Anda di halaman 1dari 29

Nomer ID

Klaster
Tipe Penelitian

LAPORAN AKHIR HASIL PENELITIAN


RISET UNGGULAN KLASTER
TAHUN ANGGARAN 2009

Pembentukan tim sel punca Universitas


Gadjah Mada dan Isolasi, purifikasi, dan
plurifikasi progenitor adult stem sel

Tim Peneliti
drh. Yuda Heru Fibrianto, MP., PhD.
dr. Arief Budiyanto, PhD., SpKK.
dr. Rahadyan, PhD., SpOT, FICS.

KLASTER KEDOKTERAN - KESEHATAN


UNIVERSITAS GADJAH MADA
2009

UGM/RU/2008/
Kesehatan
Kesehatan

HALAMAN PENGESAHAN
USUL PENELITIAN HIBAH KLASTER

1.

Judul

2.

Peneliti
a. Nama Lengkap
b. NIP
c. Jenis Kelamin
d. Golongan/ Jabatan
Fungsional
e. Strata Pendidikan
f. Fakultas/Jurusan
g. Bidang lmu
h. Alamat Kantor
i. Telepon/Faks
j. E-mail
k. Alamat Rumah
Telepon/Faks
Anggota
a. Peneliti 1
b. Peneliti 2

3.

4.
5.

Jangka Waktu Penelitian


Pembiayaan

: Pembentukan tim stem sel Universitas Gadjah Mada dan


Isolasi, purifikasi, dan plurifikasi progenitor adult stem sel
: drh. Yuda Heru Fibrianto, MP., PhD.
: 132139520
: Laki-laki
: III c / Lektor Kepala
: S3
: Kedokteran Hewan
: Fisiologi
: Jl. Fauna 2 Karangmalang Yogyakarta
: 0274 560864 / 0274 560861
: fibrianto1802@gmail.com
: Kebondalem I No. 1 Magelang Jawatengah
: 0293364723
: dr. Arief Budiyanto, PhD., SpKK
: dr. Rahadyan Magetsari, PhD., SpOT., FICS
: 7 bulan
Rp 150.000.000,00 (seratus limapuluh juta rupiah)

Menyetujui,
Ketua klaster Kedokteran-Kesehatan,

Prof. dr. Suparyati Soenarto, PhD., SpA(K)


NIP. 194402051974122001

Yogyakarta, 20 Maret 2009


Ketua Peneliti,

drh. Yuda Heru Fibrianto, MP., PhD.


NIP. 196902181995121001

Menyetujui,
Ketua Lembaga Penelitian
dan Pengabdian kepada Masyarakat UGM

Prof.Dr-Tech.Ir. Danang Parikesit, MSc.


NIP. 196506031990031002

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan tim sel punca Universitas


Gadjah Mada dan tekhnik isolasi dan plurifikasi adult stem sel untuk
mendapatkan sel linenya. Tim ini terdiri dari gabungan staf peneliti dari fakultas
kedokteran hewan, kedokteran, farmasi, biologi dan peternakan. Tim sel punca
UGM ini dikelompokkan menjadi tiga kelompok kerja dari litbang, etika dan klinis
sesuai dengan keahliannya. Adult stem sel diambil dari darah plasenta yang
telah dimintakan inform consent dan etikal clearance dari pasien yang
melahirkan. Tim sel punca Fakultas Kedokteran telah terbentuk dengan ketua
Prof. Samekto sedangkan unit pelayanan sel punca RS. Dr. Sardjito juga telah
terbentuk dengan ketua Dr. Hasto Wardoyo, SpOG (K). Kultur sel punca dari
darah plasenta dan wharton jelly tengah dilakukan. Sel feeder yang berasal dari
kulit sisa sirkumsisi yang telah diberi inform consent telah dilakukan dan
dibudidayakan sehingga terbentuk sel line-nya. Darah plasenta telah diberi
heparin dibawa kelaboratorium dan dilakukan sentrifugasi 200G selama 30 menit
sebanyak 2 kali, supernatan dan buffy coat dipipisahkan ke tabung 50 ml dan
disentrifuse 3000 G selama 30 menit. Supernatan dibuang dan buffy coat yang
tertinggal dicuci dengan DMEM + 10 % fetal bovine serum (FBS), 1 mM
glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential medium (MEM) larutan asam
amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic dan
disentrifuse selama 30 menit. Supernatan dibuang dan sisanya dikultur kedalam
feeder sel dengan pertumbuhan/konfluensi 50% kedalam inkubator 5%CO2 pada
suhu 38C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara. Setelah 15 menit, cairan
dan darah dicuci dan diganti dengan medium baru dan diamati setiap hari. Pada
heri ke 7, telah terbentuk koloni sel astrosit yang diduga adalah mesenchimal sel.
Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari. Data hasil penelitian
ditampilkan secara deskriptif
Wharton Jelly yang didapat dari tali pusat juga juga ditanam. Setelah
dicuci dengan media DMEM + 10% serum, wharton jelly di triming dan
dimasukkan kedalam kultur disk yang mengandung feeder sel confluensi 50%
dan dimasukkan kedalam inkubator 5%CO2 pada suhu 38C dan kelembamam
5% CO2 dan 95% udara. Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari.
Pada hari ini juga telah telihat pertumbuhan sel astrosit yang diduga sel
mesenchimal. Hasil dilaporkan secara deskriptif.

A. PENDAHULUAN
1. Latar Belakang (permasalahan dan manfaat)
Banyak penyakit kritis pada manusia tidak dapat diobati dan
disembuhkan oleh tekhnologi kedokteran yang paling baru sekarang ini.
Penyakit ini sering merusak organ manusia yang hasilnya menyebabkan
organ manusia tersebut secara normal tidak dapat berfungsi secara normal.
Para peneliti yakin bahwa stem cell manusia adalah obat yang sangat baik
untuk menyembuhkan penyakit kritis tersebut. Stem sel adalah sumber dari
semua sel di dalam individu, dan ini merupakan sebuah sumber bagi
pengobatan sel. Pengobatan sel sekarang ini merupakan sebuah jalan
revolusi untuk mengatasi penyakit dan kerusakan dengan keuntungan medis
yang luas. Pengobatan stem sel mempunyai potensi penerapan dalam
mengatasi berbagai penyakit dan kelemahan dari otak, organ dalam, tulang
dan banyak jeringan lainnya. Contoh penyakit ini meliputi stroke, alzheimers,
Parkinson, penyakit jantung, osteoporosis, diabetes yang tergantung insulin,
leukimia, luka bakar dan kerusakan sunsum tulang belakang. Baru-baru ini,
penelitian dari stem sel dewasa beserta aplikasinya telah diperbolehkan
dilakukan di Indonesia, dan beberapa sudah dipraktekkan untuk pengobatan
penyakit infark jantung, tetapi penelitiannya masih belum dijalankan dengan
intensif sehingga masih sangat diperlukan untuk penelitian dengan seksama.
2. Keaslian
Penelitian adult stem sel di indonesia pada manusia belum pernah
dilakukan.
3. Tujuan
Membuat tim yang siap dan mumpuni dalam penelitian dan pelayanan
stem sel di UGM serta diperolehnya sel line dari adult stem sel.
B. STUDI PUSTAKA
Stem sel (sel punca) adalah sumber dari semua sel di dalam individu,
dan ini merupakan sebuah sumber bagi pengobatan sel yang sekarang ini
merupakan sebuah jalan revolusi untuk mengatasi penyakit dan kerusakan
dengan keuntungan medis yang luas. Sel punca dapat dikategorikan menjadi
2 macam kategori besar berdasarkan sumbernya yaitu sel punca dewasa
yang berasal dari organisme dewasa dan sel punca embrio, sel punca yang
berasal dari inner sel mass embrio stadium blastula. Sel punca dewasa dan
embrio dapat digunakan untuk pengobatan stem cell (Bongso dkk., 2005). Di
Indonesia telah dimulai penelitian dan pengobatan stem stem dengan
menggunakan adult stem sel (Permenkes, 2009), hal ini dikarenakan adult
stem sel tidak menemui hambatan yang dikarenakan masih adanya
ketidakjelasan tentang etika mengenai embrionik stem sel. Adult stem sel
yang banyak diteliti adalah stem sel mesenkimal dan hematopoietik stem sel.
Adult stem sel mesenkim (MSCs) merupakan wakil dari tipe adult stem sel
yang memberikan variasi sel termasuk osteosit, chondrosit, adiposit dan
bentuk lain dari sel jaringan ikat lain seperti dalam tendon (Beyer dan
Meireles, 2006). Sedangkan hematopoiesis adalah perwakilan dari adult stem

sel yang merupakan pioneer stem sel. Penelitian akhir-akhir ini telah
mengindikasikan bahwa sel mesenkim ini mampu berdifferensiasi menjadi sel
jantung ataupun sel lain yang bukan berasal dari mesodermal seperti sel hati
dan saraf apabila menemukan lingkungan yang cocok untuk pertumbuhannya
(Wagner dkk., 2005; 2006).
Hematopoietic stem cells (HSCs) adalah precursor multipotent yang
mempunyai kapasitas memperbaharui diri sendiri dan berkemampuan untuk
meregenerasi semua tipe sel berbeda yang menyusun sistem pembentuk
darah (Bonnet, 2002; McCulloch and Till, 2005). Transplantasi HSC
membentuk dasar dari pengobatan konsolidasi dalam penanganan kangker
dan digunakan untuk mengobati atau memperbaiki sejumlah gangguan
hematologik dan genetis (Shizuru et al., 2005; Steward and Jarisch, 2005).
Dengan beberapa keberatan (McCormack and Rabbitts, 2004), HSC juga
sebuah target attraktif sel populasi untuk pengobatan gen karena dengan
mudah dapat diperoleh untuk dimodifikasi genetik ex vivo dan memberikan
untuk kemungkinan menopang ekspresi transgene dalam sel darah tepi
sirkulasi sepanjang kehidupan dari sebuah individu (Hawley, 2001; Moayeri et
al., 2005).
Identifikasi dan pengkayaan HSC dapat dilakukan dengan melihat atau
mendeteksi penanda sel permukaan. Semua aktivititas HSC pada sunsum
tulang tikus dewasa terkandung dalam populasi sel yang ditandai dengan
ekspresi dari reseptor c-kit tyrosine kinase (reseptor untuk faktor stem sel,
SCF), antigen-1 stem sel (Sca-1, Ly-6A/E), kadar rendah dari Thy-1.1 antigen
permukaan sel (Thy-1.1 lo), dan tidak ada atau kadar rendah dari ekspresi
dari banyak antigen permukaan sel ditemukan pada sel yang berdiferensiasi
ke berbagai turunan (Shizuru et al., 2005). HSC tikus secara variabel
mengexpresikan sialomucin CD34, tergantung pada stadium perkembangan
dan siklus sel (Ito et al., 2000; Matsuoka et al., 2001; Sato et al., 1999).
Penelitian telah mengidentifikasi sejumlah antigen permukaan sel tambahan
yang menandai HSC tikus, meliputi: keluarga TIE dari reseptor tyrosine
kinase (Arai et al., 2004); endoglin, sebuah reseptor growth faktor penyokong
perubahan (Chen et al., 2002); endomucin, sebuah sialomucin mirip CD34
(Matsubara et al., 2005); CD150, anggota dari keluarga reseptor SLAM (Kiel
et al., 2005; Yilmaz et al., 2006); CD201, reseptor protein C endothel (Balazs
et al., 2006); dan prion protein (Zhang et al., 2006b). reseptor untuk
thrombopoietin (TPO), c-Mpl, juga terekspresi pada 70% c-Kit Lin Sca-1 HSC
(Solar et al., 1998).
Pada manusia, protokol klinis meliputi pengkayaan untuk HSC umumnya
menggunakan ekspresi CD 34 (Civin et al., 1996b; Shizuru et al., 2005),
dimana diekspresikan pada 0,2-3% dari sel inti pada darah tali pusat, sunsum
tulang dan darah tepi yang dikerahkan (Civin et al., 1984; Krause et al., 1996;
Sutherland et al., 1996). Populasi HSC yang diperkaya secara rutin diperoleh
dengan seleksi positif untuk CD34/CD133 dan/atau dengan penipisan turunan
sel, menggunakan monoklonal antibodi penanda yang mengenal penanda
differensiasi dalam konteks dari metode imunomagnetik atau pengenalan sel
yang diaktivasi fluoresen. Strategi lain yang telah digunakan untuk identifikasi
dan HSC diperkaya berdasar pada pola pengecatan pewarna berfluoresen
(Bertoncello et al., 1985; Goodell et al., 1996; Leemhuis et al., 1996; Storms

et al., 1999), Rhodamine 123 (yang lebih teristimewa akumulasi pada


mitochondria aktif) dan Hoechst 33342 (bis-benzimidazole yang berikatan ke
bagian lengkung kecil adenine-thymine DNA) adalah dua pewarna vital
fluoressen yang telah secara rutin digunakan untuk menandai populasi
precursor hematopoietic (Bertoncello et al., 1985; Leemhuis et al., 1996).
Pengecatan rhodamine 123 dari sel sunsum tulang tikus memprlihatkan
bahwa HSC dengan potensi terpopulasi waktu panjang tercat secara suram
sedangkan prekursor hematopoietic yang terpopulasi waktu pendek akan
tercat lebih terang (Bertoncello et al., 1991; Spangrude and Johnson, 1990;
Zijlmans et al., 1995). Sedangkan sel sunsum tulang tikus yang diperkaya
untuk repopulasi waktu lama tercat paling lmah dari kdua cat yang ada
(Bertoncello and Williams, 2004; Leemhuis et al., 1996). Penurunan kadar
warna dengan cat ini umumnya merefleksikan sebuah keadaan metabolik dan
mitotik yang tidak aktif (Spangrude and Johnson, 1990).

C. METODE PENELITIAN (sesuai dengan keperluan)


Membuat tim kerja sel punca UGM
Pembuatan tim kerja stem sel universitas gadjah Mada dengan mengadakan
diskusi dan sharing ide dan telaah texbook dan analisis jurnal sehingga
didapatkan prioritas dalam penelitian dan penerapan stem sel
Penasehat :

Prof. Dr. Retno S. Soedibyo, MSc., Apt


Tim kerja sel punca dikelompokkan menjadi 3 kelompok kerja seuai
dengan tupoksinya
Pokja litbang

Yuda heru fibrianto, PhD. Koordinator - FKH

Eggi arguni PhD. FK

Rina Susilowati, PhD. - FK

Riris istighfari jenie, MSi, Apt. - Farmasi

Sigit Bintoro, MSc. - Fapet

Aris purwantoro, MSi - FKH

Mona airin, MSi FKH

Ronny Martien, DR. Rer. Nat., MSi - farmasi


Pokja etikolegal,

Prof. Dr. Soenarto S., SpTHT - FK

Prof. Dr. Yati Soenarto., SpPA - FK


Pokja aplikasi klinis

Arief Budiyanto, PhD., SpKK - FK

Widodo, SpKK - FK

Sunardi Radiono, SpKK - FK


Rahadyan, PhD., SpOT, FICS - FK
Krisdanarti, SpPD, SpJP - FK
Johan Kurnianda, SpPD, SpHO - FK
Kartika, SpPD - FK
Samekto Wibowo, Prof. DR. SpSS - FK
Yudha Patria, PhD. SpA FK
Setyo Budhi, drh. MP. - FKH
Sudarminto, drh., MSi - FKH

Pembuatan feeder sel dari sel fibroblas


Sel feeder adalah sel fibroblas yang diambil dari kulit yang diambil saat
melakukan oprasi.
Kulit dibersihkan secara aseptik dan dibiopsi dan secepatnya diproses
dalam D-PBS (Life technologies).
Setelah dicuci, kulit dicacah dalam dish kultur diikuti pemisahan antar sel
dengan pemberian 0.25% (w/v) trypsin yang mengandung 1 mM EDTA 1 - 2
jam pada 38C.
Sel yang sudah ditripsin dicuci sekali lagi dengan sentrifugasi (300xg, 2
menit) dan dimasukkan kdalam cawan Petri 100 mm selama 6-8 hari dalam
DMEM + 10% fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3,
1% minimal essential medium (MEM) asam amino nonessential, 1% larutan
penicillin-streptomycin-antimycotic pada suhu 38C dan kelembamam 5%
CO2 dan 95% udara
Pada hari ke 6-8 dilakukan penggantian kultur dan pasase dengan
tripsinisasi dan larutan kultur DMEM, sel yang tidak menempel atau benda
ikutan dibersihkan, sedangkan sel yang menempel dikultur sampai penuh
dan dilakukan pasase beberapa kali.
Sel yang sudah banyak dapat disimpan dalam larutan DMEM yang
ditambah 10% DMSO dan 10% serum untuk dibekukan dan dipakai
bilamana perlu.
2-3 hari sebelum dilakukan kultur stem sel, dilakukan pengkulturan sel
feeder fibroblas ini
Isolasi, purifikasi dan plurifikasi prekursor sel punca setelah perlakuan
G-CSF (dilakukan setelah inform consent dan ethical clearence
diperoleh)
Pasien di injeksi dngan G-CSF selama 1 minggu selama berturut-turut
Pengambilan darah tepi dengan antikoagulan dengan fosfat buffered
saline (PBS) yang mengandung 0,6% antikoagulan sitrat dekstroseA (ACD-A
cat. no. C3821; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)1:3
35 ml larutan darah tali pusat atau darah tepi 12 ml Ficoll-Paque PLUS

(cat. no. 17-1440-02; GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).


Sentrifuse pada 375g untuk 30 menit pada suhu ruang . koleksi sel pada
antar permukaan, larutkan dengan PBS mengandung 0.6% ACD-A, dan
sentrifus pada 375g 10 min pada suhu ruang. Beri larutan pelisis eritrosit
(0.15MNH4Cl, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7.27.4) dan inkubasi 10
menit pada suhu ruang. Sentrifuse pada 375g 10 menit dan cuci sekali lagi
dalam PBS.Darah disentrifugasi 300 x g, 10 menit untuk memisahkan sel
darah putih, serum dan sel darah merah
Sel darah putih yang sudah terpisahkan ditanam ke dalam cawan Petri
100 mm yang telah mengandung sel feeder selama 6-8 hari dalam DMEM +
10% fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1%
minimal essential medium (MEM) asam amino nonessential, 1% larutan
penicillin-streptomycin-antimycotic pada suhu 38C dan kelembamam 5%
CO2 dan 95% udara.
Sel yang tidak melekat diambil, sedangkan sel yang menempel
dipertahankan sampai sel berkembang penuh.
Pemindahan sel ke media yang baru dilakukan dengan cara tripsinisasi
0.1% dan 0.02% EDTA dua kali dalam seminggu selama dua bulan dan
apabila perbanyakan sel mencukupi, sel disimpan dalam larutan nitrogen cair
pada suhu -196 C dalam larutan pembeku sel (80% DMEM, 10% DMSO
dan 10% FBS).
Uji identifikasi untuk CD34 dan 43 sebagai ciri utama adanya multipotensi
dengan menggunakan RT-PCR.
Dilakukan juga uji dengan pengecatan Hoech untuk mengetahui berapa
prosentase dari masing masing stem sel
Pada tahun ini diharapkan didapatkan sel line untuk bekal penelitian selanjutnya
untuk pengembangan ke arah sel yang diinginkan dan akan ditransplantasikan
ke klinisnya.

HASIL
Telah dilakukan kultur sel fibroblas dari sel kulit sisa sirkumsisi yang digunakan
untuk sel feeder bagi kultur sel punca.
Kultur sel punca dari darah plasenta dan wharton jelly tengah dilakukan. Sel
feeder yang berasal dari kulit sisa sirkumsisi yang telah diberi inform consent
telah dilakukan dan dibudidayakan sehingga terbentuk sel line-nya. Darah
plasenta telah diberi heparin dibawa kelaboratorium dan dilakukan sentrifugasi
200G selama 30 menit sebanyak 2 kali, supernatan dan buffy coat dipipisahkan
ke tabung 50 ml dan disentrifuse 3000 G selama 30 menit. Supernatan dibuang
dan buffy coat yang tertinggal dicuci dengan DMEM + 10 % fetal bovine serum
(FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO 3, 1% minimal essential medium (MEM)
larutan asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic
dan disentrifuse selama 30 menit. Supernatan dibuang dan sisanya dikultur
kedalam feeder sel dengan pertumbuhan/konfluensi 50% kedalam inkubator
5%CO2 pada suhu 38C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara. Setelah 15
menit, cairan dan darah dicuci dan diganti dengan medium baru dan diamati
setiap hari. Pada heri ke 7, telah terbentuk koloni sel astrosit yang diduga adalah
mesenchimal sel. Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari.
Wharton Jelly yang didapat dari tali pusat juga juga ditanam. Setelah dicuci
dengan media DMEM + 10% serum, wharton jelly di triming dan dimasukkan
kedalam kultur disk yang mengandung feeder sel confluensi 50% dan
dimasukkan kedalam inkubator 5%CO2 pada suhu 38C dan kelembamam 5%
CO2 dan 95% udara. Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari.

Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 15 menit dan kemudian dibilas 2
X dengan PBS dan 1 x dengan DMEM. Terlihat sel yang menempel (panah)

Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang
menempel (panah) dan berkembang

Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang
menempel (panah) dan berkembang

Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang
menempel (panah) dan berkembang kearah sel stellat (10x20)

Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang
menempel (panah) dan berkembang kearah sel stellat (10x20)

Gambar. Pengkulturan wharton jelly (panah putih) hari 1, 3 dan 5 setelah


passase hari ke 21. Tampak adanya pertumbuhan sel punca dan
pengelompokan sel punca (tanda panah) tersebut
Hasil lain dari program ini adalah telah dilakukan seminar pada seminar
nasional di Jakarta pada tanggal 30 mei 2009 di Hotel Acasia Jakarta dengan
judul Pusat Sel Punca Universitas Gadjah Mada dan Programnya (leaflet dan
makalah terlampir)
Hasil yang lain adalah dilakukan peningkatan jejaring kinerja dengan swasta
(saat ini telah dilakukan pendekatan untuk penandatanganan pembaharuan
MOU dengan PT. Biofarma dan UGM yang telah kadaluwarsa di tahun 2008)
dalam kerjasama penelitian sel punca.

F. DAFTAR PUSTAKA
Arai, F., Hirao, A., Ohmura, M., Sato, H., Matsuoka, S., Takubo, K., Ito, K.,
Koh, G. Y., and Suda, T. (2004). Tie2/angiopoietin]1 signaling
regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow
niche. Cell 118, 149161.
Balazs, A. B., Fabian, A. J., Esmon, C. T., and Mulligan, R. C. (2006).
Endothelial protein C receptor (CD201) explicitly identifies
hematopoietic stem cells in murine bone marrow. Blood 107, 2317
2321.
Bertoncello, I., and Williams, B. (2004). Hematopoietic stem cell
characterization by Hoechst 33342 and rhodamine 123 staining.
Methods Mol. Biol. 263, 181200.
Bertoncello, I., Bradley, T. R., Hodgson, G. S., and Dunlop, J. M. (1991). The
resolution, enrichment, and organization of normal bone marrow high
proliferative potential colony]forming cell subsets on the basis of
rhodamine-123 fluorescence. Exp. Hematol. 19, 174178.
Bertoncello, I., Hodgson, G. S., and Bradley, T. R. (1985). Multiparameter
analysis of transplantable hemopoietic stem cells. I. The separation
and enrichment of stem cells homing to marrow and spleen on the
basis of rhodamine-123 fluorescence. Exp. Hematol. 13, 9991006.
Bongso A dan Lee EH. Stem cell: Their definition, classification and Sources
dalam stem cell. 2005. World Scientific. 1-13.

Bonnet, D. (2002). Haematopoietic stem cells. J. Pathol. 197, 430440.


Chen, C. Z., Li, M., de Graaf, D., Monti, S., Gottgens, B., Sanchez, M. J.,
Lander, E. S., Golub, T. R., Green, A. R., and Lodish, H. F. (2002).
Identification of endoglin as a functional marker that defines long-term
repopulating hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,
1546815473.
Civin, C. I., Trischmann, T., Kadan, N. S., Davis, J., Noga, S., Cohen, K.,
Duffy, B., Groenewegen, I., Wiley, J., Law, P., Hardwich, A., Oldham,
F., and Gee, A. (1996). Highly purified CD34-positive cells reconstitute
hematopoiesis. J. Clin. Oncol. 14, 22242233.
Civin, C., Strauss, L. C., Brovall, C., Fackler, M. J., Schwartz, J. F., and
Shaper, J. H. (1984). Antigenic analysis of haematopoiesis. III. A
haematopoietic progenitor cell surface antigen defined by a
monoclonal antibody raised against KG1a cells. J. Immunol. 133,
157165.
Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., and Mulligan, R. C.
(1996). Isolation and functional properties of murine hematopoietic
stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 17971806.
Hawley, R. G. (2001). Progress toward vector design for hematopoietic stem
cell gene therapy. Curr. Gene Ther. 1, 117.
Ito, T., Tajima, F., and Ogawa, M. (2000). Developmental changes of CD34
expression by murine hematopoietic stem cells. Exp. Hematol. 28,
12691273.
Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., and
Morrison, S. J. (2005). SLAM family receptors distinguish
hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches
for stem cells. Cell 121, 11091121.
Kogler G, Sensken S, Airey JA, Trapp T, Muschen M, Feldhahn N, Liedtke S,
Sorg RV, Fischer J, Rosenbaum C. (2004). A new human somatic
stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent
differentiation potential. J Exp Med 200:123-135.
Krause, D. S., Fackler, M. J., Civin, C. I., and May, W. S. (1996). CD34:
Structure, biology, and clinical utility. Blood 87, 113.
Leemhuis, T., Yoder, M. C., Grigsby, S., Aguero, B., Eder, P., and Srour, E. F.
(1996). Isolation of primitive human bone marrow hematopoietic
progenitor cells using Hoechst 33342 and rhodamine 123. Exp.
Hematol. 24, 12151224.
Matsubara, A., Iwama, A., Yamazaki, S., Furuta, C., Hirasawa, R., Morita, Y.,
Osawa, M., Motohashi, T., Eto, K., Ema, H., Kitamura, T., Vestweber,
D., and Nakauchi, H. (2005). Endomucin, a CD34-like sialomucin,
marks hematopoietic stem cells throughout development. J. Exp. Med.
202, 14831492.
Matsuoka, S., Ebihara, Y., Xu, M., Ishii, T., Sugiyama, D., Yoshino, H., Ueda,
T., Manabe, A., Tanaka, R., Ikeda, Y., Nakahata, T., and Tsuji, K.
(2001). CD34 expression on long-term repopulating hematopoietic

stem cells changes during developmental stages. Blood 97, 419425.


McCulloch, E. A., and Till, J. E. (2005). Perspectives on the properties of stem
cells. Nat. Med. 11, 10261028.
Moayeri, M., Hawley, T. S., and Hawley, R. G. (2005). Correction of murine
hemophilia A by hematopoietic stem cell gene therapy. Mol. Ther. 12,
10341042
Planat-Benard V, Menard C, Andre M, Puceat M, Perez A, Garcia-Verdugo M,
Penicaud L, Casteilla L. 2004. Circ Res, 94, 223229.
Sato, T., Laver, J. H., and Ogawa, M. (1999). Reversible expression of CD34
by murine hematopoietic stem cells. Blood 8, 25482554.
Sauvageau, G., Iscove, N. N., and Humphries, R. K. (2004). In vitro and in
vivo expansion of hematopoietic stem cells. Oncogene 23, 7223
7232.
Shizuru, J. A., Negrin, R. S., and Weissman, I. L. (2005). Hematopoietic stem
and progenitor cells: Clinical and preclinical regeneration of the
hematolymphoid system. Annu. Rev. Med. 56, 509538.
Solar, G. P., Kerr, W. G., Zeigler, F. C., Hess, D., Donahue, C., de Sauvage,
F. J., and Eaton, D. L. (1998). Role of c-mpl in early hematopoiesis.
Blood 92, 410.
Spangrude, G. J., and Johnson, G. R. (1990). Resting and activated subsets
of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87, 74337437.
Steward, C. G., and Jarisch, A. (2005). Haemopoietic stem cell
transplantation for genetic disorders. Arch. Dis. Child 90, 12591263.
Storms, R. W., Trujillo, A. P., Springer, J. B., Shah, L., Colvin, O. M.,
Ludeman, S. M., and Smith, C. (1999). Isolation of primitive human
hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase
activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 91189123.
Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., and Chin]Yee, I.
(1996). The ISHAGE guidelines for CD34 cell determination by flow
cytometry. J. Hematother. 5, 213226.
Wagner W, Feldman RE,Jr., Seckinger A, Maurer MH, Wein F, Blake J,
Krause U, Kalenka A, Burgers HF, Saffrich R, Wuchter P, Kuschinsky
W, and Ho AD (2006). The heterogenecity of human mesenchymal
stem cell preparations Evidence from simultaneous analysis of
proteomesand transcriptomes. Exp Hematol 34:536-548.
Wagner W, Wein F, Seckinger A, Frank-hauser M, Wirkner U, Krause U,
Blake J, Schwager C, Eckstein V, Ansorge W, and Ho AD (2005).
Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human
bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp Hematol
33:1402-1416.
Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., and Morrison, S. J. (2006). SLAM family markers
are conserved among hematopoietic stem cells from old and
reconstituted mice and markedly increase their purity. Blood 107,
924930.

Zhang, C. C., Kaba, M., Ge, G., Xie, K., Tong, W., Hug, C., and Lodish, H. F.
(2006a). Angiopoietin-like proteins stimulate ex vivo expansion of
hematopoietic stem cells. Nat. Med. 12, 240245.
Zhang, C. C., Steele, A. D., Lindquist, S., and Lodish, H. F. (2006b). Prion
protein is expressed on long-term repopulating hematopoietic stem
cells and is important for their self-renewal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
103, 21842189.
Zijlmans, J. M., Visser, J. W., Kleiverda, K., Kluin, P. M., Willemze, R., and
Fibbe, W. E. (1995). Modification of rhodamine staining allows
identification of hematopoietic stem cells with preferential short-term
or long-term bone marrow-repopulating ability. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92, 89018905

LAMPIRAN
Seminar Nasional sel Punca

PUSAT STEM SEL UNIVERSITAS GADJAH MADA DAN PROGRAMNYA


Yuda Heru Fibrianto*1
*Bagian Fisiologi Fakultas Kedokteran Hewan UGM, Jl. Fauna 2, Karangmalang
Yogyakarta, 55281, fibrianto1802@gmail.com
Pusat sel punca Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
ABSTRAK
Pusat stem sel Universitas Gadjah Mada merupakan pusat kajian dan penelitian
stem sel yang terdiri dari gabungan staf peneliti dari fakultas kedokteran hewan,
kedokteran, farmasi, biologi dan peternakan yang bertempat di laboratorium pusat
penelitian terpadu dan di laboratorium tekhnologi kedokteran. Tim stem sel UGM
dikelompokkan menjadi tiga kelompok kerja dari litbang, etika dan klinis sesuai dengan
keahliannya, sehingga terjalin kesesuaian ide, penelitian dan aplikasi pra-klinis dan
klinis. Program dari pusat studi ini adalah untuk penelitian stem sel dari tekhnik isolasi
dan plurifikasi adult stem sel sampai stem sel hasil rangsangan (induce pluripotent stem
cell, iPS) untuk mendapatkan sel line, protokol differensiasi dan aplikasi.
Pendahuluan
Banyak penyakit kritis pada manusia tidak dapat diobati dan disembuhkan oleh
tekhnologi kedokteran yang paling baru sekarang ini. Penyakit ini sering merusak organ
manusia yang hasilnya menyebabkan organ manusia tersebut secara normal tidak dapat
berfungsi secara normal. Para peneliti yakin bahwa stem cell manusia adalah obat yang
sangat baik untuk menyembuhkan penyakit kritis tersebut. Stem sel adalah sumber dari
semua sel di dalam individu, dan ini merupakan sebuah sumber bagi pengobatan sel.
Pengobatan sel sekarang ini merupakan sebuah jalan revolusi untuk mengatasi penyakit
dan kerusakan dengan keuntungan medis yang luas. Pengobatan stem sel mempunyai
potensi penerapan dalam mengatasi berbagai penyakit dan kelemahan dari otak, organ
dalam, tulang dan banyak jeringan lainnya. Contoh penyakit ini meliputi stroke,
Alzheimers, Parkinson, penyakit jantung, osteoporosis, diabetes yang tergantung insulin,
leukimia, luka bakar dan kerusakan sunsum tulang belakang. Penelitian stem sel dewasa
beserta aplikasinya telah diperbolehkan dilakukan di Indonesia, dan beberapa sudah
dipraktekkan untuk pengobatan penyakit infark jantung, tetapi penelitiannya masih belum
dijalankan dengan intensif sehingga masih sangat diperlukan untuk penelitian dengan
seksama disamping itu, pluripoten stem (iPS) sel hasil induksi telah dihasilkan dari
fibroblas tikus dan manusia dengan transduksi retroviral dari empat faktor transkripsi, sel
iPS hasil buatan ini terlihat sama dengan stem sel yang berasal dari embrio (embrionik
stem sel) dalam penampakan gene dan berkompeten untuk menghasilkan chimera germ
sel. Pembentukan sel iPS manusia ini memberikan sebuah metode untuk memproduksi
sel stem dari pasien untuk dipelajari status penyakitnya di dalam kultur atau laboratorium
sehingga kita perlu untuk melakukan penelitian dari iPS ini karena sel ini yang berpotensi
pluripotensi sangat supel dalam aplikasinya.
1

Disampaikan pada seminar sehari ASPI: Penelitian Multisenter Sel Punca di Indonesia, Hotel Acacia,
Jakarta, 30 mei 2009

Sel punca (Stem sel)


Sel punca (Stem sel) adalah sumber dari semua sel di dalam individu, dan ini
merupakan sebuah sumber bagi pengobatan sel yang sekarang ini merupakan sebuah
jalan revolusi untuk mengatasi berbagai penyakit dan kerusakan dengan keuntungan
medis yang luas. Pengobatan dengan menggunakan sel punca mempunyai potensi
penerapan dalam mengatasi berbagai penyakit dan kelemahan dari otak, organ dalam,
tulang dan banyak jaringan lainnya. Contoh penyakit ini meliputi stroke, alzheimers,
Parkinson, penyakit jantung, osteoporosis, diabetes yang tergantung insulin, leukimia,
luka bakar dan kerusakan sunsum tulang belakang. Sel punca dapat dikategorikan
menjadi 2 macam kategori besar berdasarkan sumbernya yaitu sel punca dewasa yang
berasal dari organisme dewasa dan sel punca embrio, sel punca yang berasal dari inner
sel mass embrio stadium blastula. Kedua macam sel punca ini dapat digunakan untuk
pengobatan sel punca (Bongso dkk., 2005). Di Indonesia telah dimulai penelitian dan
pengobatan stem stem dengan menggunakan sel punca dewasa (Permenkes, 2009), hal
ini dipilih karena sel punca dewasa tidak menemui hambatan dalam bidang etika,
sedangkan sel punca embrio masih banyak ketidakjelasan tentang etika dan banyak
perdebatan yang timbul karenanya, walaupun sudah banyak negara yang
membolehkannya (Burley, 2005) termasuk amerika baru-baru ini setelah terpilihnya
presiden Barak Obama (Anonim, 2009).
Sel punca dewasa yang banyak diteliti adalah sel punca mesenkimal dan
hematopoietik. Sel punca mesenkim (MSCs) merupakan wakil dari tipe sel punca
dewasa yang memberikan variasi sel termasuk osteosit, chondrosit, adiposit dan bentuk
lain dari sel jaringan ikat lain seperti dalam tendon (Beyer dan Meireles, 2006).
Sedangkan hematopoiesis adalah perwakilan dari sel punca dewasa yang merupakan
pioneer dari sel punca, dimana penelitian akhir-akhir ini telah diperoleh hasil dimana sel
punca ini mampu berdifferensiasi menjadi sel jantung ataupun sel lain yang bukan
berasal dari mesodermal seperti sel hati dan saraf apabila menemukan lingkungan yang
cocok untuk pertumbuhannya (Wagner dkk., 2005; 2006).
Walaupun demikian, para peneliti yakin bahwa sel punca embrio adalah sumber
sel punca yang mempunyai potensi untuk mempertahankan keadaan tidak
terdifferensiasi, dan juga sel turunannya memperlihatkan penanda sel punca permukaan
yang jelas, mempunyai aktivitas telomerase yang tinggi, memperlihatkan tipe karyotype
normal dan mempunyai potensi untuk berdifferensiasi kedalam berbagai tipe sel dalam
kondisi in Vitro ataupun in vivo. Oleh karena itu, sel hESC mempunyai potensi
kemampuan untuk pengembangan dengan pengobatan transplantasi sel untuk menangani
berbagai penyakit manusia karena kemampuannya untuk menjadi berbagai macam sel
dari berbagai organ dalam tubuh atau bersifat pluripotensi (Reubinof dkk, 2000;
Thomson dkk, 1998), sehingga telah membangkitkan keingintahuan pada kemampuan
transplantasi sel punca embrio (embrionic stem cell/ES) ini untuk penyembuhan sel
dalam bidang pengobatan manusia (Trouson, 2001; Trouson dan Pera 2001).
Debat etika yang menyelimuti therapeutic cloning, seperti halnya kesulitan
tekhnik dan proses yang tidak efisien (Hochedlinger dkk., 2006), telah memacu
penyelidikan untuk memperoleh tekhnik pemrograman ulang dari sel somatik dengan
faktor penentu pluripotensi (Maherali dkk., 2007; Takahashi dkk., 2006; 2007; Wernig
dkk., 2007; Yu dkk., 2007, Okita dkk., 2007). Strategi yang baru ini dikenal dengan
istilah induksi pluripotensi stem sel (iPS cells) dan pada penelitian berkelanjutan dewasa
ini, fibroblas tikus dan manusia telah diprogram in vitro kedalam sel pluripoten mirip

stem sel (dinamakan pluripoten induksi stem sel atau iPS) melalui transduksi
retrovirus dari kombinasi faktor transkripsi (Maherali dkk., 2007; Takahashi dkk., 2006;
2007). Ini telah diperoleh dengan seleksi untuk memprogram ulang sel dengan
mengaktifkan kembali penanda endogen pluripotensi Oct4 gene atau Nanog atau dengan
mengkloning koloni berdasar pada kriteria morfologinya (Maherali dkk., 2007;
Takahashi dkk., 2006; 2007; Wernig dkk., 2007; Yu dkk., 2007). Sel iPS yang
dihasilkan dari fibroblas tikus dan manusia sangat mirip dengan sel ES secara kriteria
genetik, epigenetik dan perkembangannya. Bagaimanapun, ini tetap jadi ditentukan
apakah sel iPS yang diperoleh dari fibroblas dewasa dapat dipergunakan untuk
memperbaiki fungsi fisiologis dari jaringan sakit in vivo karena masalah asal sel dan
mekanisme induksi dari iPS sel tetap sukar untuk dipahami.
Telah dilaporkan pembentukan sel iPS dari sel hati tikus dewasa dan sel epitel
lambung. Sel iPS hasil buatan ini terlihat sama dengan stem sel yang berasal dari embrio
(embrionik stem sel) dalam penampakan gene dan berkompeten untuk menghasilkan
chimera germ sel. Dengan transduksi retrovirus dengan empat faktor transkripsi, Oct 3/4,
Sox2, Klf4, dan c-Myc, sel fibroblast tikus dewasa telah diprogram ulang ke keadaan
tidak terdifferensiasi yang mirip dengan stem sel embrio (Okita dkk., 2007; Takahashi
dkk., 2006), dan sel ini telah dinamai sel pluripoten induksi (iPS). Sesudah itu, sel iPS
manusia dihasilkan dengan menggunakan dua pasang faktor transkripsi yang berbeda
(Takahashi dkk., 2007; Yu dkk., 2007). Pembentukan sel iPS manusia memberikan
sebuah metode untuk memproduksi sel stem dari pasien untuk dipelajari status
penyakitnya di dalam kultur atau laboratorium (Takahashi dkk., 2007; Park dkk., 2008),
walaupun secara essensial mekanisme dari induksi sel iPS, belum dikpahami secara
menyeluruh. Efisiensi yang rendah dari pembentukan sel iPS dari berbagai penelitian
menyarankan penggunaan asal sel tersebut yang mungkin menyebabkan stem sel tidak
berdifferensiasi secara tetap dan juga integrasi retrovirus kedalam tempat khusus tidak
disyaratkan untuk induksi sel iPS (Yamanaka dkk., 2007), meskipun demikian sel iPS
telah dihasilkan dari penelitian yang dilakukan oleh Aoi dkk. (2008) yang menggunakan
sel epitel.
Dengan menggunakan model tikus untuk penyakit anemia sel, tikus dapat
selamat setelah transplantasi dengan progenitor hematopoietik yang diperoleh secara in
vitro dari iPS autologus. Penyembuhan ini diperoleh setelah koreksi dari allel
hemoglobin manusia sakit dengan target gen khusus. Hasil ini memberikan bukti nyata
dari prinsip dalam penggunaan faktor transkripsi untuk menginduksi pemrograman ulang
yang dikombinasikan dengan gene transfeksi serta sel terapi untuk pengobatan penyakit
pada tikus. Masalah yang timbul sehubungan dengan penggunaan retrovirus dan
onkogene untuk program ulang, membutuhkan penanganan terlebih dahulu sebelum sel
iPS dapat dipertimbangkan untuk pengobatan manusia. Kesembuhan sel sakit anemia
mengindikasikan bahwa memanfaatkan sel autologus turunan iPS untuk tujuan
pengobatan memberikan ikhtisar beberapa janji yang diberikan sebelumnya oleh cloning
terapi: (1) tidak membutuhkan pemakaian obat penekan kekebalan untuk mencegah
penolakan dari sel tranplantasi yang tidak cocok, (2) kesempatan untuk memperbaiki
kelainan genetik dengan rekombinasi homolog, dan (3) kesempatan secara berulang
mendifferensiasi sel iPS kedalam tipe sel yang diinginkan untuk melanjutkan
pengobatan (Hanna dkk., 2007). Walaupun pemrograman ulang dari sel somatik manusia
kedalam sel iPS sekarang telah diperoleh (Takahashi dkk., 2007; Yu dkk., 2007),
aplikasi pengobatan masa depan dari sel iPS pada manusia mendapatkan beberapa
rintangan yang dihadapi: (1) menghindari penggunaan oncogene berbahaya sebagai

bagian dari faktor pemrograman ulang (Okita dkk., 2007), (2) menghindari penggunaan
penghantar gene dari vektor retrovirus yang membawa resiko pemasukan mutagenes,
dan (3) pengembangan yang sehat, kuat dan nyata protokol differensiasi untuk sel iPS
manusia.
Tim kerja sel punca UGM
Pembuatan tim kerja stem sel universitas gadjah mada dengan pusat studi tersendiri
dengan beranggotakan dari seluruh komponen sumber daya manusia yang ada di
universitas dari berbagai bidang ilmu. Program utama adalah mengadakan diskusi dan
sharing ide serta telaah texbook dan analisis jurnal sehingga didapatkan prioritas dalam
penelitian dalam mengidentifikasi, isolasi, multiplikasi dan penerapan stem sel baik sel
punca dewasa maupun iPS sehingga alur penelitian yang ada bisa dilaksanakan secara
konphrehensif dan tepat guna dalam melakukan kegiatan penelitian dan penerapannya
tanpa mengindahkan kaidah bioetika.
Dari beberapa hasil sementara tim kerja SCC-UGM adalah sebagai berikut:

Penasehat :

Prof. Dr. Retno S. Soedibyo, MSc., Apt

Tim kerja sel punca dikelompokkan menjadi 3 kelompok kerja seuai dengan
tupoksinya

Pokja litbang

Yuda heru fibrianto, MSi., PhD. Koordinator - FKH

Eggi arguni PhD. FK

Rina Susilowati, PhD. - FK

Riris istighfari jenie, MSi, Apt. - Farmasi

Sigit Bintoro, MSc. - Fapet

Aris purwantoro, MSi - FKH

Mona airin, MSi FKH

Ronny Martien, DR. Rer. Nat., MSi - farmasi

Pokja etikolegal,

Prof. Dr. Soenarto S., SpTHT - FK

Prof. Dr. Yati Soenarto., SpPA - FK

Pokja aplikasi klinis

Arief Budiyanto, PhD., SpKK - FK

Widodo, SpKK - FK

Sunardi Radiono, SpKK - FK

Rahadyan, PhD., SpOT, FICS - FK

Krisdanarti, SpPD, SpJP - FK

Johan Kurnianda, SpPD, SpHO - FK

Kartika, SpPD - FK

Samekto Wibowo, Prof. DR. SpSS FK

Prof. M. Anwar, SPOG (K) FK

Hasto, SpOG (K) (FK)


Yudha Patria, PhD. SpA FK
Setyo Budhi, drh. MP. - FKH
Sudarminto, drh., MSi - FKH

Program SCC-UGM
Program yang akan dilakukan di stem cell center universitas gadjah mada adalah:
(1) isolasi dan plurifikasi stem sel dewasa yang berasal dari hematopoietik maupun dari
plasenta, (2) mengembangkan iPS dan differensiasi serta aplikasi preklinik maupun
klinis, (3) membuat universal iPS sehingga didapatkan pluripotensi stem sel yang siap
pakai bagi siapa saja yang membutuhkan, (4) membuat hubungan dan korelasi dari
berbagai pusat studi stem sel dari rumah sakit, pusat studi maupun universitas dalam
sharing ilmu dan hasil pengembangan yang sudah didapatkan.
Beberapa tekhnik yang kita kembangkan dan beberapa protokol yang ada di SCC-UGM
adalah sebagai berikut:
Pembuatan feeder sel dari sel fibroblas
Sel feeder adalah sel fibroblas yang diambil dari kulit yang diambil saat
melakukan operasi.
Kulit dibersihkan secara aseptik dan dibiopsi dan secepatnya diproses dalam DPBS (Life technologies).
Setelah dicuci, kulit dicacah dalam dish kultur diikuti pemisahan antar sel dengan
pemberian 0.25% (w/v) trypsin yang mengandung 1 mM EDTA 1 - 2 jam pada
38C.
Sel yang sudah ditripsin dicuci sekali lagi dengan sentrifugasi (300xg, 2 menit)
dan dimasukkan kdalam cawan Petri 100 mm selama 6-8 hari dalam DMEM + 10%
fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential
medium (MEM) asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycinantimycotic pada suhu 38C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara
Pada hari ke 6-8 dilakukan penggantian kultur dan pasase dengan tripsinisasi dan
larutan kultur DMEM, sel yang tidak menempel atau benda ikutan dibersihkan,
sedangkan sel yang menempel dikultur sampai penuh dan dilakukan pasase beberapa
kali.
Sel yang sudah banyak dapat disimpan dalam larutan DMEM yang ditambah
10% DMSO dan 10% serum untuk dibekukan dan dipakai bilamana perlu.
2-3 hari sebelum dilakukan kultur stem sel, dilakukan pengkulturan sel feeder
fibroblas ini
Isolasi, purifikasi dan plurifikasi prekursor sel punca setelah perlakuan GCSF (dilakukan setelah inform consent dan ethical clearence diperoleh)
Pasien di injeksi dngan G-CSF selama 1 minggu selama berturut-turut
Pengambilan darah tepi dengan antikoagulan dengan fosfat buffered saline (PBS)

yang mengandung 0,6% antikoagulan sitrat dekstroseA (ACD-A cat. no. C3821;
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)1:3
35 ml larutan darah tali pusat atau darah tepi 12 ml Ficoll-Paque PLUS (cat. no.
17-1440-02; GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Sentrifuse pada 375g
untuk 30 menit pada suhu ruang . koleksi sel pada antar permukaan, larutkan dengan
PBS mengandung 0.6% ACD-A, dan sentrifus pada 375g 10 min pada suhu ruang.
Beri larutan pelisis eritrosit (0.15MNH4Cl, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH
7.27.4) dan inkubasi 10 menit pada suhu ruang. Sentrifuse pada 375g 10 menit dan
cuci sekali lagi dalam PBS.Darah disentrifugasi 300 x g, 10 menit untuk
memisahkan sel darah putih, serum dan sel darah merah
Sel darah putih yang sudah terpisahkan ditanam ke dalam cawan Petri 100 mm
yang telah mengandung sel feeder selama 6-8 hari dalam DMEM + 10% fetal bovine
serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential medium
(MEM) asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic
pada suhu 38C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara.
Sel yang tidak melekat diambil, sedangkan sel yang menempel dipertahankan
sampai sel berkembang penuh.
Pemindahan sel ke media yang baru dilakukan dengan cara tripsinisasi 0.1% dan
0.02% EDTA dua kali dalam seminggu selama dua bulan dan apabila perbanyakan
sel mencukupi, sel disimpan dalam larutan nitrogen cair pada suhu -196 C dalam
larutan pembeku sel (80% DMEM, 10% DMSO dan 10% FBS).
Uji identifikasi untuk CD34 dan 43 sebagai ciri utama adanya multipotensi
dengan menggunakan RT-PCR.
Dilakukan juga uji dengan pengecatan Hoech untuk mengetahui berapa
prosentase dari masing masing stem sel
Transfeksi cDNA faktor transkripsi dan EGFP gene kedalam sel fibroblast
Plasmid pEGFP-N1 yang mengkode variasi sinar merah dari GFP type liar yang
telah dioptimalisasi untuk berpendar lebih terang dan terekspresi dalam sel mamalia lebih
tinggi dan cDNA faktor transkripsi (OCT 4 dan Nanog) dari Clontech Laboratories, Inc.
(Palo Alto, CA). Sehari sebelum transfeksi sel fibroblast dengan kepekatan penuh (pasase
ke 3-5) ditripsinisasi, dihitung dan ditempatkan kedalam 35 mm kultur dish sampai
dicapai kepekatan 80% pada hari transfeksi. Satu mikroliter cDNA dan Satu mikroliter (1
g) pEGFP-N1 serta 3 l FuGENE-6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) dicampur
dengan 97 l DMEM bebas serum. Setelah 15 menit diinkubasi pada temperature kamar,
101 l larutan campuran medium dan cDNA ditambahkan kedalam 2 ml kultur media.
Sel diinkubasi selama 23 hari dalam sel feeder sampai kepekatan 100% dan dipasase
sekali untuk untuk didapatkan pertautan yang stabil dari gene cDNA dan EGFP kedalam
kromosom sel fibroblast. Untuk meningkatkan laju transfeksi gene kedalam sel, sel yang
sudah tertransfeksi dilanjutkan dengan berbagai perlakuan dengan menggunakan
penghambat siklus sel (puromycine) untuk memperoleh atau ditemukannya laju
transfeksi sel yang paling tinggi (100%).
Penstabilan iPS sel line
Sel feeder disiapkan 6-48 jam sebelum sel hasil induksi diperoleh dan akan
dipasase. Kalau memungkinkan diharapkan akan digunakan sel feeder yang segar dengan
jumlah passase yang minimal. Sel iPS dikultur pada sel feeder dalam medium kultur sel

pada 37C dan 5% CO2. setelah 6 hari dalam kultur diamati pembentukan koloni dibawah
mikroskop. Subkultur dilakukan secara mekanik setiap 5-7 hari dengan memisahkan
koloni sel yang tidak berdifferensiasi kedalam kumpulan sel yang terdiri dari 200-300 sel
menggunakan pipet pasteur yang dibengkokkan dibawah mikroskop inverted. Kelompok
sel yang telah dipisahkan dipasase kedalam disk lapisan feeder sel yang baru dengan
medium yang sama. Setelah mengalami proliferasi yang berkelanjutan sekitar 40 kali
pasase, didapatkan sel line iPS sel. Pada saat awal kultur sel medium ditambahi dengan
faktor inhibisi leukimia (hLIF; Chemicon, Temecula, CA).
Pembekuan dan penanaman kembali sel iPS
Pembekuan
Sel iPS scara mekanik dipisahkan kedalam kelompok 200-300 sel/kelompok.
Lima kelompok sel pada waktu bersamaan dipindahkan kedalam 25 l larutan pembeku 1
(DMSO 10% dan 10% ethilen glycol dalam medium) dan diinkubasi pada 37C dan 5%
CO2 selama 1 menit. Kelompok sel dipindah kedalam 25 l larutan pembeku 2 (DMSO
20%, 20% ethilen glycol dan 0,5 M sukrose dalam medium) dan diinkubasi pada 37C
dan 5% CO2 selama 30 detik. Masukkan kelompok sel kedalam EM-grid (Pelco,
Redding, CA; cat. no. 3 HGC #400) dengan menggunakan pipet kapiler dibawah
mikroskop dan secepatnya dimasukkan kedalam cryovial (Nunc; cat. no. 368632) dan
disimpan pada -196C.
Penanaman kembali (thawing) sel iPS
EM-grid dimasukkan kedalam 25 l larutan thawing 1 (0,2 M sukrose dalam
kultur media iPS) dan diinkubasi pada 37C dan 5% CO 2 selama 1 menit, dilanjutkan
pemindahan kelompok sel kedalam 25 l larutan thawing 2 (0,1 M sukrose dalam kultur
media iPS) dan diinkubasi pada 37C dan 5% CO 2 selama 5 menit dan kelompok sel
dicuci dalam 25 l medium kultur dan diinkubasi pada 37C dan 5% CO2 selama 10
menit dan sel dimasukkan kedalam lapisan feeder sel yang baru. Lebih dari 10 kelompok
sel dimasukkan kedalam lapisan feeder yang baru dan dikultur secara bersamaan. Dish
ditempatkan pada 37C dan 5% CO2 dan tidak diganggu selama 48 jam.
Ekspressi penanda permukaan sel
Koloni sel iPS (8-10 koloni) ditumbuhkan dalam dish 4 sumuran dengan 500 l
larutan. Pada saat analisa, kultur media iPS diambil dan sel dicuci dengan 1XDPBS yang
mengandung 0,9 mM Ca2+ (CaCl2) dan 0,5 mM Mg2+ (MgCl2) (Life Technologi; cat.
no. 14080055). Koloni difixe-kan dengan 500 l 4% paraformaldehid (Sigma; cat. no. P6148) selama 30 menit dan selanjutnya dicuci 3 kali untuk 3 manit dalam 500 l larutan
1XDPBS dengan Ca2+ dan Mg2+. Aktivitas peroksidase endogen dipadamkan dengan
inkubasi fixed koloni dengan 500 l larutan 0,3% H2O2 selama 30 menit pada 26C.
Koloni dicuci dengan DPBS selama 5 menit. Kit Vectastain ABC (Vector, Burlingame,
CA; cat. no. PK-6103) digunakan untuk mengecat penanda permukaan sel dengan cara
protokol perusahaan. Kit terdiri dari Bloking serum, Biotinil antibodi dan reagen
vecstain ABC. Antibodi primer dilarutkan dengan menggunakan Bloking serum sesuai
kebutuhan: SSEA-1 (pengencran 1:1000); SSEA-3; SSEA-4 (cat. no. MC-813-70); TRA1-60 (1:1000 Dilution; Chemicon; cat. no. MAB4360); TRA-1-80 (pengenceran 1:1000
dilution; Chemicon; cat. no. MAB4381); dan Oct-4 (pengenceran 1:1000 dilution; Santa
Cruz Biotechnology, Sata Cruz, CA; cat. no. SC-5279).

DAFTAR PUSTAKA
Aoi T., Yae K., Nakagawa M., Ichisaka T, Okita K, Takahashi K., Chiba T., Yamanaka
S., 2008. Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and
Stomach Cells. Science 321(5889):699-702
Bongso A dan Lee EH. Stem cell: Their definition, classification and Sources dalam stem
cell. 2005. World Scientific. Pp. 1-13.
Burley J. 2005. Stem Cells and Translational Medicine Ethics, Law, and Policy in Stem
cells : from bench to bedside World Scientific Publishing Co. Pp. 186-211
Hanna J., Wernig M, Markoulaki S., Sun CW., Meissner A., Cassady JP., Beard C.,
Brambrink T., Wu LC., Townes TM., Jaenisch R., 2007. Treatment of Sickle Cell
Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from Autologous Skin. Science
318(5858):1920-3
Hochedlinger K. and Jaenisch R., 2006. Nuclear reprogramming and pluripotency.
Nature 441(7097):1061-7
Maherali N, Sridharan R, Xie W, Utikal J, Eminli S, Arnold K, Stadtfeld M, Yachechko
R, Tchieu J, Jaenisch R, Plath K, Hochedlinger K. 2007. Directly reprogrammed
fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.
Cell Stem Cell 1(1):55-70
Okita K., Nakagawa M., Hyenjong H., Ichisaka T., Yamanaka S., 2008. Generation of
Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science
322(5903):949-53
Okita K., Ichisaka T, and Yamanaka S. 2007. Generation of germline-competent induced
pluripotent stem cells. Nature 448(7151):313-7
Park IH., Zhao R, West JA, Yabuuchi A, Huo H, Ince TA, Lerou PH, Lensch MW. and
Daley GQ. 2008. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with
defined factors. Nature 451(7175):141-6
Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, Trounson A dan Bongso A. Embrionic stem cell lines
from human blastocyst: Somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 2000;
18(4):399-404.
Takahashi K., Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S.
2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined
factors. Cell 131(5):861-72.
Takahashi K., and Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse
embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126(4):663-76
Thomson JA, Itskovits-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshal VS, dan
Jones JM. Embrionic stem cell lines derived from human blastocyst. Science
1998; 282:1145-1147.
Trounson A dan Pera M. Human embrionic stem cell. Fertil. Steril. 2001; 76(4):660-661.
Trounson A. 2001. The derivation and potential use of human embrionic stem cell lines.
Reprod. Fertil. Dev. 13:523-532.
Wagner W, Feldman RE,Jr., Seckinger A, Maurer MH, Wein F, Blake J, Krause U,
Kalenka A, Burgers HF, Saffrich R, Wuchter P, Kuschinsky W, and Ho AD.
2006. The heterogenecity of human mesenchymal stem cell preparations Evidence
from simultaneous analysis of proteomesand transcriptomes. Exp Hematol
34:536-548.
Wagner W, Wein F, Seckinger A, Frank-hauser M, Wirkner U, Krause U, Blake J,
Schwager C, Eckstein V, Ansorge W, and Ho AD. 2005. Comparative

characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose


tissue, and umbilical cord blood. Exp Hematol 33:1402-1416.
Wakayama T, Shinkai Y, Tamashiro KL, Niida H, Blanchard DC, Blanchard RJ, Ogura
A, Tanemura K, Tachibana M, Perry AC, Colgan DF, Mombaerts P, Yanagimachi
R. 2001. Cloning of mice to six generation. Nature 407(6802):318-319
Wakayama T, Tabar V, Rodriguez I. 2001. Differentiation of embryonic stem cell lines
generated from adult somatic cekks by nuclear transfer. Science 292(5517):740743.
Wernig M., Meissner A, Foreman R, Brambrink T, Ku M, Hochedlinger K, Bernstein
BE, Jaenisch R. 2007. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent EScell-like state. Nature 448(7151):318-24.
Yamanaka S. 2007. Strategies and new developments in the generation of patient-specific
pluripotent stem cells. Cell Stem Cell.1(1):39-49
Yamanaka S., Poksay KS., Arnold KS., Innerarity TL. 1997. A novel translational
repressor mRNA is edited extensively in livers containing tumors caused by the
transgene expression of the apoB mRNA-editing enzyme. Genes Dev. 11(3):32133
Yu J., Vodyanik MA., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane JL., Tian S., Nie J.,
Jonsdottir GA., Ruotti V., Stewart R., Slukvin II., Thomson JA. 2007. Induced
Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science.
318(5858):1917-20.

Lampiran 2. Nota kesepahaman ugm dan Biofarma

NOTA KESEPAKATAN KERJASAMA


ANTARA
PT. BIO FARMA (PERSERO)
DENGAN
UNIVERSITAS GADJAH MADA
Nomor : 08231/DIR/XI/2009
Nomor : 7269/P/HT/2009
TENTANG
PENDIDIKAN, PELATIHAN, PENELITIAN, DAN PENGABDIAN KEPADA
MASYARAKAT
Pada hari ini Selasa, tanggal Tiga, bulan November, tahun Dua ribu sembilan (3-112009), pihak-pihak yang bertanda tangan dibawah ini:
1. PT BIO FARMA (PERSERO), Perseroan Terbatas yang Akta Pendirian
Anggaran Dasarnya telah
mendapatkan pengesahan dari Menteri
Kehakiman Republik Indonesia pada tanggal 5 Maret 1998 Nomor C2-1423
HT.01.01.Th.98 dan telah diumumkan dalam Berita Negara Republik
Indonesia tanggal 16 Juli 2002 Nomor 57, Tambahan Nomor 6884, dan telah
mengalami beberapakali perubahan, terakhir berdasarkan Akta tanggal 2907-2008 (dua puluh sembilan Juli dua ribu delapan) Nomor 58, yang dibuat
dihadapan Fathiah Helmi, Sarjana Hukum, Notaris di Jakarta, dan telah
memperoleh persetujuan Menteri Hukum dan Hak Asasi Manusia Republik
Indonesia dengan Surat Keputusannya tanggal 12-09-2008 (Dua belas
September dua ribu delapan) Nomor AHU-61576.AH.01.02.Tahun 2008
tentang Persetujuan Akta Perubahan Anggaran Dasar Perseroan, dalam
perbuatan hukum ini diwakili secara sah oleh Drs. Iskandar, MM., sebagai
Direktur Utama berdasarkan Keputusan Nomor KEP-196/MBU/209 tanggal
17 September 2009, yang bertindak untuk dan atas nama PT Bio Farma
(Persero), yang berkedudukan dan berkantor pusat di Jalan Pasteur Nomor
28, Bandung 40161, yang selanjutnya disebut sebagai PIHAK PERTAMA.
2. Universitas Gadjah Mada, Perguruan Tinggi Badan Hukum Milik Negara
yang ditetapkan melalui Peraturan Pemerintah Nomor 153 Tahun 2000 dalam
hal ini diwakili oleh Prof. Ir. Sudjarwadi, M.Eng., PhD., Rektor Universitas
Gadjah Mada, yang diangkat berdasarkan Keputusan Majelis Wali Amanat
Universitas Gadjah Mada Npmor 16/SK/MVA/2007 tanggal 25 Mei 2007,
dalam hal ini bertindak untuk dan atas nama Universitas Gadjah Mada,
berkedudukan di Bulaksumur, Depok, Sleman, Daerah Istimewa Yogyakarta,
yang selanjutnya disebut PIHAK KEDUA.
Untuk selanjutnya PIHAK PERTAMA dan PIHAK KEDUA secara bersama-sama
disebut PARA PIHAK atau masing-masing disebut PIHAK.

PARA PIHAK terlebih dahulu menerangkan hal-hal sebagai berikut:


1. Bahwa PIHAK PERTAMA adalah Badan Usaha Milik Negara di Indonesia
yang bergerak dalam bidang produksi vaksin dan antisera untuk mendukung
Program Imunisasi Nasional serta memenuhi kebutuhan pasar eksport.
2. Bahwa PIHAK KEDUA sebagai Perguruan Tinggi Badan Hukum Milik
Negara yang menyelenggarakan Pendidikan Tinggi dan bergerak dalam
bidang pendidikan, penelitian dan pengabdian kepada masyarakat.
Berdasarkan hal-hal tersebut di atas PARA PIHAK sepakat untuk mengadakan
kerjasama dengan syarat-syarat dan ketentuan sebagai berikut:
Pasal 1
TUJUAN DAN RUANG LINGKUP
(1) Nota Kesepakatan Kerjasama ini bertujuan mengadakan kerjasama
kelembagaan dengan memanfaatkan sumber daya yang dimiliki oleh PARA
PIHAK demi kemajuan bersama yang berguna untuk Bangsa dan Negara.
(2) Ruang lingkup Nota Kesepakatan Kerjasama ini mencakup:
a. Penyelenggaraan Pendidikan, Pelatihan dan Penelitian di bidang Produk
Biologi terutama vaksin dan antisera;
b. Penyelenggaraan Kegiatan Ilmiah, Seminar dan Lokakarya;
c. Peningkatan dan Pengembangan Kompetensi Sumber Daya Manusia;
d. Pengembangan incubator bisnis berbasis riset; dan
e. Kegiatan lain yang disepakati secara tertulis oleh PARA PIHAK.

Pasal 2
PELAKSANAAN KEGIATAN
(1) Pelaksanaan dari Nota Kesepakatan Kerjasama ini akan dilaksanakan
berdasarkan suatu Perjanjian tersendiri yang disepakati oleh PARA PIHAK
dengan tetap mendasarkan pada Nota Kesepakatan Kerjasama ini serta
disesuaikan dengan sumber daya yang dimiliki oleh PARA PIHAK.
(2) Pelaksanaan Perjanjian sebagaimana dimaksud pada ayat (1) diatas,
PARA PIHAK sepakat untuk menunjuk wakil dari PARA PIHAK.
(3) Perjanjian yang dimaksud pada ayat (1) diatas merupakan bagian yang
tidak terpisahkan dari Nota Kesepakatan Kerjasama ini.
Pasal 3
PEMBIAYAAN

Pembiayaan yang timbul dari pelaksanaan Nota Kesepakatan Kerjasama ini


akan diatur dalam Perjanjian tersendiri yang disepakati oleh PARA PIHAK.
Pasal 4
KERAHASIAAN
(1) PARA PIHAK sepakat untuk saling bertukar data dan informasi mengenai
hal-hal yang berhubungan dengan pelaksanaan Nota Kesepakatan Bersama
ini dan yang semata-mata hanya digunakan untuk kepentingan yang
berhubungan dengan maksud dan tujuan Nota Kesepakatan Bersama ini.
(2) Selain yang tercantum dalam Nota Kesepakatan Bersama ini, merupakan
kewajiban masing-masing pihak untuk menjaga kerahasiaan data dan
informasi. Masing-masing pihak tidak dapat dipersalahkan/dituntut baik
Pidana maupun Perdata apabila terjadi keterbukaan data dan informasi
sehubungan dengan keadaan tersebut dibawah ini:
a. Apabila keterbukaan data dan informasi secara nyata diperlukan untuk
kepentingan umum atau telah dengan sendirinya diketahui oleh
masyarakat umum;
b. Apabila keterbukaan data dan informasi telah terjadi sebelum tanggal
Nota Kesepakatan Bersama ini berlaku, dengan dilampirkan bukti yang
autentik; dan
c. Apabila keterbukaan data dan informasi diwajibkan secara hukum
dan/atau diminta secara sah oleh Putusan Pengadilan yang telah
berkekuatan hukum tetap.
Selain ketentuan yang berlaku di atas PARA PIHAK sepakat untuk menjaga
kerahasiaan seluruh data dan informasi baik sebagian maupun keseluruhan kepada
pihak ketiga atau pihak lainnya baik pribadi maupun bersama-sama tanpa persetujuan
tertulis dari pihak lainnya.
Pasal 5
JANGKA WAKTU
(1) Nota Kesepakatan Kerjasama ini berlaku 3 (tiga) tahun, sejak tanggal
ditandatangani oleh PARA PIHAK dan dapat diperpanjang berdasarkan
kesepakatan tertulis PARA PIHAK.
(2) Dalam hal salah satu pihak bermaksud mengakhiri Nota Kesepakatan
Bersama ini, maka pihak yang bersangkutan harus memberitahukannya
secara tertulis kepada pihak lainnya, paling lambat diterima 6 (enam) bulan
sebelumnya.
(3) Nota Kesepakatan Kerjasama ini dapat berakhir atau batal dengan
sendirinya apabila:
a. Dikemudian hari ada ketentuan perundang-undangan yang secara
khusus mengatur dan bertentangan dengan ruang lingkup Nota
Kesepakatan Kerjasama; dan

b. Tidak tercapainya tujuan PARA PIHAK sesuai ketentuan Pasal 1 di


atas.
Pasal 6
PENYELESAIAN PERSELISIHAN
(1) Penyelesaian perselisihan akibat salah penafsiran atau perselisihan yang
timbul dalam pelaksanaan Nota Kesepakatan Kerjasama ini akan
diselesaikan secara musyawarah.
(2) Apabila musyawarah untuk mencapai mufakat sebagaimana dimaksud pada
ayat (1) tidak tercapai, PARA PIHAK sepakat untuk menyelesaikan
perselisihan tersebut melalui Badan Arbitrase Nasional Indonesia (BANI)
yang keputusannya bersifat final.
Pasal 7
LAIN-LAIN
(1) Perubahan atas Nota Kesepakatan Kerjasama ini dapat dilakukan
berdasarkan kesepakatan tertulis PARA PIHAK.
(2) Hal-hal yang belum diatur dalam Nota Kesepakatan Bersama ini akan
diatur dan ditetapkan kemudian dalam adendum yang disepakati secara
tertulis oleh PARA PIHAK serta merupakan bagian yang tidak terpisahkan
dari Nota Kesepakatan Kerjasama ini.
Demikian Nota Kesepakatan Kerjasama ini dibuat dan ditandatangani pada hari dan
tanggal tersebut di atas dalam rangkap 2 (dua) bermaterai cukup, masing-masing
mempunyai kekuatan hukum yang sama.

PIHAK PERTAMA
PT BIO FARMA (PERSERO)

Drs. Iskandar, MM
Direktur Utama

PIHAK KEDUA
UNIVERSITAS GADJAH MADA

Prof. Ir. Sudjarwadi, M.Eng., PhD.


Rektor