LAPORAN PRAKTIKUM TF

ANGGOTA KELOMPOK
NAMA NPM
VITHYA 260110142018
SANJIV MENON 260110142010
HEINNA 260110142015
JANISS 262110142013
CYNTHIA 260110142003
SHARMILA 260110142001

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2016
TUJUAN
Untuk memastikan praktikan mengetahui cara uji pirogen ke setiap sediaan farmaseutikal dan
untuk mengetahui prosedur uji pirogen.

PRINSIP
1. Uji Pirogen
uji yang dilakukan untuk mengetahui apakan suatu sediaan uji bebas pirogenatau tidak
dengan maksud untuk membatasi resiko reaksi demam yang dapat diterima oleh pasien
apabila diinjeksi dengan suatu sediaan farmasi. Uji pirogenitas biasanya menggunakan
kelinci. Pengujian ini ditetapkan di USP pertama kali pada tahun 1942 dan merupakan
pengujian resmi untuk menentukan non-pirogenitas sediaan farmasi. Sejak diketahui
bahwa endotoksin ternyata mampu menggumpalkan sel darah Limulus, kemudian
dikembangkan suatu pengujian untuk mendeteksi adanya endotoksin dengan menggunakan
reagensia yang dibuat dari sel darah Limulus. (Ansel, 1989)

2. Uji LAL (Limulus Amebocyte Lysate)

Metode yang spesifik untuk bakteri endotoksin, hanya untuk pirogen yang signifikan pada
kebanyakan pabrik farmasutikal dan peralatan medis. Test didasarkan pada mekanisme
primitive pengumpalan darah dari kepiting seperti Kuda Amerika (Limulus polyphemus).
Beberapa enzim diletakkan pada sel darah amoeba kepiting yang dipicuh oleh endotoksin
perpanjangan koagulasi enzimatik yang diakhiri dengan produksi di gel protenose. (Aulton,
1990)

PENDAHULUAN

Pengertian infus adalah suatu sediaan steril berupa larutan atau emulsi bebas pirogen sedapat
mungkin dibuat isotonis terhadap darah yang disuntikkan langsung kedalam vena dalam volume
relatif banyak yang dikemas dalam wadah kapasitas 100-1000 ml yang digunakan untuk
memperbaiki gangguan elektrolit cairan tubuh yang serius yang menyediakan nutrisi dasar dan
digunakan sebagai pembawa untuk bahan-bahan obat (Sudjadi. 2008)
Syarat-syarat parenteral volume besar

1. Steril

2. Bebas Pirogen

3. Bebas dari bahan pertikulat jernih, karena dapat menyebabkan emboli.

4. Dikemas dalam wadah dosis tunggal

5. Tidak mengadung bahan baktersid karena volume cairan terlalu besar.

6. Isotonis dan isohidris

Definisi Pirogen

Pirogen (bakteri endotoksin) adalah produk metabolit dari pertumbuhan mikroorganisme yang
larut air, bahan panas, yang menimbulkan demam ketika diinjeksikan secara i.v pirogen tidak dapat
dihancurkan melalui sterilisasi uap dan filtrasi. (Sudjadi. 2008)

Macam-macam pirogen (Pirogen : 14)

Pirogen dibagi kedalam dua kelas. Pirogen eksogen yaitu terdapat di luar tubuh dan menginduksi
kenaikan suhu ketika diinjeksikan pada manusia dan hewan. Kelompok umum dari pirogen
eksogen yaitu yaitu mikroba, mikrofungi dan virus, juga pirogen non mikrobial seperti beberapa
obat,steroid, fraksi plasma dan bahan tambahan suntik muramil dipeptida. Pirogen endogen
dihasilkan secara internal adalah sel inang pada respon stimulus dari berbagai pirogen eksogen.
Inilah mediator utama dari demam dan didiskusikan pada bagian ini. (Lucas, S. 2006)

Sumber-sumber pirogen

Scoville’s : 196, RPS 18th : 1550, SDF : 46

1. Air desyilat yang telah terkontaminasi oleh bakteri yang tahan udara, yang tumbuh dan
menghasilkan endotoksin.

2. Zat terlarut seperti NaCl dan dekstrosa jga dapat mengadung pirogen

3. Peralatan yang digunkan sering menjadi media kultur bakteri dengan kontaminasi pirogenik.
4. Kontaminasi dapat berasal daeri mikroorganisme di udara atau dari debu.

6. Cara mencegah pirogen

- Cara yang dapat diambil untuk mencegah pemasukan dan peningkatan pirogen dalam cairan
parenteral adalah dengan tepat merancancang dan pengopersaian penyulingan.

- Air destilasi harus terlindung selama pengumpulan dan harus digunakan segera mungkin setelah
destilasi untuk mencegah perkembangbiakan bakteri yang mungkin ada,

Uji pirogen dimaksudkan untuk membatasi resiko reaksi demam pada tingkat yang dapat diterima
oleh pasien pada pemberian sediaan injeksi. Pengujian meliputi pengukuran kenaikan suhu kelinci
setelah penyuntikan larutan uji secara i.v dan ditujukan untuk sediaan yang perlu penyiapan
pendahuluan atau cara pemberiannya perlu kondisi khusus ikuti petunjuk tambahan yang tertera
pada masing-masing monografi. (Lucas, S. 2006)

Alat dan pengencer. Alat suntik, jarum dan alat kaca dibebas pirogenkan dengan pemanasan pada
suhu 250o C selama tidak kurang dari 30 menit atau dengan cara lain sesuai dengan perlakuan
semua pengencer dan larutan untuk pencuci dan pembilas alat suntik dengan cara sedemikian rupa
yang dapat menjamin alat tersebut steril dan bebas pirogen. Lakukan uji pirogen terhadap
pengencer dan larutan pencuci dan pembilas secara berkala. Apabila digunakan injeksi NaCl
sebagai pengencer, gunakan injeksi yang mengandung larutan NaCl PO 9 %. (Lucas, S. 2006)

ALAT DAN BAHAN

ALAT

Beaker gelas

Botol infus

Batang pengaduk

Corong

Kapas swab

Kapas dan kassa

Kaca arloji

Kertas saring

Spatel logam

Tutup infuse (karet)

Tutup alumunium

BAHAN

Larutan uji (glucosum 5%)

Larutan pirotel

PROSEDUR

Uji LAL dilakukan dengan menambahkan 0.2ml larutan uji ke dalam single test vial (STV) dari
pyrotell. Setelah pirotel larut (kira-kira 1 menit), larutan tercampur sempurna dan STV
ditempatkan dengan cepat dalam inkubator kering/ waterbath tanpa sirkulasi pada suhu 37◦ C ±
1◦C dengan waktu 60 ± 2 menit. Setelah masa inkubasi, STV dipindahkan dan dibalikkan dengan
gerakan yang sangat halus. Jika suatu gel terbentuk dan bersisa secara utuh didasar tabung setelah
dibalikkan 180◦C, berarti tes tersebut positif; Konsentrasi endotoksin dalam tabung lebih besar dari
sensitifitas pirotel. Uji negatif yang terjadi mengindikasikan bahwa konsentrasi endotoksin lebih
kecil dari sensitifitas pirotel. Walaupun suatu gel sudah terbentuk tetapi pecah/ tumpah ketika
dibalikkan menunjukkan tes tersebut negatif.
HASIL

KELOMPOK HASIL

1 +

2 +

3 +

4 +

PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini, dilakukan uji pirogen yang bertujuan untuk mengetahui adanya
pirogen hidup atau yang mempunyai daya hidup di dalam suatu sediaan steril. Pirogen
didefinisikan sebagai hasil metabolik dari mikroorganisme hidup atau mati yang dapat
menyebabkan respon piretik spesifik pada penyuntikan (injeksi). Secara kimia pirogen berupa
lipopolisakarida yang larut dalam air dan tidak larut dalam solven. Pirogen ini dapat disaring
(dengan ukuran pori-pori saringan tertentu) dan merupakan zat padat mikromolekul dengan BM
antara 15.000- 4.000.000. Karena pirogen dapat larut dalam air, maka baik sterilisasi dengan uap
bertekanan maupun filtrasi melalui filter pen steril tidak dapat menghilangkan pirogen, meskipun
proses tersebut dapat menghilangkan mikroorganismenya.

Pirogen merupakan substansi yang mampu menyebabkan demam dan sering mencemari
sediaan farmasi. Sampai saat ini, substansi pirogenik yang diketahui paling aktif dan paling sering
mencemari sediaan farmasi adalah endoktoksin. Selain itu masih banyak substansi pirogenik
lainnya seperti bakteri, fungi, DN A-RNA virus dan lain-lain. Endotoksin merupakan suatu produk
mikroorganisme terutama dari bakteri gram negatif yang terdiri atas suatu senyawa kompleks
lipopolysakarida yang pyrogenic, suatu protein dan suatu lipid yang innert. Pada saat ini,
endotoksin diketahui merupakan pirogen yang paling kuat, namun kehadiran pirogen lain dalam
suatu sediaan perlu diperhitungkan karena manusia tidak hanya dipengaruhi endotoksin saja tetapi
juga pirogen yang lain.

Pirogen yang terdapat dalam sediaan parenteral dapat berasal dari ketiga sumber,
antara lain:

1) Air yang digunakan sebagai solven.

2) Wadah atau alat yang digunakan untuk pembuatan, pengemas, penyimpanan, atau pemakaian.
3) Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk membuat larutan atau sediaan parenteral.

Uji pirogen dalam praktikum kali ini dilakukan dengan test LAL metode gel clot. Test
Limulus amebocytelysate (LAL) merupakan uji in vitro untuk deteksi dan analisis
kuantitatif endotoksin bakteri. Pada praktikum kali ini dilakukan test LAL karena dengan
pengerjaan yang sederhana karena tidak perlu menggunakan hewan percobaan kelinci, hasil akhir
yang cepat, murah, serta praktis. Metode yang digunakan dalam test LAL kali ini yaitu Metode
Gel-Clot dimana prinsipnya yaitu LAL akan menggumpal dengan adanya endotoksin.

Uji LAL didasarkan atas kemampuan endotoksin menyebabkan koagulasi "protein

coagulogen", sebagai unsur reagensia LAL, sehingga terbentuk "Gel". Untuk mengevaluasi
hasil reaksi tersebut, Marlys Weary (1986) menyebutkan adanya 4 metode dasar yang dapat
dipakai, yaitu antara lain : The gel-clot end point test: The turbidometric assay; The
cobrimetric assay; dan Chromogenis substrate test. Metode yang disebutkan pertama yaitu
The gel-clot end point test adalah yang paling sering digunakan untuk mengevaluasi Uji LAL.

Sebagai gambaran masing-masing metode dan tahapan-tahapan untuk melakukan uji LAL
adalah sebagai berikut :

"The gel-clot end point test" (Uji penggumpalan gelatin)

 Reagensia LAL dicampur dengan sampel larutan uji dalam tabling galas masing-masing
dengan volume sama yaitu 1,0 ml.

 Setelah dicampur, tabung gelas tersebut diinkubasi pada temperatur 37°C ± 2°C selama
60 menit ± 1 menit.
  Pembacaan pengujian larutan yaitu tabung galas dari inkubator diambil dengan hati-hati,
kemudian membaliknya 180°, sehingga permukaan atas tabung berada di bagian bawah.

 Hasil pembacaan adalah :

Positif (+) jika terbentuk gelatin padat yang tetap, berarti contoh larutan tersebut
mengandung sedikitnya sama dengan sensitivitas reagensia yang digunakan.

Negatif (-) jika tidak terbentuk·gelatin padat yang tetap, berarti bahwa contoh larutan uji
tersebut tidak mengandung endotoksin atau lebih sedikit daripada sensitivitas reagensia
yang digunakan (Usman, 1988).

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil yang diperolehi terdapat pembentukkan gel pada dasar tabung setelah tabung
dibalik 180º secara perlahan. Sampel dinyatakan positif karena mengandung endotoksin (> 0,25
EU/mL) .
DAFTAR PUSTAKA

Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Penerbit UI Press: Jakarta

Aulton, Micheal. 1990. Pharmaceutical Practice. Oritic Livingston: London, New York.

Fifi.2010.Pirogenitas. http://coretanfifi.wordpress.com/2010/03/27/pirogenitas/. [Diakses tanggal

20 november 2016]

Gennaro,A.R, et al. 1990. Remingtons Pharmaceutical Science. 18th Edition. Pensylvania :

Marck Publishing Company

Lucas, S. 2006. Formulasi Steril. Yogyakarta : Penerbit Andi

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit Kanisius (Anggota IKAPI)

Teztee.2009.http://widanindri.blogspot.com/2009/05/pyrogen-pirogen-200c.html Diakses
tanggal 20 november 2016].