Analisis Kromatografi

KUAS SMA
01 Dasar Kromatografi Gas

02 Instrumen Kromatografi Gas

03 HPLC

04 Instrumentasi dan Pemecahan Masalah HPLC

05 Analisis Kualitatif Dan Kuantitatif HPLC

Dasar Kromatografi Gas
Definisi kromatografi
Kromatografi adalah teknik pemisahan yang didasarkan pada interaksi senyawa yang berbed
a dengan dua fasa, fasa gerak dan fasa diam, saat senyawa bergerak melalui media penduk
ung.
Komponen:
fase gerak: pelarut yang mengalir melalui media pendukung
fase diam: suatu lapisan atau lapisan pada media pendukung yang berinteraksi dengan analit
medium pendukung: permukaan padat tempat fase diam diikat atau dilapisi

Prinsip
Analit yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan memakan waktu lebih lama untuk melew
ati sistem daripada yang berinteraksi lebih lemah dengan fasa diam.
tR = retention time
tM = void time
Wb = baseline width of the peak in time units
Wh = half-height width of the peak in time units
Solute Retention:
Waktu retensi zat terlarut atau volume retensi dalam kromatografi secara langsung berkaitan dengan kekuatan interaksi zat
terlarut dengan fase bergerak dan diam.
Retensi pada kolom tertentu berkaitan dengan perincian dari sistem itu:
- ukuran kolom
- laju aliran fase gerak

Capacity factor (k’): more universal measure of retention, determined from tR or VR.

 k’ = (tR –tM)/tM or k’ = (VR –VM)/VM

Nilai faktor kapasitas berguna dalam memahami mekanisme retensi zat terlarut, karena definisi dasar k 'adalah:

k’ =moles Astationary phase/moles Amobile phase

When k' is < 1.0, separation is poor

When k' is > 30, separation is slow
When k' is = 2-10, separation is optimum
Efisiensi:
 Efisiensi terkait secara eksperimental dengan lebar puncak zat terlarut.
- sistem yang efisien akan menghasilkan puncak yang sempit
- puncak sempit  perbedaan interaksi yang lebih kecil untuk memisahkan dua zat terlarut
 
Efisiensi secara teoritis terkait dengan berbagai proses kinetik yang terlibat dalam retensi zat
terlarut dan transportasi di kolom
- tentukan lebar atau deviasi standar dari puncak
Number of theoretical plates (N): compare efficiencies of a system for solutes that have differ
ent retention times
for a Gaussian shaped peak
 N = 16 (tR/Wb)^2
N = 5.54 (tR/Wh)^2
Semakin besar nilai N untuk sebuah kolom, semakin baik kemampuan kolom tersebut pisahk
an dua senyawa.
- semakin baik kemampuan menyelesaikan zat terlarut yang memiliki perbedaan kecil penyi
mpanan
- N tidak tergantung pada retensi zat terlarut
- N bergantung pada panjang kolom
Plate height or height equivalent of a theoretical plate (H or HETP): compare efficiencies of
columns with different lengths:
 H = L/N

where: L = column length

N = number of theoretical plates for the column
Mengapa Band Tersebar?
-Difusi eddy
sebuah proses yang mengarah ke pelebaran puncak (pita) karena adanya beberapa jalur aliran melalui kol
om yang dikemas.
-Transfer massa fase bergerak
proses pelebaran puncak yang disebabkan oleh adanya profil aliran yang berbeda di dalam saluran atau a
ntara partikel pendukung di kolom.
-Transfer massa fase gerak stagnan
pelebaran pita karena perbedaan laju difusi molekul zat terlarut antara fasa gerak di luar pori-pori penyan
gga (fasa gerak mengalir) ke fasa gerak dalam pori penyangga (fasa gerak stagnan).
-Transfer massa fase diam
pelebaran pita karena pergerakan zat terlarut antara fase stagnan dan fase diam
-Difusi longitudinal
pelebaran pita karena difusi zat terlarut sepanjang kolom dalam fase gerak yang mengalir.
Van Deemter equation: relates flow-rate or linear velocity to H:
separation factor (α) – parameter used to describe how well two solutes are
separated by a chromatographic system:
α = k’2/k’1 k’ = (tR –tM)/tM
where:
k’1 = the capacity factor of the first solute
k’2 = the capacity factor of the second solute

resolution (RS) – resolution between two peaks is a second measure of how well two
peaks are separated:
Rs=(tr2 – tr1)/((Wb2 + Wb1)/2)
Instrumen Kromatografi Gas
GC Carrier Gases (the mobile phase)
Biasanya gas "inert" (tidak bereaksi dengan analit kecuali terkadang di detektor)
 
Tujuan:
menyapu sampel melalui kolom
melindungi kolom dari paparan oksigen pada suhu
membantu fungsi detektor
 
Paling umum:
Helium (tersedia relatif murni tanpa pemurnian ekstensif setelah meninggalkan silinder gas te
rkompresi)
Nitrogen (biasanya membutuhkan oksigen dan perangkap air)
Hidrogen
biasanya digunakan hanya dengan detektor ionisasi nyala (FID) karena FID membutuhkanny
a sebagai bahan bakar untuk nyala api masih jarang digunakan karena masalah keamanan
(dan kromatografi)
INJECTION PORT
Sampel disuntikkan melalui septum:
menjaga oksigen keluar dari kolom menyediakan segel untuk menjaga tekanan gas pembawa
di atas kepala kolom laju aliran gas pembawa ditentukan oleh tekanan atau gas pada pembu
kaan kolom. Banyak bahan yang berbeda (kebanyakan berpemilik):
karet merah (berdarah sekitar 250 C)
Thermogreen (hingga sekitar 300 C)
Biru suhu tinggi (baik sedikit di atas 300 C)
Injektor biasanya dilapisi dengan lapisan kaca yang tidak diaktifkan mencegah reaksi logam s
ampel injektor yang akan mengubah analit atau merusak logam injector dapat dibersihkan / di
ganti secara teratur

Tipe injector
Typical Injection Applications
Split - default, conc. sampel (> 0,1%), ukuran sampel 1 uL atau kurang, 0,2-2% sampel pada
kolom
Splitless - sampel encer (<0,01%), 80% sampel pada kolom
Pada Kolom - sampel mudah diuraikan, 100% sampel di kolom
 
 Memilik Kolom GC
•Is the column compatible with your analytes
– polar analytes require polar stationary phases so they will spend some of their “ti
me” in the stationary phase
– non-polar analytes require non-polar stationary phases
– You usually have to compromise on the stationary phase to get a good column for
your analytes (which are probably a mix of polar and non-polar)
– DB-5, HP-5, EC-5, RTX-5 (5% dimethyl, 95% diphenyl polysiloxane) most com
mon general use column.
•Temperature range, solvent and carrier gas compatibility
•Sample capacity versus resolution
– usually determines packed vs.. capillary
– GC’s usually setup for either packed or capillary
GC Column
Kolom Kapiler:
Resolusi lebih tinggi (R)
HETP dan N lebih besar
Waktu analisis lebih singkat
Sensitivitas lebih besar
Paling umum dalam instrumen GC laboratorium analitik
Kapasitas sampel lebih kecil
Biaya / kolom lebih tinggi
Kolom lebih rentan terhadap kerusakan
 
Packed Columns
Kapasitas sampel lebih besar
Biaya lebih rendah (bisa buat sendiri)
Lebih kasar
Paling umum di lab proses atau memisahkan / menentukan komponen utama dalam sampel
(persiapan GC)
Panjang terbatas mengurangi R dan N
Tidak kompatibel dengan beberapa detektor GC
Temperature Programming in GC
Cara "paling sederhana" untuk mengubah pemisahan dalam GC adalah dengan mengubah progra
m suhu dalam oven. dapat mengubah tekanan gas pembawa, tetapi ini jarang terjadi (banyak).
Isotermal = suhu konstan
Gradien = temperatur bervariasi
Dengan mengubah suhu, Anda memvariasikan laju reaksi untuk setiap analit:
mereka menghabiskan lebih banyak atau lebih sedikit waktu dalam fase diam
semakin besar perbedaan waktu antara analit, semakin baik pemisahannya
DETECTOR
The following devices are common types of GC detectors:
1. Thermal Conductivity Detector (TCD)
Proses
- mengukur sebagian besar properti fase gerak meninggalkan kolom.
- mengukur kemampuan untuk menghantarkan panas dari kabel panas (mis., konduktivitas termal)
- perubahan konduktivitas termal dengan adanya komponen lain dalam fase gerak
  2. Flame Ionization Detector (FID)
Proses
- mengukur produksi ion saat zat terlarut dibakar dalam nyala api.
- ion dikumpulkan di elektroda ke buat arus
3. Nitrogen-phosphorus Detector
Proses
- prinsip dasar yang sama dengan FID
- mengukur produksi ion ketika zat terlarut dibakar dalam nyala api
- ion dikumpulkan di elektroda ke buat arus
- mengandung sedikit logam alkali uap dalam nyala api
- meningkatkan pembentukan ion dari senyawa yang mengandung nitrogen dan fosfor
 
4. Electron Capture Detector (ECD)
Proses
- berdasarkan penangkapan elektron oleh atom elektronegatif dalam sebuah molekul
- elektron dihasilkan oleh ionisasi dari gas pembawa dengan sumber radioaktif
‚3H atau 63Ni
- dengan tidak adanya zat terlarut, aliran stabil elektron ini diproduksi
- elektron pergi ke elektroda kolektor di mana mereka menghasilkan arus
- senyawa dengan atom elektronegatif menangkap elektron, mengurangi arus
 
5. Mass Spectrometers
HPLC
 HPLC
 Teknik kromatografi yang mampu pisahkan campuran senyawa.

 Digunakan dalam iokimia dan kimia analitik untuk mengidentifikasi,

mengukur dan memurnikan komponen individu dari suatu campuran.

 Jenis kromatografi cair di mana sampel dipaksa melalui kolom yang d

ikemas dengan fase diam yang terdiri dari partikel berbentuk bola ata

u tidak teratur, lapisan monolitik berpori, atau membran berpori oleh c

airan (fase gerak) pada tekanan tinggi.

 1. DEFINISI dan SEJARAH

 Kromatograficair: Dapat menganalisis berbagai senyawa yang dapat l

arut dalam fase gerak, analit nonvolatile hingga yang mudah terdekom
posisi.
 Kromatografi: metode fisik yang memisahkan tempat komponen antar
a fase fase astasi dan fase bergerak
 • Fase diam: Substansi di mana penyerapan alyte (substansi yang dipi
sahkan selama kromatografi) berlangsung. Dapat berupa kombinasi p
adat, agel, atau cairan padat
 • Fase mobil: pelarut yang membawa analisis (aliquidoragas)
 2. PRINCILPE

 Kromatografi cair adalah teknik pemisahan yang melibatkan:

penempatan (injeksi) sejumlah kecil sampel cairan ke dalam tabung yang berisi
partikel berpori (fase diam) dimana komponen individu dari sampel diangkut se
panjang tabung dikemas (kolom) oleh cairan yang digerakkan oleh gravitasi.

 Prinsip utama pemisahan adalah adsorpsi.

 3. JENIS HPLC

a. Berdasarkan Mode Pemisahan

Kromatografi Kromatografi
Fase Normal Fase Terbalik
b. Berdasarkan Prinsip Pemisahan

Kromatografi Kromatografi Kromatografi

Adsorpsi Pertukaran ion Pasang anion
Kromatografi Kromatografi Kromatografi
Permeasigel Affinitas Kiral
c. Berdasarkan Teknik Elusi

Elusi Elusi
Isokratik Gradien
d. Berdasarkan Skala Operasi

HPLC Analitik

HPLC Preparatif
e. Berdasarkan Tipe Analisis

Analisis
Kualitatif Analisis
Kuantitatif
Instrumentasi dan Pemecahan
Masalah HPLC
 Solvent reservoir
 Solvent degasser
 Mixing unit
 Pump
 Injector
 Column
 Detector
 Data processor and
display
 1. Instrumentasi HPLC
 Fase gerak pada HPLC mengacu pada pelarut yang digunaka
n secara kontinyu terhadap kolom atau fase diam
 Fase gerak sebagai pembawalarutansampel
 Larutan sampel diinjeksikan kedalam fase gerak melalui portinj
eksi
 Larutan sampel mengalir melalui kolom bersama fase gerak ,k
omponen dalam larutan bermigrasi sesuai dengan interaksi no
n-kovalen senyawa dengan kolom
 2. Pemilihan Fase Gerak
 Perlu mengetahui terlebih dahulusis temkromatografi apa, krom

atografi didasarkan pada jenis dan sifat dari solute yang akan d

ianalisis. Pemilihan fase gerak untuk kromatografi fase terbalik

didasarkan pada hokum Snyder.

 Menurut Snyder solven atau pelarut dapat diklasifikasikan menj

adi tujuh golongan berdasarkan keasaman, kebasaan ,momen

dipol, dan sifat kimianya.

Dalam praktek tidak semua solven tersebut dapat dipakai karena
beberapa alasan, antaral lain:

•Tidak semua dapat dicampur pada berbagai perbandingan

•Menimbulkani nteraksi kimia
•Mengganggusinyal detector, seperti dapat menyerap UV
•Viskositas sangat tinggi
•Toksik dan mudah terbakar
•Tekanan uap terlalu tinggi
•Toksik dan mudah terbakar
Cara menghilangkan gas pada fase gerak

–Sonikasi
–Memberikan tekanan parsial saat agitasi
–Diberi gas helium
–In-line degasser
Aplikasi HPLC
Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
HPLC
Identifikasi puncak

Injeksikan larutan standar dibawah kondisi yang sama

dengan sampel,dan membandingkan factor retensi (k)

dan respon dari puncak pada kromatogram dari larutan

standar dengan sampel

Analisis Kuantitatif HPLC

• Ketahui senyawa yang Anda analisis

• Tetapkan metode untuk menganalisis sampel yang
mengandung senyawa ini
• Menganalisis sampel yang mengandung
konsentrasi yang diketahui (standar) dari senyawa
untuk mendapatkan respons karena konsentrasi itu
• Menganalisis sampel yang mengandung
konsentrasi senyawa yang tidak diketahui untuk
memperoleh respons karena konsentrasi yang tidak
diketahui
• Membandingkan respons konsentrasi yang tidak
diketahui dengan respons konsentrasi (standar)
yang diketahui untuk menentukan berapa banyak
senyawa yang ada
STANDAR EKSTERNAL
 Dasar dari prosedur kuanatifikasi dimana pengukuran kalibrasi

danun known sample dianalisi pada kondisi yang sama dan

terpisah satu sama lain.

 Metode Standar eksternal adalah teknik yang paling banyak

dan sering digunakan untuk memeroleh informasi kuantitatif

dari kromatogram.
 Pada kasus ini,standar murni komponen (senyawa yang sama

dengan yang ingin ditetapkan didalam sampel) diinjeksikan dalam

suatu deret standar yang dinaikkan konsentrasinya dan luas area atau

tinggi peak yang diperoleh diplotkan terhadap konsentrasi

(kurvakalibrasi).

 Kurva kalibrasi ini harus menunjukkan suatu hubungan yang linear

STANDAR INTERNAL
STANDAR INTERNAL
 Sejumlah senyawa yang sudah diketahui,yang berb

eda dengan analit,dan ditambahkan kedalam unkn

own sample.

 Standar internal dilakukan dengan menambahkan s

ejumlah komponen yang diketahui yang berfungsi s

ebagai factor normalisasi

STANDAR ADISI
 Suatu analit dengan gradient konsentrasi ditambahkan

kesampel.

 Sinyal analit yang diketahui ini diukur untuk membantu

menentukkan konsentrasi dalam sampel asli.