Klaster
Tipe Penelitian
Tim Peneliti
drh. Yuda Heru Fibrianto, MP., PhD.
dr. Arief Budiyanto, PhD., SpKK.
dr. Rahadyan, PhD., SpOT, FICS.
UGM/RU/2008/
Kesehatan
Kesehatan
HALAMAN PENGESAHAN
USUL PENELITIAN HIBAH KLASTER
1.
Judul
2.
Peneliti
a. Nama Lengkap
b. NIP
c. Jenis Kelamin
d. Golongan/ Jabatan
Fungsional
e. Strata Pendidikan
f. Fakultas/Jurusan
g. Bidang lmu
h. Alamat Kantor
i. Telepon/Faks
j. E-mail
k. Alamat Rumah
Telepon/Faks
Anggota
a. Peneliti 1
b. Peneliti 2
3.
4.
5.
Menyetujui,
Ketua klaster Kedokteran-Kesehatan,
Menyetujui,
Ketua Lembaga Penelitian
dan Pengabdian kepada Masyarakat UGM
ABSTRAK
A. PENDAHULUAN
1. Latar Belakang (permasalahan dan manfaat)
Banyak penyakit kritis pada manusia tidak dapat diobati dan
disembuhkan oleh tekhnologi kedokteran yang paling baru sekarang ini.
Penyakit ini sering merusak organ manusia yang hasilnya menyebabkan
organ manusia tersebut secara normal tidak dapat berfungsi secara normal.
Para peneliti yakin bahwa stem cell manusia adalah obat yang sangat baik
untuk menyembuhkan penyakit kritis tersebut. Stem sel adalah sumber dari
semua sel di dalam individu, dan ini merupakan sebuah sumber bagi
pengobatan sel. Pengobatan sel sekarang ini merupakan sebuah jalan
revolusi untuk mengatasi penyakit dan kerusakan dengan keuntungan medis
yang luas. Pengobatan stem sel mempunyai potensi penerapan dalam
mengatasi berbagai penyakit dan kelemahan dari otak, organ dalam, tulang
dan banyak jeringan lainnya. Contoh penyakit ini meliputi stroke, alzheimers,
Parkinson, penyakit jantung, osteoporosis, diabetes yang tergantung insulin,
leukimia, luka bakar dan kerusakan sunsum tulang belakang. Baru-baru ini,
penelitian dari stem sel dewasa beserta aplikasinya telah diperbolehkan
dilakukan di Indonesia, dan beberapa sudah dipraktekkan untuk pengobatan
penyakit infark jantung, tetapi penelitiannya masih belum dijalankan dengan
intensif sehingga masih sangat diperlukan untuk penelitian dengan seksama.
2. Keaslian
Penelitian adult stem sel di indonesia pada manusia belum pernah
dilakukan.
3. Tujuan
Membuat tim yang siap dan mumpuni dalam penelitian dan pelayanan
stem sel di UGM serta diperolehnya sel line dari adult stem sel.
B. STUDI PUSTAKA
Stem sel (sel punca) adalah sumber dari semua sel di dalam individu,
dan ini merupakan sebuah sumber bagi pengobatan sel yang sekarang ini
merupakan sebuah jalan revolusi untuk mengatasi penyakit dan kerusakan
dengan keuntungan medis yang luas. Sel punca dapat dikategorikan menjadi
2 macam kategori besar berdasarkan sumbernya yaitu sel punca dewasa
yang berasal dari organisme dewasa dan sel punca embrio, sel punca yang
berasal dari inner sel mass embrio stadium blastula. Sel punca dewasa dan
embrio dapat digunakan untuk pengobatan stem cell (Bongso dkk., 2005). Di
Indonesia telah dimulai penelitian dan pengobatan stem stem dengan
menggunakan adult stem sel (Permenkes, 2009), hal ini dikarenakan adult
stem sel tidak menemui hambatan yang dikarenakan masih adanya
ketidakjelasan tentang etika mengenai embrionik stem sel. Adult stem sel
yang banyak diteliti adalah stem sel mesenkimal dan hematopoietik stem sel.
Adult stem sel mesenkim (MSCs) merupakan wakil dari tipe adult stem sel
yang memberikan variasi sel termasuk osteosit, chondrosit, adiposit dan
bentuk lain dari sel jaringan ikat lain seperti dalam tendon (Beyer dan
Meireles, 2006). Sedangkan hematopoiesis adalah perwakilan dari adult stem
sel yang merupakan pioneer stem sel. Penelitian akhir-akhir ini telah
mengindikasikan bahwa sel mesenkim ini mampu berdifferensiasi menjadi sel
jantung ataupun sel lain yang bukan berasal dari mesodermal seperti sel hati
dan saraf apabila menemukan lingkungan yang cocok untuk pertumbuhannya
(Wagner dkk., 2005; 2006).
Hematopoietic stem cells (HSCs) adalah precursor multipotent yang
mempunyai kapasitas memperbaharui diri sendiri dan berkemampuan untuk
meregenerasi semua tipe sel berbeda yang menyusun sistem pembentuk
darah (Bonnet, 2002; McCulloch and Till, 2005). Transplantasi HSC
membentuk dasar dari pengobatan konsolidasi dalam penanganan kangker
dan digunakan untuk mengobati atau memperbaiki sejumlah gangguan
hematologik dan genetis (Shizuru et al., 2005; Steward and Jarisch, 2005).
Dengan beberapa keberatan (McCormack and Rabbitts, 2004), HSC juga
sebuah target attraktif sel populasi untuk pengobatan gen karena dengan
mudah dapat diperoleh untuk dimodifikasi genetik ex vivo dan memberikan
untuk kemungkinan menopang ekspresi transgene dalam sel darah tepi
sirkulasi sepanjang kehidupan dari sebuah individu (Hawley, 2001; Moayeri et
al., 2005).
Identifikasi dan pengkayaan HSC dapat dilakukan dengan melihat atau
mendeteksi penanda sel permukaan. Semua aktivititas HSC pada sunsum
tulang tikus dewasa terkandung dalam populasi sel yang ditandai dengan
ekspresi dari reseptor c-kit tyrosine kinase (reseptor untuk faktor stem sel,
SCF), antigen-1 stem sel (Sca-1, Ly-6A/E), kadar rendah dari Thy-1.1 antigen
permukaan sel (Thy-1.1 lo), dan tidak ada atau kadar rendah dari ekspresi
dari banyak antigen permukaan sel ditemukan pada sel yang berdiferensiasi
ke berbagai turunan (Shizuru et al., 2005). HSC tikus secara variabel
mengexpresikan sialomucin CD34, tergantung pada stadium perkembangan
dan siklus sel (Ito et al., 2000; Matsuoka et al., 2001; Sato et al., 1999).
Penelitian telah mengidentifikasi sejumlah antigen permukaan sel tambahan
yang menandai HSC tikus, meliputi: keluarga TIE dari reseptor tyrosine
kinase (Arai et al., 2004); endoglin, sebuah reseptor growth faktor penyokong
perubahan (Chen et al., 2002); endomucin, sebuah sialomucin mirip CD34
(Matsubara et al., 2005); CD150, anggota dari keluarga reseptor SLAM (Kiel
et al., 2005; Yilmaz et al., 2006); CD201, reseptor protein C endothel (Balazs
et al., 2006); dan prion protein (Zhang et al., 2006b). reseptor untuk
thrombopoietin (TPO), c-Mpl, juga terekspresi pada 70% c-Kit Lin Sca-1 HSC
(Solar et al., 1998).
Pada manusia, protokol klinis meliputi pengkayaan untuk HSC umumnya
menggunakan ekspresi CD 34 (Civin et al., 1996b; Shizuru et al., 2005),
dimana diekspresikan pada 0,2-3% dari sel inti pada darah tali pusat, sunsum
tulang dan darah tepi yang dikerahkan (Civin et al., 1984; Krause et al., 1996;
Sutherland et al., 1996). Populasi HSC yang diperkaya secara rutin diperoleh
dengan seleksi positif untuk CD34/CD133 dan/atau dengan penipisan turunan
sel, menggunakan monoklonal antibodi penanda yang mengenal penanda
differensiasi dalam konteks dari metode imunomagnetik atau pengenalan sel
yang diaktivasi fluoresen. Strategi lain yang telah digunakan untuk identifikasi
dan HSC diperkaya berdasar pada pola pengecatan pewarna berfluoresen
(Bertoncello et al., 1985; Goodell et al., 1996; Leemhuis et al., 1996; Storms
Widodo, SpKK - FK
HASIL
Telah dilakukan kultur sel fibroblas dari sel kulit sisa sirkumsisi yang digunakan
untuk sel feeder bagi kultur sel punca.
Kultur sel punca dari darah plasenta dan wharton jelly tengah dilakukan. Sel
feeder yang berasal dari kulit sisa sirkumsisi yang telah diberi inform consent
telah dilakukan dan dibudidayakan sehingga terbentuk sel line-nya. Darah
plasenta telah diberi heparin dibawa kelaboratorium dan dilakukan sentrifugasi
200G selama 30 menit sebanyak 2 kali, supernatan dan buffy coat dipipisahkan
ke tabung 50 ml dan disentrifuse 3000 G selama 30 menit. Supernatan dibuang
dan buffy coat yang tertinggal dicuci dengan DMEM + 10 % fetal bovine serum
(FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO 3, 1% minimal essential medium (MEM)
larutan asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic
dan disentrifuse selama 30 menit. Supernatan dibuang dan sisanya dikultur
kedalam feeder sel dengan pertumbuhan/konfluensi 50% kedalam inkubator
5%CO2 pada suhu 38C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara. Setelah 15
menit, cairan dan darah dicuci dan diganti dengan medium baru dan diamati
setiap hari. Pada heri ke 7, telah terbentuk koloni sel astrosit yang diduga adalah
mesenchimal sel. Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari.
Wharton Jelly yang didapat dari tali pusat juga juga ditanam. Setelah dicuci
dengan media DMEM + 10% serum, wharton jelly di triming dan dimasukkan
kedalam kultur disk yang mengandung feeder sel confluensi 50% dan
dimasukkan kedalam inkubator 5%CO2 pada suhu 38C dan kelembamam 5%
CO2 dan 95% udara. Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari.
Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 15 menit dan kemudian dibilas 2
X dengan PBS dan 1 x dengan DMEM. Terlihat sel yang menempel (panah)
Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang
menempel (panah) dan berkembang
Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang
menempel (panah) dan berkembang
Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang
menempel (panah) dan berkembang kearah sel stellat (10x20)
Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang
menempel (panah) dan berkembang kearah sel stellat (10x20)
F. DAFTAR PUSTAKA
Arai, F., Hirao, A., Ohmura, M., Sato, H., Matsuoka, S., Takubo, K., Ito, K.,
Koh, G. Y., and Suda, T. (2004). Tie2/angiopoietin]1 signaling
regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow
niche. Cell 118, 149161.
Balazs, A. B., Fabian, A. J., Esmon, C. T., and Mulligan, R. C. (2006).
Endothelial protein C receptor (CD201) explicitly identifies
hematopoietic stem cells in murine bone marrow. Blood 107, 2317
2321.
Bertoncello, I., and Williams, B. (2004). Hematopoietic stem cell
characterization by Hoechst 33342 and rhodamine 123 staining.
Methods Mol. Biol. 263, 181200.
Bertoncello, I., Bradley, T. R., Hodgson, G. S., and Dunlop, J. M. (1991). The
resolution, enrichment, and organization of normal bone marrow high
proliferative potential colony]forming cell subsets on the basis of
rhodamine-123 fluorescence. Exp. Hematol. 19, 174178.
Bertoncello, I., Hodgson, G. S., and Bradley, T. R. (1985). Multiparameter
analysis of transplantable hemopoietic stem cells. I. The separation
and enrichment of stem cells homing to marrow and spleen on the
basis of rhodamine-123 fluorescence. Exp. Hematol. 13, 9991006.
Bongso A dan Lee EH. Stem cell: Their definition, classification and Sources
dalam stem cell. 2005. World Scientific. 1-13.
Zhang, C. C., Kaba, M., Ge, G., Xie, K., Tong, W., Hug, C., and Lodish, H. F.
(2006a). Angiopoietin-like proteins stimulate ex vivo expansion of
hematopoietic stem cells. Nat. Med. 12, 240245.
Zhang, C. C., Steele, A. D., Lindquist, S., and Lodish, H. F. (2006b). Prion
protein is expressed on long-term repopulating hematopoietic stem
cells and is important for their self-renewal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
103, 21842189.
Zijlmans, J. M., Visser, J. W., Kleiverda, K., Kluin, P. M., Willemze, R., and
Fibbe, W. E. (1995). Modification of rhodamine staining allows
identification of hematopoietic stem cells with preferential short-term
or long-term bone marrow-repopulating ability. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92, 89018905
LAMPIRAN
Seminar Nasional sel Punca
Disampaikan pada seminar sehari ASPI: Penelitian Multisenter Sel Punca di Indonesia, Hotel Acacia,
Jakarta, 30 mei 2009
stem sel (dinamakan pluripoten induksi stem sel atau iPS) melalui transduksi
retrovirus dari kombinasi faktor transkripsi (Maherali dkk., 2007; Takahashi dkk., 2006;
2007). Ini telah diperoleh dengan seleksi untuk memprogram ulang sel dengan
mengaktifkan kembali penanda endogen pluripotensi Oct4 gene atau Nanog atau dengan
mengkloning koloni berdasar pada kriteria morfologinya (Maherali dkk., 2007;
Takahashi dkk., 2006; 2007; Wernig dkk., 2007; Yu dkk., 2007). Sel iPS yang
dihasilkan dari fibroblas tikus dan manusia sangat mirip dengan sel ES secara kriteria
genetik, epigenetik dan perkembangannya. Bagaimanapun, ini tetap jadi ditentukan
apakah sel iPS yang diperoleh dari fibroblas dewasa dapat dipergunakan untuk
memperbaiki fungsi fisiologis dari jaringan sakit in vivo karena masalah asal sel dan
mekanisme induksi dari iPS sel tetap sukar untuk dipahami.
Telah dilaporkan pembentukan sel iPS dari sel hati tikus dewasa dan sel epitel
lambung. Sel iPS hasil buatan ini terlihat sama dengan stem sel yang berasal dari embrio
(embrionik stem sel) dalam penampakan gene dan berkompeten untuk menghasilkan
chimera germ sel. Dengan transduksi retrovirus dengan empat faktor transkripsi, Oct 3/4,
Sox2, Klf4, dan c-Myc, sel fibroblast tikus dewasa telah diprogram ulang ke keadaan
tidak terdifferensiasi yang mirip dengan stem sel embrio (Okita dkk., 2007; Takahashi
dkk., 2006), dan sel ini telah dinamai sel pluripoten induksi (iPS). Sesudah itu, sel iPS
manusia dihasilkan dengan menggunakan dua pasang faktor transkripsi yang berbeda
(Takahashi dkk., 2007; Yu dkk., 2007). Pembentukan sel iPS manusia memberikan
sebuah metode untuk memproduksi sel stem dari pasien untuk dipelajari status
penyakitnya di dalam kultur atau laboratorium (Takahashi dkk., 2007; Park dkk., 2008),
walaupun secara essensial mekanisme dari induksi sel iPS, belum dikpahami secara
menyeluruh. Efisiensi yang rendah dari pembentukan sel iPS dari berbagai penelitian
menyarankan penggunaan asal sel tersebut yang mungkin menyebabkan stem sel tidak
berdifferensiasi secara tetap dan juga integrasi retrovirus kedalam tempat khusus tidak
disyaratkan untuk induksi sel iPS (Yamanaka dkk., 2007), meskipun demikian sel iPS
telah dihasilkan dari penelitian yang dilakukan oleh Aoi dkk. (2008) yang menggunakan
sel epitel.
Dengan menggunakan model tikus untuk penyakit anemia sel, tikus dapat
selamat setelah transplantasi dengan progenitor hematopoietik yang diperoleh secara in
vitro dari iPS autologus. Penyembuhan ini diperoleh setelah koreksi dari allel
hemoglobin manusia sakit dengan target gen khusus. Hasil ini memberikan bukti nyata
dari prinsip dalam penggunaan faktor transkripsi untuk menginduksi pemrograman ulang
yang dikombinasikan dengan gene transfeksi serta sel terapi untuk pengobatan penyakit
pada tikus. Masalah yang timbul sehubungan dengan penggunaan retrovirus dan
onkogene untuk program ulang, membutuhkan penanganan terlebih dahulu sebelum sel
iPS dapat dipertimbangkan untuk pengobatan manusia. Kesembuhan sel sakit anemia
mengindikasikan bahwa memanfaatkan sel autologus turunan iPS untuk tujuan
pengobatan memberikan ikhtisar beberapa janji yang diberikan sebelumnya oleh cloning
terapi: (1) tidak membutuhkan pemakaian obat penekan kekebalan untuk mencegah
penolakan dari sel tranplantasi yang tidak cocok, (2) kesempatan untuk memperbaiki
kelainan genetik dengan rekombinasi homolog, dan (3) kesempatan secara berulang
mendifferensiasi sel iPS kedalam tipe sel yang diinginkan untuk melanjutkan
pengobatan (Hanna dkk., 2007). Walaupun pemrograman ulang dari sel somatik manusia
kedalam sel iPS sekarang telah diperoleh (Takahashi dkk., 2007; Yu dkk., 2007),
aplikasi pengobatan masa depan dari sel iPS pada manusia mendapatkan beberapa
rintangan yang dihadapi: (1) menghindari penggunaan oncogene berbahaya sebagai
bagian dari faktor pemrograman ulang (Okita dkk., 2007), (2) menghindari penggunaan
penghantar gene dari vektor retrovirus yang membawa resiko pemasukan mutagenes,
dan (3) pengembangan yang sehat, kuat dan nyata protokol differensiasi untuk sel iPS
manusia.
Tim kerja sel punca UGM
Pembuatan tim kerja stem sel universitas gadjah mada dengan pusat studi tersendiri
dengan beranggotakan dari seluruh komponen sumber daya manusia yang ada di
universitas dari berbagai bidang ilmu. Program utama adalah mengadakan diskusi dan
sharing ide serta telaah texbook dan analisis jurnal sehingga didapatkan prioritas dalam
penelitian dalam mengidentifikasi, isolasi, multiplikasi dan penerapan stem sel baik sel
punca dewasa maupun iPS sehingga alur penelitian yang ada bisa dilaksanakan secara
konphrehensif dan tepat guna dalam melakukan kegiatan penelitian dan penerapannya
tanpa mengindahkan kaidah bioetika.
Dari beberapa hasil sementara tim kerja SCC-UGM adalah sebagai berikut:
Penasehat :
Tim kerja sel punca dikelompokkan menjadi 3 kelompok kerja seuai dengan
tupoksinya
Pokja litbang
Pokja etikolegal,
Widodo, SpKK - FK
Kartika, SpPD - FK
Program SCC-UGM
Program yang akan dilakukan di stem cell center universitas gadjah mada adalah:
(1) isolasi dan plurifikasi stem sel dewasa yang berasal dari hematopoietik maupun dari
plasenta, (2) mengembangkan iPS dan differensiasi serta aplikasi preklinik maupun
klinis, (3) membuat universal iPS sehingga didapatkan pluripotensi stem sel yang siap
pakai bagi siapa saja yang membutuhkan, (4) membuat hubungan dan korelasi dari
berbagai pusat studi stem sel dari rumah sakit, pusat studi maupun universitas dalam
sharing ilmu dan hasil pengembangan yang sudah didapatkan.
Beberapa tekhnik yang kita kembangkan dan beberapa protokol yang ada di SCC-UGM
adalah sebagai berikut:
Pembuatan feeder sel dari sel fibroblas
Sel feeder adalah sel fibroblas yang diambil dari kulit yang diambil saat
melakukan operasi.
Kulit dibersihkan secara aseptik dan dibiopsi dan secepatnya diproses dalam DPBS (Life technologies).
Setelah dicuci, kulit dicacah dalam dish kultur diikuti pemisahan antar sel dengan
pemberian 0.25% (w/v) trypsin yang mengandung 1 mM EDTA 1 - 2 jam pada
38C.
Sel yang sudah ditripsin dicuci sekali lagi dengan sentrifugasi (300xg, 2 menit)
dan dimasukkan kdalam cawan Petri 100 mm selama 6-8 hari dalam DMEM + 10%
fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential
medium (MEM) asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycinantimycotic pada suhu 38C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara
Pada hari ke 6-8 dilakukan penggantian kultur dan pasase dengan tripsinisasi dan
larutan kultur DMEM, sel yang tidak menempel atau benda ikutan dibersihkan,
sedangkan sel yang menempel dikultur sampai penuh dan dilakukan pasase beberapa
kali.
Sel yang sudah banyak dapat disimpan dalam larutan DMEM yang ditambah
10% DMSO dan 10% serum untuk dibekukan dan dipakai bilamana perlu.
2-3 hari sebelum dilakukan kultur stem sel, dilakukan pengkulturan sel feeder
fibroblas ini
Isolasi, purifikasi dan plurifikasi prekursor sel punca setelah perlakuan GCSF (dilakukan setelah inform consent dan ethical clearence diperoleh)
Pasien di injeksi dngan G-CSF selama 1 minggu selama berturut-turut
Pengambilan darah tepi dengan antikoagulan dengan fosfat buffered saline (PBS)
yang mengandung 0,6% antikoagulan sitrat dekstroseA (ACD-A cat. no. C3821;
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)1:3
35 ml larutan darah tali pusat atau darah tepi 12 ml Ficoll-Paque PLUS (cat. no.
17-1440-02; GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Sentrifuse pada 375g
untuk 30 menit pada suhu ruang . koleksi sel pada antar permukaan, larutkan dengan
PBS mengandung 0.6% ACD-A, dan sentrifus pada 375g 10 min pada suhu ruang.
Beri larutan pelisis eritrosit (0.15MNH4Cl, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH
7.27.4) dan inkubasi 10 menit pada suhu ruang. Sentrifuse pada 375g 10 menit dan
cuci sekali lagi dalam PBS.Darah disentrifugasi 300 x g, 10 menit untuk
memisahkan sel darah putih, serum dan sel darah merah
Sel darah putih yang sudah terpisahkan ditanam ke dalam cawan Petri 100 mm
yang telah mengandung sel feeder selama 6-8 hari dalam DMEM + 10% fetal bovine
serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential medium
(MEM) asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic
pada suhu 38C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara.
Sel yang tidak melekat diambil, sedangkan sel yang menempel dipertahankan
sampai sel berkembang penuh.
Pemindahan sel ke media yang baru dilakukan dengan cara tripsinisasi 0.1% dan
0.02% EDTA dua kali dalam seminggu selama dua bulan dan apabila perbanyakan
sel mencukupi, sel disimpan dalam larutan nitrogen cair pada suhu -196 C dalam
larutan pembeku sel (80% DMEM, 10% DMSO dan 10% FBS).
Uji identifikasi untuk CD34 dan 43 sebagai ciri utama adanya multipotensi
dengan menggunakan RT-PCR.
Dilakukan juga uji dengan pengecatan Hoech untuk mengetahui berapa
prosentase dari masing masing stem sel
Transfeksi cDNA faktor transkripsi dan EGFP gene kedalam sel fibroblast
Plasmid pEGFP-N1 yang mengkode variasi sinar merah dari GFP type liar yang
telah dioptimalisasi untuk berpendar lebih terang dan terekspresi dalam sel mamalia lebih
tinggi dan cDNA faktor transkripsi (OCT 4 dan Nanog) dari Clontech Laboratories, Inc.
(Palo Alto, CA). Sehari sebelum transfeksi sel fibroblast dengan kepekatan penuh (pasase
ke 3-5) ditripsinisasi, dihitung dan ditempatkan kedalam 35 mm kultur dish sampai
dicapai kepekatan 80% pada hari transfeksi. Satu mikroliter cDNA dan Satu mikroliter (1
g) pEGFP-N1 serta 3 l FuGENE-6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) dicampur
dengan 97 l DMEM bebas serum. Setelah 15 menit diinkubasi pada temperature kamar,
101 l larutan campuran medium dan cDNA ditambahkan kedalam 2 ml kultur media.
Sel diinkubasi selama 23 hari dalam sel feeder sampai kepekatan 100% dan dipasase
sekali untuk untuk didapatkan pertautan yang stabil dari gene cDNA dan EGFP kedalam
kromosom sel fibroblast. Untuk meningkatkan laju transfeksi gene kedalam sel, sel yang
sudah tertransfeksi dilanjutkan dengan berbagai perlakuan dengan menggunakan
penghambat siklus sel (puromycine) untuk memperoleh atau ditemukannya laju
transfeksi sel yang paling tinggi (100%).
Penstabilan iPS sel line
Sel feeder disiapkan 6-48 jam sebelum sel hasil induksi diperoleh dan akan
dipasase. Kalau memungkinkan diharapkan akan digunakan sel feeder yang segar dengan
jumlah passase yang minimal. Sel iPS dikultur pada sel feeder dalam medium kultur sel
pada 37C dan 5% CO2. setelah 6 hari dalam kultur diamati pembentukan koloni dibawah
mikroskop. Subkultur dilakukan secara mekanik setiap 5-7 hari dengan memisahkan
koloni sel yang tidak berdifferensiasi kedalam kumpulan sel yang terdiri dari 200-300 sel
menggunakan pipet pasteur yang dibengkokkan dibawah mikroskop inverted. Kelompok
sel yang telah dipisahkan dipasase kedalam disk lapisan feeder sel yang baru dengan
medium yang sama. Setelah mengalami proliferasi yang berkelanjutan sekitar 40 kali
pasase, didapatkan sel line iPS sel. Pada saat awal kultur sel medium ditambahi dengan
faktor inhibisi leukimia (hLIF; Chemicon, Temecula, CA).
Pembekuan dan penanaman kembali sel iPS
Pembekuan
Sel iPS scara mekanik dipisahkan kedalam kelompok 200-300 sel/kelompok.
Lima kelompok sel pada waktu bersamaan dipindahkan kedalam 25 l larutan pembeku 1
(DMSO 10% dan 10% ethilen glycol dalam medium) dan diinkubasi pada 37C dan 5%
CO2 selama 1 menit. Kelompok sel dipindah kedalam 25 l larutan pembeku 2 (DMSO
20%, 20% ethilen glycol dan 0,5 M sukrose dalam medium) dan diinkubasi pada 37C
dan 5% CO2 selama 30 detik. Masukkan kelompok sel kedalam EM-grid (Pelco,
Redding, CA; cat. no. 3 HGC #400) dengan menggunakan pipet kapiler dibawah
mikroskop dan secepatnya dimasukkan kedalam cryovial (Nunc; cat. no. 368632) dan
disimpan pada -196C.
Penanaman kembali (thawing) sel iPS
EM-grid dimasukkan kedalam 25 l larutan thawing 1 (0,2 M sukrose dalam
kultur media iPS) dan diinkubasi pada 37C dan 5% CO 2 selama 1 menit, dilanjutkan
pemindahan kelompok sel kedalam 25 l larutan thawing 2 (0,1 M sukrose dalam kultur
media iPS) dan diinkubasi pada 37C dan 5% CO 2 selama 5 menit dan kelompok sel
dicuci dalam 25 l medium kultur dan diinkubasi pada 37C dan 5% CO2 selama 10
menit dan sel dimasukkan kedalam lapisan feeder sel yang baru. Lebih dari 10 kelompok
sel dimasukkan kedalam lapisan feeder yang baru dan dikultur secara bersamaan. Dish
ditempatkan pada 37C dan 5% CO2 dan tidak diganggu selama 48 jam.
Ekspressi penanda permukaan sel
Koloni sel iPS (8-10 koloni) ditumbuhkan dalam dish 4 sumuran dengan 500 l
larutan. Pada saat analisa, kultur media iPS diambil dan sel dicuci dengan 1XDPBS yang
mengandung 0,9 mM Ca2+ (CaCl2) dan 0,5 mM Mg2+ (MgCl2) (Life Technologi; cat.
no. 14080055). Koloni difixe-kan dengan 500 l 4% paraformaldehid (Sigma; cat. no. P6148) selama 30 menit dan selanjutnya dicuci 3 kali untuk 3 manit dalam 500 l larutan
1XDPBS dengan Ca2+ dan Mg2+. Aktivitas peroksidase endogen dipadamkan dengan
inkubasi fixed koloni dengan 500 l larutan 0,3% H2O2 selama 30 menit pada 26C.
Koloni dicuci dengan DPBS selama 5 menit. Kit Vectastain ABC (Vector, Burlingame,
CA; cat. no. PK-6103) digunakan untuk mengecat penanda permukaan sel dengan cara
protokol perusahaan. Kit terdiri dari Bloking serum, Biotinil antibodi dan reagen
vecstain ABC. Antibodi primer dilarutkan dengan menggunakan Bloking serum sesuai
kebutuhan: SSEA-1 (pengencran 1:1000); SSEA-3; SSEA-4 (cat. no. MC-813-70); TRA1-60 (1:1000 Dilution; Chemicon; cat. no. MAB4360); TRA-1-80 (pengenceran 1:1000
dilution; Chemicon; cat. no. MAB4381); dan Oct-4 (pengenceran 1:1000 dilution; Santa
Cruz Biotechnology, Sata Cruz, CA; cat. no. SC-5279).
DAFTAR PUSTAKA
Aoi T., Yae K., Nakagawa M., Ichisaka T, Okita K, Takahashi K., Chiba T., Yamanaka
S., 2008. Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and
Stomach Cells. Science 321(5889):699-702
Bongso A dan Lee EH. Stem cell: Their definition, classification and Sources dalam stem
cell. 2005. World Scientific. Pp. 1-13.
Burley J. 2005. Stem Cells and Translational Medicine Ethics, Law, and Policy in Stem
cells : from bench to bedside World Scientific Publishing Co. Pp. 186-211
Hanna J., Wernig M, Markoulaki S., Sun CW., Meissner A., Cassady JP., Beard C.,
Brambrink T., Wu LC., Townes TM., Jaenisch R., 2007. Treatment of Sickle Cell
Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from Autologous Skin. Science
318(5858):1920-3
Hochedlinger K. and Jaenisch R., 2006. Nuclear reprogramming and pluripotency.
Nature 441(7097):1061-7
Maherali N, Sridharan R, Xie W, Utikal J, Eminli S, Arnold K, Stadtfeld M, Yachechko
R, Tchieu J, Jaenisch R, Plath K, Hochedlinger K. 2007. Directly reprogrammed
fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.
Cell Stem Cell 1(1):55-70
Okita K., Nakagawa M., Hyenjong H., Ichisaka T., Yamanaka S., 2008. Generation of
Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science
322(5903):949-53
Okita K., Ichisaka T, and Yamanaka S. 2007. Generation of germline-competent induced
pluripotent stem cells. Nature 448(7151):313-7
Park IH., Zhao R, West JA, Yabuuchi A, Huo H, Ince TA, Lerou PH, Lensch MW. and
Daley GQ. 2008. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with
defined factors. Nature 451(7175):141-6
Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, Trounson A dan Bongso A. Embrionic stem cell lines
from human blastocyst: Somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 2000;
18(4):399-404.
Takahashi K., Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S.
2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined
factors. Cell 131(5):861-72.
Takahashi K., and Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse
embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126(4):663-76
Thomson JA, Itskovits-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshal VS, dan
Jones JM. Embrionic stem cell lines derived from human blastocyst. Science
1998; 282:1145-1147.
Trounson A dan Pera M. Human embrionic stem cell. Fertil. Steril. 2001; 76(4):660-661.
Trounson A. 2001. The derivation and potential use of human embrionic stem cell lines.
Reprod. Fertil. Dev. 13:523-532.
Wagner W, Feldman RE,Jr., Seckinger A, Maurer MH, Wein F, Blake J, Krause U,
Kalenka A, Burgers HF, Saffrich R, Wuchter P, Kuschinsky W, and Ho AD.
2006. The heterogenecity of human mesenchymal stem cell preparations Evidence
from simultaneous analysis of proteomesand transcriptomes. Exp Hematol
34:536-548.
Wagner W, Wein F, Seckinger A, Frank-hauser M, Wirkner U, Krause U, Blake J,
Schwager C, Eckstein V, Ansorge W, and Ho AD. 2005. Comparative
Pasal 2
PELAKSANAAN KEGIATAN
(1) Pelaksanaan dari Nota Kesepakatan Kerjasama ini akan dilaksanakan
berdasarkan suatu Perjanjian tersendiri yang disepakati oleh PARA PIHAK
dengan tetap mendasarkan pada Nota Kesepakatan Kerjasama ini serta
disesuaikan dengan sumber daya yang dimiliki oleh PARA PIHAK.
(2) Pelaksanaan Perjanjian sebagaimana dimaksud pada ayat (1) diatas,
PARA PIHAK sepakat untuk menunjuk wakil dari PARA PIHAK.
(3) Perjanjian yang dimaksud pada ayat (1) diatas merupakan bagian yang
tidak terpisahkan dari Nota Kesepakatan Kerjasama ini.
Pasal 3
PEMBIAYAAN
PIHAK PERTAMA
PT BIO FARMA (PERSERO)
Drs. Iskandar, MM
Direktur Utama
PIHAK KEDUA
UNIVERSITAS GADJAH MADA