangkan suatu micro method dan lamellae micro
method. Jika dibandingkan dengan makro, kedua metoda tersebut menggunakan volume
reagensia yang lebih sedikit, yaitu 10 ul. Dengan demikian kedua metode ini lebih menghemat
pemakaian reagensia. Pembacaan hasil pada kedua metode tersebut, pembentukan gelatin tidak
diamati dalam tabung gelas seperti pada metode makro, tetapi diamati dengan microscope slide.
D. Kruger (1982) juga telah melakukan suatu perbandingan menggunakan metode makro dan
mikro, ternyata memperlihatkan hasil yang tidak berbeda (Usman, 1988).

2. The turbidometric test" (uji kekeruhan)

Dalam metode ini, cara inkubasi adalah sama seperti metode yang telah disebutkan di atas.
Kalau dalam metode I tersebut evaluasi hasil diamati dari terbentuknya gelatin, sebalknya dalam
metode ini dicegah jangan sampai terbentuk gelatin. Cara menghindari terbentuknya gel yaitu
dengan mengencerkan reagen LAL atau dengan menambah volume larutan uji sebelum
pengujian mulai dilakukan. Dalam metode ini yang diharapkan adalah terbentuknya kekeruhan,
yaitu sebagai akibat presipitasi "protein coagulogen". Dasar dari metode ini yaitu peningkatan
jumlah endotoksin akan menyebabkan bertambahnya kekeruhan dan bertambahnya kekeruhan
ini sebanding dengan bertambahnya endotoksin (Usman, 1988).

Nilai optical density dibaca dengan menggunakan spektro- fotometer. Hasil yang didapat
akan memberikan konsentrasi endotoksin secara kuantitatif, yaitu dengan mengekstrapolasikan
dalam kurva standar, dan kurva standar diperoleh dengan membuat scri konsentrasi endotoksin
(Usman, 1988).

3. The colorimetric test" (uji warna)

Metode ini didasarkan atas terbentuknya warna, sedangkan caranya hampir sama dengan
metode kedua. Namun dalam metode ini presipitasi protein dengan menggunakan centri fuge.
Konsentrasi endotoksin dalam suatu contoh juga diperoleh dengan mengekstrapolasikan dalam
kurva standar dan pembacaan juga menggunakan spektrofotometer (Usman, 1988).
 4.The chromogenic subsrate test"

Metode ini berbeda dengan metode-metode yang terdahulu. Metode yang disebutkan
sebelumnya tergantung sepenuhnya pada reagensia LAL, terutama kandungan "protein
coagulogen" di dalamnya yang berfungsi membentuk gelatin protein. Sedangkan metode ini,
fungsi untuk membentuk gel protein yaitu dari suatu substrat kromogenik sintetis untuk
menggantikan "protein coagulogen". Substrat kromogenik sintetis ini mengandung rangkaian
asam amino yang sama seperti koagulogen reagensia. Pembacaan hasil juga seperti pada 2
metode sebelumnya, yaitu dengan menggunakan spektrofotometer (Usman, 1988).

Metode Kerja Lal Test yaitu Reagen test LAL disediakan dengan lyopilisasi sel di
mubasit limulus. Volume setara reagen LAL dan larutan test (0,1 mikron per masing-masing)
dicampurkan dalam gelas tube test elipirogenasi. Tube diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 1
jam, setelah test wadah dibaca. Tube diambil dari inkubator dan diubah. Bekuan oleh yang rusak
mengandung energi padatan merupakan factor dari test positif. Ketika digunakan pada bagian ini
bekuan gel uji awalnya, melewati test kegagalan dibatasi dan reagen sensitive LAL (Aulton,
1990).

Uji LAL positif, menunjukkan adanya endotoksin, jika gumpalan gel menjaga
integritasnya setelah inversi lambat dari tabung reaksi berisi campuran.

DEPIROGENITAS

Cara menghilangkan pirogen adalah sebagai berikut:

 Cara Pertama
Pirogen dapat dipindahkan dari suatu larutan melalui destilasi dan ini merupakan  metode
paling tua untuk memperoleh air bebas progen, dasar untuk memperoleh atau memproduksi
parenteral volume besar bebas pirogen dalam skala besar. Ultrafiltrasi sampai 100 KD adalah
alat yang efektif dari penyaringan endotoksin yang mempunyai BM kira-kira 20 KD tetapi pada
kenyataannya ukuran agregat paling kurang 1000 KD. Osmosa balik juga efektif memindahkan
partikel samapai 1 nm, meliputi endotoksin. Disisi lain, norit aktif, serat asbes dan polipropilen
atau politeffiber atau permukaan, seluruhnya efektif menyerap pirogen, utamanya melalui
interaksi hidrofobik. Pirogen atau endotoksin yang diadsorbsi dalam permukaan lebih sulit untuk
di pindahkan. Permukaan elestomerik seperti pada segel dan penutup tidak dapat dipanaskan.
Pirogen disini disyaratkan untuk dipindahkan melalui pembilasan dengan air pirogenik. Banyak
permukaan logam atau gelas dapat diolah secara kimia, kebanyakan bahan pengoksidasi seperti
peroxid atau permanganat menjadi efektif. Sterilisasi panas kering tidak efektif, tekanan pada 20
psig disyaratkan selama paling kurang 5 jam untuk menghancurkan kebanyakan endotoksin.
Metode depirogenisasi ini di pilih untuk permukaan adalah panas kering pada suhu sekitar 160-
250oC paling kurang 30 menit kondisi yang baik yang telah diset. Pengolah ini mengasumsikan 
bahwa peralatan pada bagian permukaan dapat dipanaskan, dan tentu saja sangat sedikit produk
yang dapat diolah dengan cara ini. Wadah gelas, setelah pencucian dengan air untuk injeksi,
dikeringkan dan dipanaskan di bawah kondisi aliran laminar pada oven berkesinambungan suhu
250oC atau lebih tinggi. Kondisi ini meliputi kombinasi pengeringan, oksidasi dan pembakaran
untuk menghancurkan bahan pyrogen(Parrot, L. Eugene. 1971)

 Cara Kedua
Pirogen dipindahkan dari air dengan destilasi, pirogen tidak menguap. Destilasi bebas
pirogen dikumpulkan dalam wadah steril dan bebas pirogen. Air untuk injeksi, ketika
dikumpulkan dalam wadah bebas pirogen dan steril, harus digunakan kurang dari 24 jam untuk
sediaan produk parenteral yang disterilkan pada periode ini. Jika air untuk injeksi disimpan untuk
waktu lebih panjang, air untuk injeksi dapat disimpan dalam wadah bebas pirogen dan steril pada
suhu 5-80oC suhu dimana mikroorganisme tidak akan tumbuh, kemungkinan menghilangkan
pirogen. Pirogen dapat dihilangkan dari wadah logam dan gelas melalui panas kering. Ketika
metode tidak praktis untuk ukuran wadah atau bukan metode pilihan untuk alat-alat pada panas
kering, pirogen dapat dihilangkan melalui pembilasan wadah dengan baik dengan air untuk
injeksi bebas pirogen, pirogen larut air, dipindahkan melalui pembilasan yang diulang.( Turco,
Salvatore dan Robert E. 1974)

 Cara Ketiga
Pirogen dapat dihancurkan melalui pemanasan pada temperatur tinggi. Prosedur yang
direkombinasikan untuk depirogenasi gelas dan peralatan adalah pemanasan pada suhu 250oC
selama 45 menit. Telah dilaporkan bahwa 650oC selama 1 menit atau selama 4 jam diharapkan
dapat menghancurkan pirogen. Hal itu dipastikan bahwa pencucian yang teliti dengan deterjen
akan menjadikan wadah gelas bebas pirogen jika dilindungi selama proses produksi dan
penyimpanan dari kontaminasi pirogen berat. Putaran autoklaf biasa tidak bisa melakukan hal
ini. Pemanasan dengan alkali kuat dan atau larutan oksidasi akan menghancurkan pirogen. Suatu
metode yang digunakan untuk memindahkan pirogen dari larutan adalah adsobsi dalam bahan
adsortif. Namun, karena fenomena adsorbsi juga dapat menyebabkan pemindahan selektif dari
bahan kimia dari larutan dan filtrat dapat dikontaminasi dengan bahan, metode ini dibatasi
penggunaannya.( Gennaro, A. R, et al. 1990)
 Dapus

Aulton, Michael. 1990. Pharmaceutical Practice. London: Oritic Livingston.

Gennaro, A. R, et al. 1990. Remingons Pharmaceutical Science 18th Edition. Pensylvania: Marck

publishing company.
Parrot, L. Eugene. 1971. Pharmaceutical Technology Fundamental Pharmaceutics. Minnepolis:
Burgess Publishing Company.

Turco, Salvatore dan Robert E. 1974. Sterile Dosage Forms. London  : Published in Great
Britain by Henry Kimpton Publishers.

Usman Suwandi, 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyt Lysate”, Cermin
Dunia Kedokteran No. 52.