PIROGEN

REAKSI PIROGENIK
SEDIAAN STERIL PENINGKATAN SUHU
TUBUH
Jenis pirogen
 Eksogen
 endogen
Endogen
 Interleukin-1
 Interleukin-2
 Nekrosis tumor
 Interferon α, β, γ
Eksogen
 Mikroorganisme :
1. Endotoksin
2. Peptidoglikan
3. Asam tekhoat
4. Eksotoksin
5. Protein
6. Virus
7. Fungi
8. polisakarida
 Non mikroorganisme:
1. Antigen
2. Penisilin
3. Steroida
4. Polinukleotida
5. Alkaloida
Terjadinya demam akibat
endotoksin
Endogenous pyrogen (endotoksin, virus, etc)

Phagocytic leucocytes (makrophag)

Pusat termoregulator di otak

Kenaikan suhu tubuh

Efek fisiologi pirogen
 Increase in body temperature
 Cutaneous vasoconstriction
 Pupillary dilatation
 Decrease in respiration
 Rise in arterial blood preesure
 Nausea
 Severe diarrhea
 Pain in the back and legs
 headache
Sifat fisika kimia pirogen
1. Amphiphilic
• Ujung polisakarida : hidrofil
 Lipid A : hidrofob
 Teragregasi dan diabsorbsi
 Ukuran agregat kecil, kelarutan besar makin toksik
Ukuran agregat dipengaruhi oleh:
a. Bentuk garam : TEA agregatnya paling kecil
b. Kation valensi 2 : mengurangi muatan negatif, shg
ukuran membesar
c. Chelating agent: memperkecil uk. Agregat
d. Surfaktan : memperkecil uk agregat
e. pH naik : ukuran partikel smeakin kecil
2. Pada pH 2, endotoksin bermuatan negatif
3. BM besar
4. Stabil
5. Ukuran : 1 – 50 mikron
6. Tidak dapat mengendap
 Depirogenasi
 Inaktivasi
 Removal
 Inaktivasi
Inaktivasi destruksi kimia:
1. KMNO4/bikromat
2. Hidrolisis asam
3. Hidrolisis basa
4. H2O2 27% (100°C)
5. Ozon + sinar UV
6. Gas EO
Inaktivasi destruksi fisika:
1. Dry heat (170 – 300°C)
2. Wet heat (20 psi)
pH 8,2  5 jam
pH 3,8  2 jam
3. Radiasi sinar γ
 Removal :
1. Pemanasan + surfaktan dan NaOH
2. Destilasi
3. Filtrasi
4. Absorbsi
5. RO
6. Resin penukar ion
 Metode Uji
 Uji pirogen (in vivo)
 Uji endotoksi / LAL test (in vitro)

Produk yang diuji:

Sediaan injeksi dan alkes kontak darah/cairan spinal
Bahan baku, air dan monitoring in process
 Uji Pirogen
Uji dilakukan teradap satu kelompok kelinci terdiri dari 3
ekor. Pirogenitas dilihat dari efek peningkatan suhu tubuh
kelinci:
1. Satu kandang untuk satu ekor
2. Adaptasi suhu 20 – 23 °C tdk lebih dr 7 hari
3. Beda suhu tdk boleh > 3°C
4. Uji ulang untuk 1 kelinci harus ≥ 48 jam
5. Bila kenaikan ≥ 0,6°C, isitirahat 2 minggu
6. Antar kelinci dlm 1 kelompok ≤ 1°C
7. Suhu masing2 maks 39,8 °C
8. Lar uji 10 ml/kg bb, vena tepi telinga, 3 ekor
9. Rekam suhu pada jam ke 1 dan jam ke 3
 Penafsiran hasil
1. Kenaikan suhu dianggap = 0
2. Tak satupun kelinci suhunya naik ≥ 0,5°C
3. Kalau ada yg naik lebih ≥ 0,5°C, diulang lagi dengan
5 ekor kelinci, jadi total 8 ekor kelinci
4. Tidak lebih dr 3 ekor kelinci yg naik 0,5°C atau lebih
5. Total kenaikan 8 kelinci harus ≤ 3,3°C
 Faktor yang berpengaruh
1. Lingkungan
2. Suhu
3. Volume sediaan
4. Jenis sediaan yg dapat meningkatkan suhu, misalnya
hampir semua obat kanker
Lar Na fosfat
Betamethason
Inj chlorpheniramin
MgSO4
Pherphenin
Na tiofenikal
 Uji endotoksin
 Uji LAL = Limulus Amoebaocyte Lysate
 Didasarkan reaksi jendal sel darah (amoebocyte)
lysate dari horseshoe crab (limulus polyphemus)
dengan endotoksin
 Metode lebih cepat, lebih ekonomis, dan lebih sensitif
dibandingkan uji pirogen menggunakan kelinci
 Uji endotoksin/LAL
 Reaksi
Endotoksin + Reagen LAL  jendal gel
 Metode uji endotoksin
 Metode jendal gel
Original method
Sampel diinkubasi dengan LAL yg telah diketahui
sensitivitasnya. Pembentukan jendal gel menunjukkan
positif terhadap endtoksin
 Metode turbidimetrik
Adanya endotoksin LAL menyebabkan kekeruhan di
bawah kondisi tertentu membentuk suatu jendal gel padat
 Metode khromogenik
Konsentrasi endotoksin diukur fungsi intensitas warna
 Metode jendal gel
 Reagen LAL mempunyai paramter kepekaan
(λ)=konsentrasi endotoksin
 Λ = 0,125 EU/ml artinya reagen LAL akan mengendap
bila di+ endotoksin minimal 0,125 EU/ml
 Metode turbidimetri
 A. Uji end point
Larutan standard berbagai konsentrasi + reagen LAL
Kekeruhan yg tjd diukur dgn spektrofotometer atau dgn
plate reader
Didapatkan harga beberapa ODC (optical density)
Dibuta kurva baku antara kadar dan OD
Kelemahan : kekeruhan tergantung dgn waktu
B. Metode turbidimetrik kinetik
Menghitung onset of time atau waktu untuk
mencapai/mendapatkan kekeruhan dgn derajat tertentu
 Metode khromogenik
 Reagen LAL+endotoksin+substrat sintetik
 Substrat sintetik : substrat peptida dgn ujung asam
amino
 Ujung ini merupakan kromofor yg tdk berwarna
selama melekat pada substrat
 Edotoksin dapat melepas kromofor ini shg larutan
menjadi berwarna kuning
 Semakin tinggi kromofor semakin kuat warna kuning
yg timbul
 Batas endotoksin
 Endotoksin dpt menimbulkan efek pirogen : ≥5 EU/kg
BB/jam
 LVP : 0,5 EU/ml
 WFI : 0,25 EU/ml
 Sediaan radio farmasi : 175 EU/ml
 Intratekal : 14 EU/volume
 Uji partikel asing
 Definisi :
 Partikel asing atau bahan partikulat adalah semua zat
asing yg tdk larut, melayang, bukan gelembung gas, yg
tanpa sengaja ada di dalam larutan parenteral.
 Persyaratan
 Persyaratan bahan partikulat untuk:
Injeksi volume besar (LVP) untuk infus dosis tunggal
≥ 10 µm maksimum 50 partikel/ml
≥ 25 µm maksimum 50 partikel/ml

Injeksi volume kecil (SVP)

≥ 10 µm maksimum 10.000 partikel/wadah
≥ 25 µm maksimum 1000 partikel/wadah
 Efek partikel asing
Pengaruh partikel asing:
 Bahaya scr klinis
1. Emboli
2. Inflamasi
3. Reaksi alergi
4. Kematian
 Kualitas produk rendah

Reaksi tergantung pada:

 Tempat penyuntikan
 Ukuran, bentuk dan jumlah partikel
 Kondisi pasien (alergi atau tidak)
 Sumber partikel
 Produk
 Kemasan
 Tutup wadah
 Proses manufakturing
 Saat sediaan digunakan
 Pemeriksaan partikel
 Manual
1. Scr visual
Dilihat di bawah cahaya dgn latar belakang hityam
putih
Kelemahan : partikel ≤ 50 µm tdk teramati
2. Optical microscopy
B. Otomatis
1. Electrolytic displacement
Partikel mengusir bagian elektrolit larutan pembawa shg
tjd perubahan tahanan di antara 2 elektroda
2. Light blockage
Reduksi cahaya pada photocell krn keberadaan partikel
pada zona sensor
3. Near forward light scattering
Partikel dlm larutan terekspose sinar laser memberikan
intensitas respon proporsional dgn area partikel
 Pemeriksaan volume
 Volume ≥ 10 ml, minimal 1 sampel
 Volume > 3 ml, minimal 3 sampel
 Volume ≤ 3 ml, minimal 5 sampel

Cara kerja:
Larutan uji diambil dgn jarum suntik (≤ 3 x volume
sampel)
Ukuran jarum suntik 21 panjang ≥ 2,5 cm
Gelembung udara dikeluarkan, sampel dimasukkan ke
dalam gelas ukur, volume sampel diukur
 Cara lain:
Sampel dimasukkan dalma erlenmeyer, ditimbang, hasil
timbvangan dibagi dgn BJ
Bila volume 1 ml atau 2 ml dpt digabung, bila volume 10
ml lgsg diukur
Semua volume tdk boleh ada yg menyimpang dari tabel
Utk myk : hangatkan, kocok, isi diambil atau dituang,
dinginkan pada suhu 25°C
 Pemeriksaan berat
 Ambil 20 wadah dari 60 wadah
 Etikel diambil dan dicuci bersih, dikeringkan
 Tutup diobuka
 Masing2 wadah ditimbang, isi dikeluarkan, wadah
dicuci dgn air
 Wadah dibilas dgn alkohol
 Dikeringkan 105°C
 Dimasukkan eksikator sampai berat tetap
 Syarat :
 Selisih berat rata2 lebih dr 10% : paling byk 2 wadah
 Tidak satupun selisihnya dgn rata2 lebih dr 15%
 Pemeriksaan kebocoran
1. Cara sordrager/dye bath method
 Ampul dimasukkan baki aluminium berisi 3 liter/lebih
larutan FD&C no. 1 dlm (metilen blue) 0,8-0,9% (b/v)
 Baki ditutup, semua ampul harus terendam
 Baki diamsukkan bejana. Bejana ditutup dan dibuat
vakum
 Bejana dibuka
 Didiamkan 15 menit
 Ampul diambil dan diperiksa : larutan dlm ampul tdk
boleh berwarna biru
2. Metode penarikan vakum ganda
 Ampul dimasukkan baki berlubang
 Bagian dasar diberi alas dgn kertas penyerap
 Baki dimasukkan dalam almari
 Almari ditutup dan divakum
 Almari dibuka dan ampul dibuarkan 5 menit
 Kertas penyerap tdk boleh terkena noda