Pirogen dan Uji Pirogen

(Endotoksin)
 Pirogen
Pirogen adl senyawa pemicu demam
Pirogen endogen berasal dari dlm tubuh host
sendiri dan terkait dg mekanisme pengaturan
suhu tubuh
Pirogen eksogen bisa menstimulasi reaksi
pirogenik dari materi endogen
Pirogen terutama berupa lipopolisakarida
(endotoksin) yg berasal dr bakteri
Pirogen eksogen tersebar luas di alam dan
berasal dari berbagai macam sumber mikrobial
dan non-mikrobial
Endotoksin bakteri dilepas secara terus-
menerus ke lingkungan di sekitar sel
Deteksi endotoksin sdh berkembang pesat dan
pengukuran materi ini telah diakui sbg index yg
sensitif akan adanya kontaminasi bakteri dalam
suatu produk
NAMUN, perlu diperhatikan bahwa materi
pirogenik eksogen belum tentu endotoksin dan
tidak semua endotoksin berasal dari bakteri
Gram-negatif
Karena endotoksin bakteri adalah fragmen
dinding sel bakteri yg water-soluble, maka
endotoksin dpt lolos melewati filter membran
yg bisa menangkap organisme induknya.
Struktur Endotoksin

Endotoksin tersusun atas satu fragmen lipid, Lipid A, yg terikat pd gugus gula yg scr
efektif men-soulibilisasi bagian lipid tsb. Selain itu, terdpt rantai antigenik O-spesifik
yg berisi oligosakarida yg bersifat unik dan memungkinkan utk mengidentifikasi lebih
dari 1000 serotipe Salmonella dan 100 Escherichia.
Struktur Endotoksin

Bagian utama utk aktivitas biologis dr

lipopolisakarida adalah Lipid A yg scr kimia
sama pd kebanyakan endotoksin, dari mana
pun asalnya
Lipid tsb sendiri terdiri atas disakarida dari
glukosamin yg tersubstitusi oleh banyak residu
asam lemak melalui ikatan amida atau ester
Struktur Endotoksin

Asam lemak yg paling umum terikat mell ikatan

amida adalah asam 3-hidroksisina-mat (C14)
tapi ikatan ester bervariasi dari asam C12
sampai C18 dg rantai lurus jenuh karbon
bercacah genap
Hidrolisis ikatan ester dgn asam lemah atau
alkali akan mengurangi aktivitasnya, dan hal ini
menjadi dasar bagi bbrp metode inaktivasi atau
depirogenasi.
Sejarah Pirogen

Orang Yunani kuno mengetahui bhw byk

penyakit disertai oleh demam dan pd bbrp
kasus, induksi demam bisa menyembuhkan
penyakit
Parmenides (500 BC) mengklaim bhw, jika ia
mpy cara utk membuat demam maka ia bisa
menyembuhkan segala macam penyakit
Sejarah Pirogen

Kini, demam diketahui sbg reaksi alamiah

tubuh terhadap penyakit
Induksi demam buatan digunakan utk
penyembuhan syphillis sebelum adanya
kemoterapi
Von Tauregg menerima Hadiah Nobel pd 1927
di bidang kedokteran utk studinya ttg induksi
demam pd pengobatan paralisis
Sejarah Pirogen

Awal abad 17, ditemukan bahwa injeksi materi busuk

menyebabkan reaksi demam pada binatang.
Di Denmark, Panum (1860) menunjukkan bahwa
suatu senyawa dihasilkan dari bakteri yg tidak mesti
hidup. Senyawa tsb tahan panas, larut dlm air, tdk
larut dlm alkohol dan dapat menyebabkan demam
dlm jumlah yg sgt kecil.
Pada sekitar masa itu, Billbroth mengenalkan istilah
“pirogen” dan banyak peneliti yg mencoba
memproduksi bentuk murni dr senyawa penghasil
demam tsb
Sejarah Pirogen

Keberhasilan diraih oleh Jona Centanni pada 1920

ketika dia mendapatkan serbuk putih dari kultur lama
organisme gram negatif
Boifan (1932) mengekstraksi materi serupa dari
dinding sel menggunakan asam trikloroasetat
Westphal (1952) memproduksi lipopolisakarida murni
bebas protein yg, dlm bentuk standar, menimbulkan
reaksi demam pd dosis 1 nanogram per kilogram
berat badan
Makna klinis pirogen

Lepas dr penggunaannya utk menginduksi demam

terkontrol, materi pirogenik berhubungan dg reaksi tak
diinginkan dr kontaminan dlm lar obat injeksi
Produk parenteral tdk byk digunakan sbl keluarnya
“Salvarsan” pd 1912
Produk injeksi bahkan tdk disterilisasi sampai pd
1920-an
NAMUN, pasien yg menerima injeksi steril pun
kadang2 mengalami reaksi pirogeni, berupa:
menggigil, muntah, suhu badan tinggi dan malaise
Makna klinis pirogen

Hort dan Penfold (1912) menghubungkan efek

samping yg tak diinginkan itu dg keberadaan bakteri
gram negatif
Dgn bertambahnya pengalaman dan pemahaman thd
teknologi produksi sediaan parenteral, masalah
pirogen tetap saja ada sampai disadari bhw pirogen
bisa mjd indikator yg sensitif akan adanya bakteri
hidup atau mati.
Adanya metode yg sensitif utk mendeteksi pirogen, uji
LAL (limulus amoebocyte lysate), membuat reaksi
pirogeni secara klinis menghilang
Uji Aktivitas Pirogenik

Siebert (1920-an) menemukan bhw

kebanyakan binatang bereaksi berbeda2
terhadap endotoksin murni
Mencit (mice) dan tikus (rat) mengalami
hipotermia
Anjing dan kelinci putih New Zealand mrp
binatang percobaan ideal utk uji pirogen
Meskipun, mnrt Tai (1942) anjing kurang
sensitif dan kelinci sering memberikan hasil
positif palsu
USP XII edisi 1942 memuat uji pirogen
menggunakan kelinci
Meskipun uji tsb kurang sempurna, tapi krn
manusia tyt lebih sensitif thd endotoksin
ketimbang kelinci, maka korelasi kasar tetap
bisa ditarik
Rabbit Test

Dilakukan dg menyuntikkan produk ke vena

telinga kelinci putih New Zealand atau Belgia
dan memonitor temperatur rektal.
Binatang percobaan perlu kondisi kandang
khusus krn lingkungan kandang (adanya
makhluk asing, kelinci lawan jenis, noise) dpt
mempengaruhi hasil.
Rabbit Test

Telinga tiga kelinci diinjeksi dg 10 ml larutan uji pd 37

± 2oC
Temperatur diukur pada 1,2 dan 3 jam stl injeksi
Syarat USP:
Tdk ada satu kelinci pun yg kenaikan suhunya 0,6 oC
atau lebih atau jumlah kenaikan suhu tiga kelinci tdk
melebihi 1,4oC.
Jika kenaikan temperatur individual 0,6 atau lebih,
atau jika jumlah kenaikan suhu tiga kelinci melebihi
1.4oC, dilakukan uji pd 5 ekor kelinci lagi
Jika tidak lebih dari 3 ekor dari 8 ekor kelinci yg
kenaikan suhu individualnya 0.6oC atau lebih,
dan jumlah kenaikan suhu 8 kelinci tdk
melebihi 3,7oC, maka produk yg diuji
memenuhi syarat USP
Limulus Amebocyte Lysate (LAL test)

Pd 1885, Howell mengamati bahwa darah

biru yg berasal dr sejenis ketam tapal kuda
(horseshoe crab), Limulus polyphemus,
memadat ketika diambil.
Pd 1960 tjd epidemi yg disebabkan oleh
organisme Gram negatif membunuh
sejumlah besar Limulus di Eastern Seabord
AS
Shirodker (1960) menemukan bhw toksin
tahan-panas dari Vibrio spp menyebabkan
penjendalan intravaskuler
Levin dkk menemukan bhw endotoksin sekecil
0,5 ng/ml bisa dideteksi dan terus diperbaiki
sampai ukuran pikogram/ml
Protein ber-BM rendah (± 27 kD) diketahui
menjendal oleh endotoksin dan uji yg ada saat
ini semuanya berdasar pd deteksi
pembentukan gel dlm larutan, baik dg
membalik tabung uji atau mengukur
opasitasnya
Secara komersial, LAL dibuat dg
mengambil darah ketam dewasa,
memasukkannya ke dlm larutan
anticlotting, mencucinya dan
mensetrifuge-nya,
mengumpulkan amebocyte-nya
dan me-lisis-nya dlm NaCl 3%
Lisat-nya dicuci dan di-liofilisasi
(freeze-dried) utk penyimpanan
dan transport
 Types of LAL Test
Gel Clot

Turbidimetric

Colorimetric
 Gel Clot Method
Original method

The official “referee test”

The specimen is incubated

with LAL of a known
senstivity. Formation of a gel
clot is positive for endotoxin.

Freeze-dried LAL dilarutkan dlm air bebas-
endotoksin

Sejumlah volume ttt, biasanya 0,1 ml,
ditambahakan ke dlm larutan sampel dlm tabung
gelas uji yg bebas-endotoksin

Campuran tsb kmd diinkubasi 37oC slm 1 jam

Pd akhir inkubasi, campuran tsb diamati
pembentukan gel-nya dg scr pelan2 membalikkan
tabungnya
Jika jml endotoksin dlm sampel cukup, akan
terbentuk gel yg kental dan tdk terpengaruh
oleh pembalikan tabung
Dg sensitivitas LAL, kuantitas endotoksin dlm
sampel bisa ditetapkan
Jika kandungan endotoksin dlm sampel
melebihi persyaratan FDA  produk ditolak
Karena LAL mendeteksi endotoksin yg
merupakan komponen bakteri Gram-negatif,
maka uji LAL juga bisa digunakan utk
mendeteksi adanya bakteri2 tsb
Kelemahan uji LAL

Tidak bisa membedakan bakteri hidup dan bakteri
mati

Tidak bisa membedakan spesies bakteri asal
endotoksin
 Turbidimetric Method
A kinetic method

The specimen is
incubated with LAL and
either the rate of increase
in turbidity or the time
taken to reach a
particular turbidity is
measured
spectrophotometrically
and compared to a
standard curve.
 Colorimetric Method

Endotoxin catalyzes the

activation of a proenzyme in
LAL which will cleave a
colorless substrate to
produce a colored
endproduct which can be
measured
spectrophotmetrically and
compared to a standard
curve.
Can be kinetic or endpoint
 Colorimetric Reaction

Endotoxin
1. Proenzyme → Enzyme

Enzyme

2. Substrate → Peptide + p-NA

 Comparison of Methods
Gel Clot Chromogenic Chromogenic Turbidimetric
Endpoint Kinetic
Semi- Quantitative Quantitative Quantitative
quantitative
Simple Least Requires Requires Requires
expensive, spectrophotomete incubating plate incubating plate
Requires 37 r or tube reader or tube reader
degree bath or plate reader
Manually read Can be Can be Can be
and recorded automated, automated, automated,
allows electronic allows electronic allows electronic
data storage data storage data storage

Sensitive down Sensitive down Sensitive down Sensitive down

to 0.03 EU/ml to 0.1 EU/ml to .005 EU/ml to .001 EU/ml *

* (Sensitivities vary by reagent manufacturer, instrumentation and testing

conditions)
 Steps in Chromogenic Endpoint
Procedure
Read SOP (reagents are At T = 10 mins add prewarmed
prepared) chromogenic substrate in same
manner as above
Label tubes and make dilutions
of stock standard At T = 16 mins. Add stop
reagent in same manner as
above
Pipette blanks, standards &
unknowns into prewarmed plate
following template Read plate

Start timer as LAL is added to

first well.
Add quickly with repeat pipettor
to all wells being used & mix.
 Notes
Glassware, tips,and water must be
endotoxin- free.

Temperatures and timing are critical.

37