PREPARASI SAMPEL

PADA
ANALISIS FARMASI
Pendahuluan
 Sediaan obat atau sampel secara umum tidak dapat
dianalisis secara langsung misalkan dengan
kromatografi tanpa dilakukan perlakuan awal terhadap
sampel tersebut.
 Langkah ini disebut preparasi sampel atau langkah
pembersihan sampel dari pengotor yang mungkin
ada sehingga mengganggu analisis lebih lanjut
 Preparasi sampel atau perlakuan sampel sering
digunakan untuk mengkondisikan sampel sehingga
siap untuk dilakukan analisis dengan metode tertentu.
 Pendahuluan

 Tujuan Preparasi sampel:

 untuk memisahkan analit dari bahan yang terdapat dalam
sediaan farmasi atau sampel biologis yang bisa
mengganggu analisis.
 untuk mendapatkan analisis yang akurat dan teliti
 untuk memekatkan analit yang berkadar kecil
Alur proses analisis sed. farm
Pengertian
 Sampel laboratorium (laboratory sample): sampel
bahan yang dikirim atau diterima oleh lab
 Sampel uji (test sample): sejumlah bahan dari sampel
laboratorium yang mewakili komposisi sampel lab.
 Porsi uji (test portion): sejumlah bahan dengan
ukuran yang sesuai untuk mengukur kosentrasi atau
sifat lain yang diinginkan, yang diambil dari sampel
uji, ditimbang dan digunakan untuk sekali
penetapan
Pengertian
 Larutan uji (test solution): larutan yang telah
mengalami perlakuan yang sesuai yang diambil
dari porsi uji. Larutan ini bisa langsung digunakan
untuk penetapan tanpa sampling error
 Aliquot: fraksi dengan volume yang diketahui
dari larutan uji, yang bisa langsung digunakan
untuk penetapan tanpa sampling error
Contoh pra-perlakuan sampel
 cara pemekatan bagi sampel dengan kadar analit
yang sangat rendah.
 Memanaskan sampel yang mengandung analit yang
tahan panas pada suhu 100 -120°C untuk
menghilangkan pengaruh variasi kandungan air
 Menimbang sampel sebelum dan sesudah
pemanasan sehingga kandungan air dapat diketahui
 Memisahkan analit dengan karakteristik tertentu
menggunakan berbagai teknik pemisahan antara
lain: distilasi, sentrifugasi, filtrasi, ekstraksi
pelarut, dan ekstraksi fase padat (solid
phase extraction).
Contoh pra perlakuan sampel
 Menghilangkan komponen matriks sampel yang
dapat mengganggu analisis komponen yang dituju
 Memekatkan analit jika kandungan analit dalam
sampel di bawah kisaran konsentrasi metode analisis
yang digunakan, misal dengan penguapan, distilasi,
ko-presipitasi, pertukaran ion, ekstraksi pelarut,
dan ekstraksi fase padat, atau dengan elektrolisis
 Sampel Tablet dan kapsul
 Tablet dan kapsul biasanya sebagian besar terdiri dari bahan
pengisi, kecuali untuk tablet-tablet seperti parasetamol yang
kandungan zat aktifnya besar dalam formula.
 Bahan pengisi yang banyak digunakan pada tablet adalah
laktosa dan gula lainnya atau polimer gula seperti selulosa, pati,
dan manitol.
 Bahan-bahan tersebut polar dan akan larut dalam air, sehingga
prosedur ekstraksi untuk obat yang larut air dilakukan dengan
media air sehingga obat dapat direcovery secara efisien.
 Bahan-bahan pengisi ini tidak mengabsorbsi radiasi UV
sehingga tidak mengganggu jika dilakukan penetapan dengan
HPLC. Begitu juga jika dilakukan penetapan dengan
spektrofotometri UV, hanya akan memberikan sedikit gangguan.
 Jika obat agak sukar larut dalam air, maka metanol atau etanol
bisa digunakan untuk ekstraksi karena bisa melarutkan banyak
senyawa organik.
Tablet dan kapsul

 Bahan pelicin biasa digunakan untuk sediaan

tablet dan termasuk magnesium stearat, asam stearat
dan polyethylene glycol.
 Bahan-bahan pelicin ini hanya 1-2% dari komposisi
tablet sehingga sangat kecil kemungkinannya
mengganggu penetapan karena kromofornya lemah.
 Tablet salut biasanya menggunakan polimer gula
seperti hydroxypropylmethylcellulose (HPMC).
Penyalut hanya sekitar 3% dari komposisi tablet,
larut air dan tidak mengabsorbsi radiasi UV.
Tablet dan kapsul

 Pewarna memilki potensi mengganggu analisis

karena bisa menyerap radiasi UV/Vis.
 Pada tablet dan kapsul, pewarna berupa pewarna
organometalik atau oksida logam yang kebanyakan
tidak larut dalam pelarut yang digunakan untuk
ekstraksi dan dapat disaring bersama konstituen
matrik yang tidak larut lainnya.
 Jika kapsul dianalisis, cangkang kapsul harus
dipisahkan sebelum isi kapsul diekstraksi
Larutan dan Suspensi
 Pada suspensi dan larutan, pewarna yang digunakan
adalah pewarna larut air dan termasuk pigmen
alami seperti klorofil, karotenoid, dan antosianin.
 Preparasi sampel dilakuan dg:
 Ekstraksi fase padat (SPE = Solid Phase
Extraction) dengan resin penukar ion berguna untuk
memisahkan pewarna anion dan kation,
 Ekstraksi obat kedalam pelarut organic dengan
polaritas yang sedang dapat memisahkan pewarna
kedalam fase air.
Larutan dan Suspensi
 Larutan biasanya mengandung pengawet
antimikroba dan antioksidan, biasanya berupa
fenol atau amin kwartener seperti benzalkonium
klorida yang memiliki kromofor yang cukup kuat
yang bisa mengganggu analisis obat.
 Senyawa tsbt dipisahkan sebelum analisis dengan
prosedur ekstraksi.
 Suspensi juga mengandung surfaktan seperti
detergen berbasis-polyethylene glycol (PEG) tetapi
senyawa ini tidak mengabsorbsi UV sehingga
potensinya kecil untuk mengganggu penetapan
Cream dan Ointment
 Garam natrium dan kalium dari asam lemak,
surfaktan kation dan surfaktan non-ionik digunakan
dalam cream dan ointment.
 Senyawa-senyawa ini tidak memiliki kromofor yang
kuat, namun asam lemak bisa mengganggu dalam
kromatografi karena bisa mengkontaminasi kolom
RP-HPLC jika asam lemak tersebut tidak
dipisahkan.
 Kontaminasi kolom RP-HPLC oleh bahan-bahan
berlemak ditandai dengan hilangnya bentuk peak
kromatogram
Cream dan Ointment
 Cream dan ointment mengandung sejumlah besar
trigliserid berminyak yang harus dipisahkan untuk
menghindari gangguan selama proses kromatografi.
 Ektraksi cream dengan methanol dapat
memisahkan sebagian pengganggu, partisi ekstrak
dengan hexan dan methanol atau campuran
methanol air juga bisa digunakan, bahan-bahan
lipofil akan masuk pada fase hexan.
Sampel biologis
Teknik-teknik pra perlakuan
sampel
1. Analisis langsung
2. Ekstraksi padat-cair
3. Ekstraksi cair-cair (Liquid-Liquid Extraction,
LLE)
4. Ekstraksi fase padat (Solid Phase Extraction,
SPE)
1. Analisis langsung
 Bentuk sediaan cair seringkali dapat
dilakukan pengukuran secara langsung atau
diencerkan atau dipekatkan lebih dahulu
sebelum dilakukan pengukuran.
 Untuk kromatografi, pengenceran dilakukan
dengan menggunakan fase gerak.
 Beberapa pengotor dalam suatu pelarut yang
mudah menguap seperti etanol dan metanol
dalam bentuk sediaan dapat langsung dianalisis
secara langsung (diinjeksikan langsung)
menggunakan kromatografi gas.
Ekstraksi
Ekstraksi (penyarian): teknik untuk mendapatkan
senyawa kimia dari suatu pelarut, lingkungan atau
sistem, dan dipindahkan ke sistem yang lain.

Penggolongan Ekstraksi

•Ekstraksi padat-cair (liquid-solid extraction)

•Ekstraksi cair-padat (solid-liquid ekstraction)
•Ekstraksi cair –cair (liquid-liquid ekstraction)
Ekstraksi

 Hal-hal yang harus diperhatikan :

 sampel harus mudah didapatkan kembali dari cairan
penyari
 cairan penyari tidak toksik dan tidak mudah terbakar

 Tidak mau campur antara pelarut dan penyari

 memiliki perbedaan bobot jenis yang nyata

 memiliki titik didih yang nyata

 penyari tidak mengganggu pada analisis selanjutnya

 tidak menimbulkan buih dan emulsi sewaktu digojog

2. Ekstraksi padat-cair
Keuntungan dan kerugian berbagai prosedur
penyiapan sampel tablet dalam analisis
METODE PROSDUR RINGKAS KEUNTUNGAN KERUGIAN

1. Tablet dilarutkan Menghilangkan Obat harus terlarut

langsung dg pelarut yg segregasi sempurna dlm
sesuai pelarut selama
A
2. Pengukuran alikuot tablet mengalami
larutan disintegrasi

1. Menggerus tablet Menghilangkan Babarapa bahan

hingga diperoleh segregasi. Obat tambahan aktif
serbuk halus dilepaskan secara masih tetap tidak
2. Melarutkan serbuk ke bebas, dg tidak larut karena telah
B tergantung pada tercapainya batas
dalam pelarut yg sesuai
karakteristik tablet. kelarutan obat.
3. Pengukuran alikuot
larutan
Lanjutan …
METO PROSDUR RINGKAS KEUNTUNGAN KERUGIAN
DE
1. Menggerus tablet hingga Menghilangkan Pengayakan dapat
diperoleh serbuk halus. adanya kecendrungan menghasilkan
2. Melewatkan serbuk kedalam pengumpulan muatan
ayakan 60 mesh sehingga akan elektrostatik antara
C menghasilkan partikel partikel yg justru
3. Pengukuran alikuot larutan
dg ukuran yang akan
seragam menyebabkan
terjadinya
penggumpalan
1. Menggerus tablet hingga Menghilangkan Obat dan bahan
diperoleh serbuk halus adanya kecendrungan tambahan lainnya
2. Melarutkan serbuk penggumpalan dan dpt berubah secara
kedalam pelarut organik adanya partikel yang kimiawi oleh
D free flowing. pelarut organik
3. Melanjutkan penggerusan
Memfasilitasi
4. Penguapan pelarut kelarutan bahan obat
5. Pengukuran residu dlm pelarut.
Ekstraksi cair-padat
 Dilakukan dari sampel yang berkadar kecil dalam cairan
 Contoh : cemaran pestisida dalam air laut dialirkan kedalam

kolom yang berisi bahan penjerap misalnya silika gel, maka

pestisida akan tertinggal dalam penjerap silika gel (adsorbsi).

O
H H
O
OH OH OH OH
O O O O O O O
Si Si Si Si Si Si
O O O O
3. Ekstraksi-cair-cair
 Prosedur ekstraksi cair-cair : ekstraksi analit dari fase
air ke pelarut organik yang bersifat non polar atau
agak polar (heksana, metilbenzen, diklormetan).
 Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut

organik adalah molekul-molekul netral berikatan

kovalen dengan substituen yang bersifat nonpolar atau
agak polar.
 Senyawa-senyawa polar dan juga senyawa yang

mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase

air.
Ekstraksi-cair-cair
 Distribusi Nernst (hukum partisi) : “pada konsentrasi dan
tekanan yang konstant, analit akan terdistribusi dalam
proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang
saling tidak campur”.
 Perbandingan konsentrasi kesetimbangan antara dua fase
tersebut disebut koofesien distribusi atau koefisien partisi
(KD).

KD = [S] org atau D = (Cs) org

[S]aq (Cs) aq
Ket :
D : rasio distribusi / rasio partisi
Jika tidak ada interaksi antara analit yang terjadi dalam kedua
fase maka nilai KD dan D adalah identik
 Ekstraksi cair-cair

 Proses ekstraksi menggunakan corong

dalam beberapa menit

 memiliki kelarutan yang rendah dalam air

(< 10%)
Syarat pelarut
 dapat menguap sehingga mudah
organik
dihilangkan setelah ekstraksi dilakukan
 memiliki kemurnian yang tinggi untuk
meminimalkan kontaminasi sampel.
Efisiensi ekstraksi
Efisiensi ekstraksi meningkat jika :
•digunakan jumlah larutan ekstraksi yang lebih
besar atau
• dengan melakukan beberapa kali ekstraksi dengan
volume yang sama.

Efisiensi
ekstraksi

Caq = banyaknya analit dalam fase air

(Caq)n = banyaknya dalam fase air setelah n ekstraksi
Vorg = volume pelarut organik
Vair = volume air
n = banyaknya ekstraksi
Ekstraksi Asam basa Organik
 Proses ekstraksi senyawa asam-basa organik dapat
dioptimalkan dengan pengaturan pH.
 Pada pH rendah: senyawa asam (dalam bentuk tak

terionkan) akan terekstraksi ke dalam pelarut non polar

lebih besar.
 Pada pH tinggi: senyawa asam akan terionnisasi
sempurna sehingga tidak ada yang terekstraksi ke dalam
pelarut non polar.
 Pemisahan campuran asam atau campuran basa hanya

mungkin dilakukan jika konstanta disosiasinya berbeda

beberapa unit pK.
 Cara Ekstraksi Cair-Cair
 Analit harus berada dalam cairan (pelarut pertama) 
larut / tidak larut !
 Analit dalam cairan pertama tersebut akan diekstraksi ke
pelarut ke dua.
 Syarat pelarut ke dua, harus:
- melarutkan analit yang akan diekstraksi
- tidak bercampur dengan pelarut pertama
- mudah diuapkan
 Senyawa (Obat ) dalam bentuk
asam bebas atau basa bebas

Mudah diekstraksi ke dalam pelarut organik

 Obat/Asam: lakukan ekstraksi dengan pelarut

organik dari lingkungn asam

 Obat/Basa: lakukan ekstraksi dengan pelarut

organik dari lingkungan basa
 Obat dalam bentuk :
 Garam :
- Sangat mudah larut dalam air
- Kembalikan ke bentuk asam-/basa-nya.

 Netral :
- Di ekstraksi tanpa memperhatikan pH
larutan.
 Masalah dalam ekstraksi pelarut
Masalah yang sering dijumpai :
 terbentuknya emulsi
 analit terikat kuat pada partikulat
 analit terserap oleh partikulat yang mungkin ada
 analit terikat pada senyawa yang BM-nya tinggi
 kelarutan analit secara bersama-sama dalam kedua fase.

penambahan garam ke dalam fase air

pemanasan atau pendinginan corong pisah
Pemecahan emulsi penyaringan melalui glass-wool
penyaringan dengan kertas saring
penambahan sedikit pelarut organik yang berbeda
sentrifugasi
4. Ekstraksi fase padat
(Solid Phase Extraction [SPE])
 Teknik SPE untuk pra-perlakuan sampel atau clean-up sampel-sampel
yang kotor seperti sampel dengan kandungan matriks yang tinggi
seperti garam-garam, protein, polimer, resin dll.
 Efisiensi SPE dapat memperoleh recovery yang tinggi (>99 %).
 Tahapan SPE
 Pengkondisian
 Kolom (cartridge) dialiri dengan pelarut sampel untuk mencapai
nilai pH yang sama.
 Retensi (tertahannya) sampel
 Larutan sampel dilewatkan dalam cartridge baik untuk menahan
analit dan mengelusi komponen yang tidak diharapkan , atau
sebaliknya.
 Pembilasan
 Menghilangkan seluruh komponen yang tidak tertahan oleh
penjerap selama tahap retensi.
 Elusi
 Mengambil analit yang dikehendaki jika analit tersebut tertahan
pada penjerap.

Contoh : Sampel berupa salep dan sirup metil paraben dengan

penjerap Kieselguhr. Penambahan HCl 0,01 M ke sampel,
tambahkan ke penjerap. Elusi dengan dietil eter atau metanol.
 Contoh Ekstraksi Senyawa Organik
STAT-OTTO-GANG
100-300 mg bahan yang dianalisis + 5 ml air (bila perlu dinetralkan
dgn. larutan NaHCO3 8%) + air lagi sampai 10 ml, diasamkan dgn
3N H2SO4 (± 2 ml) sampai pH=1

II
I
Ekstrak kloroform dlm
Ekstrak eter dlm
suasana asam : asam yg
suasana asam : dikocok dgn 3 x 15 ml
larut dlm kloroform
berbagai asam eter
(enol, zat netral, basa
fenol, ureida, zat dinetralkan dgn larutan NaHCO3 8 % dan + lemah)
netral asam tartrat 10 % (pH = 4-5)
dikocok dgn 3 x 15 ml
fase eter dikocok dgn 3 x kloroform (panas)
III
5 ml 0,5N NaOH dibasakan dgn 3N NaOH sampai pH>10 ekstrak eter dlm
dikocok dgn 3 x 15 ml suasana basa : beberapa
fase eter eter, bila perlu dikocok basa
fase air lagi 1-2 x 15 ml kloroform
diasamkan dgn diasamkan dgn 3N H2SO4, lalu pH IV
3N H2SO4 dan IB dijadikan 9 dgn + 6N NH3 ekstrak kloroform
diekstraksi 3 x zat dikocok dgn 3 x 15 ml kloroform- suasana amoniak : basa,
15 ml eter netral isopropanolol (3:1) fenol, basa yg larut dlm
kloroform
IA fase air
asam,
V
fenol,
zat yang tak terekstrak dgn mengocokkan : berbagai asam, sulfonamida,
ureida
karbohidrat, asam amino, senyawa amonium kuartener 42
 Ekstraksi Senyawa Organik
43  Fraksi 1A : ekstrak eter diasamkan dengan H2SO4,
kocok maka akan diperoleh ekstrak : asam
karboksilat, fenol dan zat netral.
 Fraksi 1B : fraksi 1 + larutan basa, kocok maka akan
diperoleh zat netral.
 Larutan basa diasamkan lagi dengan ditambah
H2SO4 maka akan diperoleh asam karboksilat, fenol
dan senyawa yang larut dalam basa pada fraksi 1A.
Fraksi 1A
Fraksi 1A & 1B

 Netralkan H2SO4 lalu asamkan sampai pH

dengan asam tartrat, selanjutnya diekstraksi
dengan kloroform maka akan diperoleh fraksi-
fraksi yang mengandung asam karboksilat, zat
basa lemah yang larut dalam kloroform.

Fraksi 2 Fraksi 3
 Ekstraksi Senyawa Organik …
(lanjutan)
 Bila fase air dibebaskan kemudian diekstraksi
maka akan diperoleh fraksi 3 yang berisi
berbagai basa.
 Bila fase alkali pada fraksi 3 dinetralkan lalu
dialkaliskan sampai pH 9 dengan amoniak dan
ekstraksi dengan kloroform-isopropanol maka
akan diperoleh berbagai basa fenol dalam fraksi
4.
Fraksi 3 Fraksi 4

 Setelah dipisahkan dari fraksi 4 maka akan

diperoleh senyawa yang tak dapat dipisahkan
dengan pengocokan sebagai fraksi 5 yang berisi :
asam hidrofil, sulfonamida, karbohidrat, asam
amino, amonium kuartener.
Fraksi 5