Phenotypic and Genotypic Investigation of Carbapenem-

Resistant Acinetobacter baumannii in Maharaj Nakhon Si

Thammarat Hospital, Thailand

Oleh
dr. Nurul Media Ulfa

Pembimbing
Dr. dr. Zinatul Hayati, M.Kes, Sp.MK (K)
dr. Wilda Mahdani, M.Si, M.Ked. Klin., Sp.MK

BAGIAN/KSM MIKROBIOLOGI KLINIK

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA
RSUD DR. ZAINOEL ABIDIN
BANDA ACEH, APRIL 2023
2
Latar belakang: Acinetobacter baumannii dikenal sebagai agen penyebab infeksi yang
didapat di rumah sakit yang parah, terutama di unit perawatan intensif. Penelitian ini
mengkarakterisasi sifat genetik dari isolat klinis A. baumannii yang resisten terhadap
carbapenem (CRAB) yang membentuk biofilm. Selain itu, penelitian ini menentukan
prevalensi isolat A. baumannii penghasil biofilm dari rumah sakit perawatan tersier dan
menyelidiki hubungan biofilm dengan distribusi genotipe yang terkait dengan biofilm dan
resistensi antibiotik

Metode: Sebanyak 995 isolat A. baumannii non-duplikat diidentifikasi, dan kerentanannya

terhadap antibiotik yang berbeda ditentukan dengan menggunakan metode difusi cakram.
Dengan menggunakan uji lempeng mikrotiter yang dimodifikasi, isolat CRAB diselidiki
untuk mengetahui kemampuan pembentukan biofilmnya. Aktivitas hemolisin dan protease
ditentukan. CRAB menjadi sasaran uji polymerase chain reaction (PCR) yang menargetkan
gen blaVIM, blaNDM, blaIMP, blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, csuE, dan
pgaB. Masing-masing isolat CRAB diidentifikasi DNA-nya dengan menggunakan Repetitive
Element Sequence-based (REP)-PCR.
3
Pendahuluan

• Acinetobacter baumannii adalah coccobacillus gram negatif yang bertanggung jawab atas infeksi yang
didapat di rumah sakit, seperti pneumonia yang berhubungan dengan ventilator, meningitis sekunder,
infeksi kulit dan jaringan lunak, septikemia bakterialis, infeksi saluran kemih, dan infeksi luka bakar,
terutama di unit perawatan intensif (ICU)

• Infeksi-infeksi ini sering kali terkait dengan tingkat kematian yang lebih tinggi hingga 26% pada pasien
yang dirawat di rumah sakit.

• Untuk ICU angkanya berkisar antara 4% hingga 43%

• A. baumannii adalah organisme pertama dalam daftar prioritas Organisasi Kesehatan Dunia (WHO)
yang menimbulkan risiko signifikan bagi kesehatan manusia

4
Pendahuluan

• Banyak faktor yang terlibat dalam penyebaran A. baumannii sebagai patogen endemik di seluruh
fasilitas kesehatan di dunia, termasuk resistensi intrinsik dan resistensi yang didapat dari beberapa
kelas antimikroba

• Anti mikroba termasuk penisilin, sefalosporin spektrum luas, fluorokuinolon, dan karbapenem , serta
kemampuannya untuk membentuk biofilm dan bertahan di permukaan biotik dan abiotik, termasuk
permukaan lingkungan dan peralatan medis

• Produksi karbapenemase adalah mekanisme yang paling mengkhawatirkan dalam evolusi resistensi
karbapenem pada A. baumannii. Mereka termasuk dalam tiga dari empat kelompok β-laktamase, A, B
dan D

5
Pendahuluan
• OXA β-laktamase adalah karbapenemase Kelas D, yang selanjutnya diklasifikasikan ke dalam
beberapa subkelompok, terutama dikodekan oleh blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-58,
blaOXA-48-like, blaOXA-51-like, dan blaOXA-143-like

• Jenis β-laktamase OXA utama pada spesies Acinetobacter adalah blaOXA51-like, dikodekan
secara kromosomal dan unik untuk spesies ini tetapi dapat memberikan resistensi terhadap
karbapenem ketika ekspresinya diatur melalui reorganisasi genetik.

• Metallo-beta-laktamase (MBL) termasuk dalam karbapenemase Kelas B, terutama

karbapenemase New Delhi blaNDM

• Selain itu, kemampuan A. baumannii untuk hidup di permukaan abiotik, seperti kateter dan
selang endotrakeal, menjadi penghalang yang signifikan dalam pengendalian infeksi.

6
PENDAHULUAN
• Kapasitas untuk membentuk biofilm adalah faktor utama yang mempengaruhi
kemampuan A. baumannii untuk berkembang dalam keadaan yang sulit,
menjadikannya faktor virulensi utama

• Dibandingkan dengan A. baumannii non-MDR (5-24%), A. baumannii MDR memiliki

tingkat produksi biofilm yang jauh lebih tinggi (80-91%)

• Karena kapasitas A. baumannii untuk menghasilkan biofilm, bakteri ini dapat

berkembang biak, menempel pada permukaan mukosa, mempertahankan dormansi
dalam lapisan biofilm yang dalam dan bertahan di lingkungan rumah sakit dalam
kondisi stress
BAHAN DAN METODE
▸ Isolat 995 A. baumannii non-duplikasi diperoleh dari Februari hingga
September 2021 di Rumah Sakit Maharaj Nakhon Si Thammarat.

▸ Isolasi dan Identifikasi Bakteri

Isolat yang disimpan dipulihkan dan dikonfirmasi sebagai A. baumannii
dengan metode mikrobiologi konvensional seperti pewarnaan gram,
coccobacilli gram; uji oksidase; uji TSIA; Simmons citrate agar; motilitas- indol-
lisin; OF-maltosa; OF-glukosa dan pertumbuhan pada MacConkey agar pada
suhu 42° C
BAHAN DAN METODE
 Uji Hemolisis dan Aktivitas Protease
 Aktivitas hemolisin fenotipik ditentukan dengan menggunakan
metode streaking dan spot pada uji lempeng agar darah. Semua pelat
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ◦C. Pada lempeng agar darah,
hemolisis divisualisasikan.

 Pembentukan Biofilm Menggunakan Uji Lempeng Mikrotiter

Teknik lempeng mikrotiter menilai kapasitas pembentukan biofilm dari isolat
klinis CRAB. Isolat dikultur semalaman pada suhu 37◦C dalam tryptic soy broth
(TSB) (Oxoid, Basingstoke, Inggris) dan disesuaikan dengan standar No. 0,5
McFarland. Pelat dasar datar 96 sumuran diinokulasi dengan 20 mikroliter kultur
bakteri segar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37◦C dalam 180 mikroliter
TSB yang dilengkapi dengan 0,25% (w/v) glukosa.
BAHAN DAN METODE
• Karakteristik Genotipic dari resistensi mikroba dan gen terkait biofilm
dengan PCR
Isolat CRAB dikultur dalam kaldu Luria-Bertani pada suhu 37°C. Template
DNA untuk percobaan PCR disiapkan dengan menggunakan kit ekstraksi DNA
genom.

• Molecular typing and Clonal Relationship between CRAB by Repetitive

Element Sequence-Based PCR (REP PCR)
Untuk membedakan strain bakteri, DNA diselidiki dengan menggunakan REP-
PCR. Elemen REP-like dalam DNA genom yang diisolasi dari isolat CRAB
diamplifikasi menggunakan pasangan primer REP1 (5′- IIIGCGCCGICATCAGGC- 3′)
dan REP2 (5′-ACGTCTTATCAGGCCTAC- 3′)
ANALISIS DATA STATISTIK
▸ Data dianalisis menggunakan GraphPad Prism 9. Semua analisis dilakukan dengan
menggunakan tiga percobaan terpisah.

▸ Prevalensi CRAB, pembentukan biofilm genotipik dan fenotipik serta resistensi

obat ditunjukkan dalam bentuk persentase

▸ Hubungan antara pembentukan biofilm dan kerentanan antibiotik ditunjukkan

dengan heatmap analisis dan uji chi-square di mana nilai p <0,05 dianggap
signifikan secara statistik.
HASIL
▸ Dari 995 isolat A. baumannii non-duplikat, tingkat resistensi tertinggi diamati terhadap
meropenem (100%), imipenem (100%), doripenem (100%), ceftazidime (99,42%), gentamicin
(85%), ciprofloxacin (83,40%) dan amikasin (76,7%). Analisis resistensi terhadap kelas antibiotik
yang berbeda menunjukkan bahwa 100% dari isolat adalah MDR. 172 isolat (17,29%) adalah
CRAB.
HASIL
HASIL
• Aktivitas Hemolisis dan Protease
 Hanya 4/172 (2,33%) isolat CRAB yang positif memiliki aktivitas hemolisis, dan
semuanya memiliki fenotipe beta-hemolisis.

 Hasil skrining proteolitik primer menunjukkan bahwa semua isolat positif

memproduksi protease berdasarkan pembentukan zona halo hidrolisis di sekitar
koloni.
HASIL
• Fenotipe Pembentukan Biofilm dari CRAB
 99 (57,56%) merupakan penghasil biofilm

 73 (42,44%) merupakan penghasil non- biofilm.

 Penghasil biofilm CRAB Strain dibagi menjadi tiga kategori: 40 (23,26%) merupakan penghasil
biofilm lemah, 39 (22,67%) merupakan penghasil biofilm sedang dan 20 (11,63%) merupakan
penghasil biofilm kuat.
• Prevalensi Resistensi Obat, Genotipe Terkait Biofilm dan Keanekaragaman Genetik CRAB
▸Dalam penelitian ini, isolat CRAB memiliki gen yang terkait dengan resistensi obat,
termasuk gen blaOXA51-like , dengan tingkat 100% (172 isolat) dan merupakan genotipe yang
paling banyak ditemukan.

▸Sebaliknya, gen blaVIM , blaIMP , blaNDM dan blaOXA23 yang mirip dengan blaOXA23
terdapat pada 137 isolat (79,65%), satu isolat (0,58%), 21 isolat (12,21%) dan 161
isolat (93,60%). Gen blaOXA24-like tidak ditemukan pada isolat CRAB.

▸Percobaan PCR menunjukkan hasil positif untuk gen yang berhubungan dengan
biofilm hanya pada gen csuE pada 19 (11,05%) isolat, hanya gen pgaB pada 24
(13,395%) isolat, dan kedua gen csuE dan pgaB pada 113 (65,70%) isolat. Namun, ada
16 (9,30%) isolat yang tidak membawa kedua gen tersebut.
▸ Distribusi pembentukan biofilm dari isolate-isolate dengan fenotip
resistensi antibiotic yang berbeda
DISKUSI
▸ Peran A. baumannii dalam infeksi nosokomial, kemampuannya yang menonjol untuk menghilangkan
resistensi antimikroba dan keterlibatannya dalam infeksi klinis yang parah telah meningkatkan
perhatian yang cukup besar

▸ Karbapenem saat ini merupakan pengobatan pilihan untuk infeksi MDR A. baumannii yang resisten
terhadap sefalosporin generasi ketiga. Namun, jumlah strain yang resisten terhadap karbapenem
terus meningkat

▸ Sebagai hasil dari tingkat prevalensi yang besar dari infeksi ini dan pola resistensi antibiotik yang
bervariasi di berbagai lokasi geografis, pengawasan tingkat prevalensi dan antibiogram di berbagai
belahan dunia menjadi sangat penting

▸ Dalam penyelidikan kami, 172 dari 995 isolat A. baumannii dari sampel klinis resisten terhadap
carbapenem
DISKUSI
▸ Selain itu, semua isolat CRAB adalah MDR (100%). Resistensi terhadap antibiotik sefalosporin,
gentamisin dan siprofloksasin, lebih dari 80%. Semua isolat resisten terhadap imipenem,
meropenem dan doripenem

▸ Hampir semua isolat dalam penelitian kami membawa gen blaOXA51-like

▸ Gen blaOXA51-like adalah karbapenemase yang paling sering terdeteksi di antara semua isolat
CRAB klinis (100%) dalam penelitian saat ini, dan juga umum ditemukan di fasilitas perawatan
kesehatan di seluruh dunia

▸ Patogenisitas dan ketahanan A. baumannii terhadap kondisi lingkungan yang tidak

menguntungkan berkorelasi dengan berbagai faktor virulensi, seperti kapasitas untuk
menghasilkan hemolisin, lipase, lesitinase, dan protease, serta kemampuan untuk membentuk
biofilm dan quorum sensing.
DISKUSI
▸ Perilaku pertumbuhan bakteri dalam biofilm mengalami perubahan, sehingga mengurangi
kerentanan mereka terhadap pengobatan antimikroba tertentu

▸ Seiring dengan mekanisme resistensi obat tradisional yang telah diketahui, strategi alternatif
berkontribusi pada ketahanan bakteri dalam biofilm, seperti perembesan obat antimikroba yang
lambat atau sebagian ke dalam biofilm, lingkungan mikro yang unik di dalam biofilm, dan perilaku
pertumbuhan mikroba yang berubah di dalam biofilm. Karena biofilm bersifat multiseluler,
mekanisme ini mengakibatkan resistensi bakteri dan upaya pengobatan yang tidak berhasil

▸ Sekitar 57,56% dari isolat CRAB dalam penelitian ini adalah strain pembentuk biofilm. Menurut
penelitian sebelumnya, bakteri pembentuk biofilm memiliki umur yang jauh lebih panjang
dibandingkan dengan bakteri yang tidak membentuk biofilm (36 berbanding 15 hari, p-value <0,001)

▸ A. baumannii untuk membentuk biofilm meningkatkan kolonisasi dan persistensi, sehingga

memungkinkan tingkat infeksi nosokomial yang lebih tinggi, terutama penyakit yang berhubungan
dengan perangkat
DISKUSI
▸ Gen yang terkait dengan biofilm menawarkan perspektif yang komprehensif tentang adhesi
permukaan dan pengembangan biofilm. Di antara gen-gen ini adalah pgaB dan csuE

▸ Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa pgaB dan csuE hadir di sebagian besar isolat yang serupa
dengan yang dilaporkan oleh Zeighami dkk. yang melaporkan gen-gen ini pada A. baumannii yang
ditemukan dari pasien ICU.

▸ REP-PCR, adalah metode yang mudah, cepat dan murah, dengan daya diskriminasi yang kuat untuk
mengidentifikasi A. baumannii. Hasil REP-PCR dapat dicapai dalam waktu yang cukup singkat. Ini juga
merupakan alasan mengapa prosedur ini lebih murah

▸ Dengan metode typing A. baumannii menggunakan REP-PCR, pola yang diperoleh diklasifikasikan
sebagai kluster REP-PCR yang berbeda memberikan bukti kemungkinan ekspansi klonal di antara
isolat yang berbeda.
KESIMPULAN
▸ Tingginya angka kejadian isolat klinis MDR penghasil biofilm yang ditemukan dalam penelitian ini
cukup memprihatinkan. Meningkatnya prevalensi resistensi karbapenem juga mengkhawatirkan

▸ Temuan kami menyoroti pentingnya gen csuE dan/atau pgaB, gen penyandi karbapenemase dan
munculnya strain yang resisten terhadap obat sebagai faktor risiko potensial yang terkait dengan
isolat klinis A. baumannii penghasil biofilm

▸ Hasil surveilans yang terus memantau profil epidemiologi dan kerentanan antimikroba yang
digunakan untuk melawan penyebaran patogen di lingkungan perawatan kesehatan dapat menjadi
salah satu kebijakan yang membantu mengobati infeksi nosokomial yang disebabkan oleh bakteri
dan membatasi penyebaran strain yang ganas

▸ Hal ini dapat membantu petugas kesehatan dan pembuat kebijakan dalam mengelola seleksi dan
pemindahan sifat ini secara terus menerus di dalam fasilitas perawatan kesehatan, sehingga
meningkatkan kualitas perawatan pasien.
Terima Kasih

24