T.

BARLI AN

PROGRAM STUDI I LMU BI OMEDI K
KEKHUSUSAN FARMAKOLOGI
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNI VERSI TAS SUMATERA UTARA
2014

DEFINISI
Teknik pemisahan yang dilakukan dengan
memanipulasi sifat fisik dari zat-zat
penyusun suatu campuran

Tidak ada dua zat yang mempunyai sifat fisik
yang sama sehingga pemisahan untuk zat
yang serupa masih mungkin untuk dilakukan
SIFAT FISIK YANG
DIMANIPULASI
1. Kecenderungan zat untuk larut dalam
suatu cairan (partisi/kelarutan)
2. Kecenderungan zat untuk teradsorpsi
pada butir zat padat yang halus
dengan permukaan luas (adsorben)
(adsorpsi)
3. Kecenderungan zat untuk menguap
(volatilitas)
Perbandingan kromatografi cair kinerja tinggi dan
Kromatografi Kolom Terbuka
Color
Sistem pemasukan sampel: manual, tidak
volumetrik Injector
Waktu analisis lama, mengandalkan gaya
grafitasi dan kapiler pompa
Hasil pemisahan kurang baik pengemasan
kolom
Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk
analit tidak berwarna Detektor
Kesulitan penghitungan kadar integrator
KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka
untuk menjawab kekurang-kekurangan tersebut
Injector: Sistem pemasukan sampel: sample loop dan
robotik injektor, sangat volumetrik
Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik
Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil,
tekanan dapat dibuat besar Hasil pemisahan baik
Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna)
Integrator:dilengkapi komputer, bisa menghitung AuC
mudah penghitungan kadar
Sehingga disebut: Kinerja Tinggi
BAGAN SI STEM KCKT
pompa
injektor
kolom
oven
detektor
Wadah
solven
integrator
WADAH FASE GERAK
Merupakan tandon berisi fase gerak
Mempunyai sistem penyaring

pelarut yang digunakan harus dilakukan
degassing untuk mengeluarkan gas
terlarut yang tidak diinginkan.


POMPA
Merupakan sistem agar fase gerak mengalir.
Kinerja pompa yang diinginkan :
Tekanan yang dihasilkan tinggi
Fluktuasi tekanan rendah
Kecepatan aliran fase gerak tepat
ada dua jenis pompa, yang mendasari
pemakaiannya yaitu : tekanan tetap dan
volume tetap.
Column
Column
Pump
[LOAD]
[INJECT]
Pump
INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke
dalam sistem KCKT
kolom
posisi load
Posisi inject
pompa
pompa
kolom
sample loop

Sistem sample loop injektor
OVEN KOLOM instrumen pemanas
Syarat :
1. Keseragaman temperatur yang baik
2. Kestabilan temperatur yang baik
3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik

KOLOM PADA KCKT

Penampang: baja tahan karat, tahan tekanan tinggi
Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih
kompak, hasil pemisahan lebih baik
Dapat dipakai berulang

Detektor
karakteristik detektor untuk HPLC
-sensivitasnya tinggi
- respon yang menyeluruh terhadap sampel
- tidak meruska sampel
- tidak sensitif terhadap perubahan temperatur
dan kecepatan aliran fasa mobile
- dapat beroperasi secara terus menerus.
Yang umum dipakai
Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)
Detektor Photodiode Array (PDA)
Detektor Fluorescence (RF)
Detektor Konduktivitas (CDD)
Detektor Refraktive Indeks (RID)
Detektor Elektrokimia (ECD)
Detektor spektrometer massa
DETEKTOR HPLC
E
in
A= eCl = - log (Eout / Ein)
l
Hk.Lambert-Beer
kuvet
DETEKTOR SPEKTROFOTOMETER UV/VIS
E
out
Prinsip: penyerapan sebagian energi (hv) oleh molekul
pada panjang gelombang tertentu => tereksitasi elektronik
Eksitasi elektronik
A= eCl = - log (Eout / Ein)

a
b
s
o
r
b
a
n
s
i

konsentrasi
Kisaran linear
1
275 nm
208 nm
275 nm
208 nm
Pemilihan pjg gelb.: quantitative / preparative?

Detektor Photodiode Array
Sample Cell
512 Elements Photodiode Array
Grating
D2 / W lamp
satu elemen dapat
Mendeteksi absorban
Pada satu pjg gelb..
Detektor Photodiode Array : Kromatogram 3D
waktu
A
b
s
o
r
b
a
n
s
i

kromatogram
Spektrum
Detektor Photodiode Array
Puncak dapat di identifikasi dengan spektrum UV.
Pemeriksaan kemurnian puncak dapat dilakukan.
--overlap 3 spektrum
--rasio kromatogram
--perbandingan threshold dan similarity index.
Detektor Spektrofluoresen
+ hn
1
hn
2
+
*
A
A*
A
hn
1
hn
2
Excitation Wavelength
Emission Wavelength
Fluorescence
*
Rancangan Cell untuk detektor Fluorescence
Reagen derivatisasi
Reagen OPA untuk amine primer
Reagen ADAM untuk asam lemak
CHN2
9-anthryldiazomethane
(ADAM)
+ R-COOH
CH2OCOR
CHO
CHO
o-phthalaldhyde
(OPA)
+ R-NH2
N-R
A
A
Detektor Refraktive Indeks
Sistem optik
Detektor Refraktive Indeks
Kromatogram gula
Analytical Conditions
Column : Shim-pack CLC-
NH2
Mobile phase : Acetonitrile /
water
= 7 / 3
Flow rate : 1.0 mL/min
Temperature : Ambient
Peaks
1. Glycerol
2. Xylose
3. Fructose
4. Glucose
5. Sucrose
6. Manose
7. Lactose
BAGI AN DARI SI STEM HPLC
Detektor Konduktifitas
I
V
L
A A
K (conductivity) = I [A] / E [V]
=A [cm2] / L [cm] * k
(k : specific conductivity)

k= (I /E)*(L/A)
elektroda
Detektor Konduktifitas
Konduktifitas sangat dipengaruhi temperatur.
Cell harus diletakkan pada kondisi temperatur
terkontrol

Kromatogram anion dalam air laut
Analytical Conditions
Column : Shim-pack IC-A3
Mobile phase :
8.0 mM p-hydroxybenzoic acid
3.2 mM Bis-Tris *
Flow rate : 1.5 mL/min
Temperature : 40 C
Injection Volume : 100 uL
Peaks
1. F (1.4 ppm)
2. Cl (10200 ppm)
3. NO2 (10 ppm)
4. Br (43 ppm)
5. NO3 (44 ppm)
6. SO4 (431 ppm)
Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane
Perbandingan detektor
LOD : Limit deteksi (S/N=3)
GC : Gradient Compatibility
UV/ VIS RF RID CDD ECD
LOD 10 ppb 10 ppt 100 ppb 10 ppb 100 ppt
GC Yes Yes No No No
TERIMA KASIH