Metode Resmi AOAC 971,09 Kecernaan Pepsin Protein Pakan Hewan Metode filtrasi/penyaringan

First Action 1971 Final Action 1973

A. Prinsip Bagian Uji lemaknya dicerna 16 jam dengan larutan pepsin hangat dalam pengadukan konstan. Residu tidak tercerna dipisahkan dengan penyaringan, dicuci, dikeringkan, dan ditimbang untuk menentukan kadar residu. residu diuji mikroskopis dan dianalisis kadar proteinnya. metode filtrasi berlaku untuk semua protein hewani. Metode tidak berlaku untukprotein nabati atau pakan protein campuran karena adanya karbohidrat kompleks dan senyawa lain yang tidak dicerna oleh pepsin. B. Alat (a) Agitator.-Lihat Gambar 971,09. kecepatan kontinyu, lambat (15 rpm), end-over-end type, untuk beroperasi di dalam inkubator pada 45 2 C dan berisi 8 oz (250 ml) botol contoh bertutup ulir, atau sejenisnya. Agitator dan botol tersedia dari Terry Sims, 1901 Laurel Rd, Oceanside, CA 92054, Telp: +1-760-722-4119. Jenis agitator Pengadukan atau pengocokan tidak dapat digunakan karena zat padat partikel akan mengumpul pada sisi botol dan tidak kontak dengan larutan pepsin. jika panas dari motor pengaduk meningkatkan suhu inkubator menjadi > 45 C, keluarkan motor dari inkubator dengan lubang pengeboran melalui sisi inkubatordan hubungkan motor ke agitator dengan batang poros dan sambungkan (tersedia dari suplier agitator). (b) Rak Contoh.-Kayu atau logam untuk memegang botol pencernaan pada sudut 45 . Dapat dibuat dari 2 papan dipaku horisontal menjadi bentuk "V" potong vertikal. Juga tersedia dari pemasok pengaduk, (a). (c) Alat Penyaringan. -Modified California Buchner, 962.09C (d) (lihat 4.6.01), tersedia dari Labconco Corp, 8811 Prospect Ave, Kansas City, MO 64.132, No 55100. (Jika tepi screennya kasar, haluskan dengan solder besi berujung kecil) Penggunaan. dengan lengan pengikut, 2 '2 75 (7 cm) od tabung baja stainless, tersedia dari pemasok pengaduk, (a). (d) Kaca serat filter.-7 cm, Whatman, Inc, 934-AH, atau sejenisnya. (e) Moisture dishes.-Al, 78mmod '20 mm, dengan penutup luar dan sisi vertikal. C. Bahan Kimia Larutan Pepsin.-pepsin 0,2% (aktifitas 1:10.000) di 0.075M HCl, jangan menggunakan pepsin NF atau aktifitas pepsin selain 1:10 000. Siapkan sebelum digunakan dengan mengencerkan 6,1 mL HCl 1 L dan dipanaskan

42-45 C. Tambahkan pepsin dan aduk perlahan sampai larut. Jangan panaskan larutan pepsin di hotplate atau pemanasan langsung. D. Preparasi Sampel Saringan sampel, 965,16 (lihat 5.1.01), menggunakan saringan No 20. bagian yang digiling ditahan pada saringan untuk lolos saringan No 20. Gabungkan kedua bagian dan aduk dengan mengaduk dan mengocok di botol 500 ml. Ketelitian pencampuran sangat penting. Karena kandungan lemak tinggi dalam produk hewani, penggilingan tanpa penyaringan dapat menyebabkan lengket di mill, hilangnya kelembaban atau lemak, atau pencampuran contoh yang buruk. E. Ekstraksi Siapkan thimble ekstraksi dari 11 cm kertas Whatman No 2, atau sejenisnya, lalu ikuti langkah berikut: Lipat dua kertas, luruskan kertas dan lipat ladi di sudut kanan lipatan pertama, proses mengubah kertas di atas dan ulangi dengan lipatan 45 untuk lipatan asli, sambil memegang kertas berlipat di satu tangan, tmpatkan tabung reaksi pendek (dengan diameter lebih kecil dari 6-8 mm dari holder ekstraktor sampel atau cup di mana thimble yang akan digunakan) di tengahnya; lipat sepanjang garis lipatan alami untuk membentuk 4-bintang berujung sekitar tabung; dan bungkus dalam arah yang sama sekitar tabung untuk menyelesaikan thimble. Timbang 1.000 g bagian bawah (0.500 g produk samping dariunggas atau bulu yang terhidrolisis karena sifat bergetah dan jumlah residu) menjadi thimble dan ekstrak 1 jam dengan eter dikondensasi bertingkat 3-4 tetes / detik. (Jika menggunakan Soxhlet, bagian atas thimble harus diperpanjang dari tabung siphon untuk menghindari hilangnya partikel padat. Jika kertas mengandung bagian uji pastikan benar-benar tenggelam dalam siphon cup, Bagian uji harus benar-benar dibungkus dalam kertas) Amati ekstraksi eter. untuk menentukan bahwa tidak ada partikel padat yang terbawa ke pelarut. Untuk penetapan kadar lemak kasar, uapkan eter hingga kering dan timbang residu. Keluarkan kertas dari wadah atau cup dan biarkan kering pada suhu kamar. Buka lipatan dan masukkan (dengan kuas) secara kuantitatif bagian bebas lemak sebagian ke dalam botol uji pencernaan, untuk menghindari kontaminasi gunakan kuas bulu atau serat kertas filter. Penggunaan saluran bubuk sangat membantu untuk menghindari loss. F. Pencernaan Pepsin Untuk bagian uji bebas lemak dalam botol pengaduk, tambahkan 150 mL larutan fresh pepsin hangat 42-45 C. pastikan bagian uji sepenuhnya dibasahi oleh larutan pepsin. tutub botol, pasangkan di agitator, dan inkubasi dengan agitasi konstan 16 jam pada 45 C.

G. Perlakuan Residu keringkan tiap lembar fiber glass filter, B (d), 30 menit pada 110 C di dalam moisture dish dengan penutup terbuka. Dinginkan dalam desikator 30 menit tutup, dan timbang (W1). keluarkan botol dari agitator. Simpan di rak sudut 45 dan longgarkan tutupnya. Biarkan residu mengendap selama 15 min. Tempat kertas saring yang sudah ditimbang di California Buchner, B (c), nyalakan hisapan, dan basahi dengan H2O. simpan penahan lengan pada filter dan tekan dengan lembut. Bilas partikel residu pada tutup ke filter dengan sedikit H2O. angkat botol dari rak untuk menyaring pada sudut yang sama seperti sebelumnya dan perlahan-lahan tuangkan isi melalui filter sedikit demi sedikit dan kontinyu, hindari semua agitasi yang tidak perlu. Liquid melewati kertas cepat sebagaimana dituangkan, dengan residu tersebar di permukaan filter tapi tidak meliputi sepenuhnya sampai semua atau hampir semua cairan melewati. Jika laju filtrasi menjadi lambat, hal itu dapat dipercepat dengan menambahkan pencuci aseton sebagaimana dijelaskan di bawah ini, tetapi hanya jika ada jumlah yang signifikan dari campuran pencernaan tetap pada saat corong aseton ditambahkan. (Filtrasi [bagian dari campuran berair melalui ] Filter harus selesai dalam 1 menit dengan kebanyakan protein) Setelah. supernatan telah melewati filter, secara kuantitatif transfer residu ke filter sebagai berikut: Tambahkan 15 mL aseton ke botol. Tahan dengan ibu jari di atas leher botol dan kocok keras. Lepaskan tekanan, lepaskan jempol dari leher botol, dan kocok botol dalam posisi terbalik di atas saringan. lepaskan jempol, biarkan aseton dan residu mengalir ke filter. ulangi bilas dengan kedua 15 mL aseton, kocok dan lepaskan Tekanan seperti di atas. Periksa botol, dan bilas lebih lanjut dengan aseton, menggunakan polismen, jika perlu. Jika > 3 mm cairan tetap di atas kertas ketika mencuci aseton dimulai, mungkin perlu untuk menggunakan 3 kali 15 mL aseton pencuci bukannya 2 untuk meningkatkan tingkat filtrasi. Setelah semua cairan melewati corong, cuci residu di permukaan lengan penahan dengan 2 porsi kecil aseton dari botol cuci atau jarum suntik, dan hisap kering. lepaskan lengan penahan dari corong. Transfer filtrat ke dalam moisture dish. Masukkan (sikat) partikel residu atau filter yang menempel ke lengan penahan atau corong saringan ke dalam moisture dish. Keringkan di oven, ingin, dan berat seperti sebelumnya (W2). Hitung persen dicerna residu = (W2 - W1) '100 / g bagian tes. Tentukan protein dicerna dengan memindahkan saringan yang mengandung residu langsung ke labu Kjeldahl. Lanjutkan seperti pada 954,01 (lihat 2.4.14). (Perhatian: Reaksi yang hebat dapat terjadi ketika NaOH dicampur dengan campuran diencerkan pencernaan, yang disebabkan oleh besar karena bahan organik sejumlah kecil dari residu kelebihan H2SO4 dan tidak ada dari kaca filter. Hindari dengan seksama pencampuran dan pendinginan pencernaan campuran sebelum penambahan NaOH atau dengan menggunakan 20 mL H2SO4 dalam pencernaan Kjeldahl bukannya 25 mL.)

Lakukan penentuan kosong pada 1 lembar kaca filter dan mengurangi dari setiap bagian tes, jika perlu. Hitung persen protein berdasarkan berat uji porsi asli. Hasil mewakili persen dicerna protein di bagian pengujian. Konversikan ke persen protein kasar isi bagian tes tidak dicerna, "protein dicerna" = persen dicerna protein dalam uji '100 / persen minyak mentah bagian Total protein di bagian pengujian.
References: J. Agric. Food Chem. 3, 159(1955). JAOAC 40, 606(1957); 41, 233(1958); 42, 231(1959); 43, 320(1960); 54, 669(1971); 55, 702(1972). Revised: March 1999