Aspek Praktis Mengenai Teori HPLC

Penulis:
Raymond J. Weigand

Alltech Associates, Inc.

2051 Waukegan Road • Deerfield, IL 60015
Phone: 1-800-ALLTECH • Web Site:
www.alltechweb.com
Definisi Kromatografi
Kromatografi adalah proses pemisahan dimana secara fisika berarti
ditujukan untuk mendistribusikan komponen sampel pada fasa diam
dan fasa gerak. Proses ini terjadi sebagai hasil dari beberapa langkah
absorbsi-disorbsi selama perjalanan sampel melalui fasa diam (kolom).
Proses pemisahan dapat berlangsung disebabkan perbedaan koefisien
distribusi dari komponen sampel.

1 2 3 4
Void Volume (Vo)

Mari kita lihat bagaimana aspek teoritis HPLC dapat digunakan dalam
praktek yang sesungguhnya.

Konsep Void Volume:

• Zat sampel yang terlarut dibawa kedalam kolom melalui fasa
gerak.
• Waktu elusi sampel bergantung pada daya tangkap dari fasa
diam.
• Sampel yang tidak tertangkap oleh fasa diam akan keluar dari
kolom dengan kecepatan setara fasa gerak.
• Sampel akan terelusi ketika fasa gerak dalam kolom telah
tergantikan sepenuhnya oleh fasa gerak baru.
• volume ini sama banyaknya dengan volume fasa gerak didalam
kolom yang tidak terjerat pada packing material (volume yang
mengisi ruangan kosong kolom).
• void volume berpengaruh sebagai poin penentu untuk 2
parameter uji, yaitu capacity factor dan selectivity.
Bagaimana Praktek Sesungguhnya dari Void
Volume?
• Void volume digunakan untuk menentukan integritas dari
packed bed
• Void volume ditentukan dengan menginjeksikan komponen yang
tidak teretensi dan menentukan volume ketika dia terelusi.
• Bila void volume berubah, peak symmetry dapat terpengaruh.
Capacity Factor (k’)
• Ketika berada di dalam kolom, komponen yang teretensi akan
terikat pada fasa diam dalam waktu tertentu (tR)dan berada dalam
fasa gerak dalam waktu tertentu juga.
• Ketika berada dalam fasa gerak, sampel bergerak dengan
kecepatan yang sama dengan fasa gerak.
• Hal ini berarti semua komponen zat uji menghabiskan waktu yang
sama dengan fasa gerak. (to)
• Jumlah waktu yang digunakan sampel untuk terjerat pada fasa
diam adalah sama dengan tR- to(penyesuaian waktu retensi, t’R)
• Rasio t’R/ to adalah kapasitas kolom untuk meretain sampel (k’).
tR
to t’R

k’ = (tr - t0) / t0
k’ = (t’r ) / t0
Inject

Unretained
Solute

Syarat : > 2
Apa yang Menyebabkan Perubahan Capacity Factor?

Perubahan capacity factor dijelaskan sebagai berikut:

• Perubahan kepekatan fasa gerak
-Dapat menyebabkan evaporasi salah satu dari komponen fasa gerak
• Kontaminasi pada tempat terjadinya ikatan kimia
-Sampel yang terikat kuat pada fasa diam dapat mengurangi jumlah
sisi ikatan yang kosong dan menurunkan kapasitas kolom untuk
meretensi sampel lain
-Penggunaan guard kolom dapat meminimalisasi hal tersebut
-Regenerasi kolom dapat membantu mengembalikan kapasitas
kolom
• Hilangnya sisi ikatan kimia
-Fasa gerak yang keras (pH terlalu tinggi atau terlalu rendah) dapat
menyebabkan hilangnya rantai kimia kolom atau endcapping
-Hal ini sering mengakibatkan perubahan selektifitas.
Uji Pengetahuan Anda…

Berikut adalah dua kromatogram yang dihasilkan dengan kolom yang

sama dengan jangka waktu beberapa minggu. Perhatikan reduksi pada
Capacity Factor untuk peak terakhir. Kira-kira apa yang terjadi dengan
kolom ini?

9261

Initial

Column: 150x4.6mm Alltima C18, 3um column

Mobile Phase: ACN:Water (58:42)
Flowrate: 1.0mL/min.
Column Temp: ambient
Detector: UV at 254nm

Final 1. Uracil
9262 2. Phenol
3. N,N-Diethyl-m-Toluamide
4. Toluene
Column Efficiency (N)
• Sampel yang melewati kolom terekam dalam bentuk pita sempit.
• Masing-masing pita melebar sebagaimana pergerakan sampel
didalam kolom yang disebabkan oleh difusi dan efek transfer massa
• Pita sampel yang terelusi kemudian akan semakin melebar
• Bentuk peak mengikuti distribusi Gauss

to
t1
t2

Pita yang melebar terkadang mengakibatkan peak bersatu ke baseline.

Kita harus meminimalisasi pelebaran tersebut sebisa mungkin.
PROSES KROMATOGRAFI

Alasan utama mengapa pita melebar ketika sampel berjalan melewati kolom
Penjelasan Gambar

• Sampel yang terelusi lebih dahulu adalah sampel yang terikat paling lemah
dengan fasa diam dan terbawa paling mudah dengan fasa ferak.
• Sampel yang terelusi kemudian semakin meningkat kekuatannya terikat
dengan fasa gerak dan menurun kekuatan ikatannya dengan fasa gerak.
• Oleh karena itu faktor transfer massa oleh fasa gerak semakin menurun
pengaruhnya dari sampel yang terelusi pertama dengan selanjutnya, kebalikan
dengan faktor transfer massa oleh fasa diam.
• Fasa gerak yang pegerakannya stagnan (tetap), memerlukan waktu yang
berbeda untuk mengelusi sampel dengan bentuk molekul yang berbeda.
• Ketiga pengaruh ini (faktor transfer massa fase gerak, faktor transfer massa
fase gerak yang stagnan, dan faktor tansfer massa fasa diam membuat sebuah
komponen sampel berbeda bentuk rekamannya. Sampel dengan pengaruh
faktor transfer fasa gerak stagnan dan fasa diam yang besar akan lebih lebar
pitanya.

MENGAPA??
JAWABAN

Semakin lama terikat dengan fasa diam dan semakin susah terelusi
oleh fasa gerak yang stagnan, sebuah komponen akan terdeteksi oleh
detektor lebih lama dari jumlah kecil--membesar--mengecil lagi (terikat
sedikit—banyak--perlahan-lahan terelusi lagi), terdeteksi dengan
intensitas rendah—semakin tinggi—menurun lagi. Membantuk peak
lebar.

Semakin sedikit bertemu dan teretensi oleh fasa diam, sebuah

komponen akan terdeteksi dalam waktu yang singkat—lalu langsung
lepas lagi, sehingga detektor memberikan respon secara singkat juga,
menghasilkan peak yang tajam
Siapa sebenarnya Gauss??
• Seorang ahli matematika German yang sangat
berpengaruh dalam setiap cabang ilmu
matematika dan fisika

• Mengembangkan “Teorema Dasar Algebra”

• Orang pertama yang menemukan geometri non-
Euclidian
Karl Friederich Gauss 1777-1855
• Mengembangkan “Teorema Bilangan Prima”

• Membantu ahli astronomi menemukan asteroid, Ceres, dan menemukan

metoda menghitung orbit astronomis

• Melakukan riset lanjutan terhadap teori kemagnetan, dimana unit dasar

magnet dinamakan sesuai namanya, Gauss.

• Mengembangkan metoda “Least Squares Analysis” dan hukum dasar

mengenai probabilitas distribusi. Kurva distribusi normal dinamakan
berdasarkan namanya.
Siapa sebenarnya Gauss??

Menemukan cara baru untuk menjumlahkan angka yang berurutan (sebelum

ia berumur 10 tahun!)

1
+2
+3
+4
+5
15
Siapa sebenarnya Gauss??

Menemukan cara baru untuk menjumlahkan angka yang berurutan (sebelum

ia berumur 10 tahun!)

1 1 + 2 + 3 + 4 +…+ 50
+2 100 + 99 + 98 + 97 +…+ 51
+3
+4
+5
15
Siapa sebenarnya Gauss??

Menemukan cara baru untuk menjumlahkan angka yang berurutan (sebelum

ia berumur 10 tahun!)

1 1 + 2 + 3 + 4 +…+ 50
+2 100 + 99 + 98 + 97 +…+ 51
+3 101 + 101 + 101 + 101+…+101
+4
+5
15
Siapa sebenarnya Gauss??

Menemukan cara baru untuk menjumlahkan angka yang berurutan (sebelum

ia berumur 10 tahun!)

1 1 + 2 + 3 + 4 +…+ 50
+2 100 + 99 + 98 + 97 +…+ 51
+3 101 + 101 + 101 + 101+…+101
+4
+5 101
15 X 50
5050
Addition of the numbers from 1 to 100 equals 5050!!
Column Efficiency (N)
Ketajaman dari peak yang terbentuk mengindikasikan kualitas dari
sebuah kolom HPLC.

• Ketajaman peak ditentukan dari perhitungan lebar peak

• Lebar peak bergantung pada laju aliran, sehingga tidak cukup
hanya memperhitungkan kelebarannya saja.
• Penentuan column efficiency yang baik adalah tR/Wb

Persamaan column efficiency yang diterapkan dalah N =

16(tR/Wb)2
Penerapan Penetapan Column Efficiency Secara
Praktis

Pengurangan efisiensi dari sistem HPLC dapat disebabkan oleh:

• Column voids atau berongga-rongga

• Kontaminasi pada sisi ikatan kimia kolom (hal ini dapat
mengakibatkan perubahan selektivitas dan capacity factor)
• Adanya volume tertinggal kolom

Hilangnya efisiensi sistem mengakibatkan perubahan fisika pada

sistem HPLC. Kolom mungkin dapat rusak (voids, rongga-rongga, atau
kontaminasi) atau anda tidak tahu adanya volume tertinggal kolom
dalam sistem. Monitoring efisiensi sistem dapat membantu anda
menemukan pemecahan masalah.
Peak Tailing (As)

Sebuah kolom HPLC yang baik akan memberikan bentuk kolom yang
simetris atau sesuai hukum Gauss. Perubahan-perubahan dalam
integritas fisika dan kimia dari packing kolom dapat menyebabkan peak
tailing.

As = W0.05/ 2f

f
W0.05

Tailing dapat disebabkan oleh:

• Column voids, rongga-rongga, atau volume kolom tertinggal
(berpengaruh paling besar terhadap peak yang terbentuk paling awal)
• Pemangkasan ikatan rantai karbon pada silika (berpengaruh paling besar
terhadap peak yang terbentuk paling akhir)
Uji Pengetahuan Anda

Masalah apa yang terjadi pada sistem HPLC yang menunjukkan

hal-hal berikut:

• Peningkatan void volume (V0)

• Penurunan column efficiency (N) untuk semua komponen
• Peningkatan tailing (As) untuk komponen yang terelusi paling awal?

Bagaimana tentang sistem yang memperlihatkan:

• Tidak ada perubahan pada void volume
• Penurunan capacity factor (k’) untuk larutan netral
• Penurunan column efficiency (N) untuk analit yang polar
• Kenaikan tailing (As) untuk komponen yang terelusi kemudian?
Separation Factor ( )

Karena pada umumnya kita biasa mengerjakan sampel yang

mengandung lebih dari satu zat aktif, Because we are usually dealing
with samples that contain more than one sample component, suatu
studi tentang pemisahan peak sangat diperlukan.

• Separation factor menjelaskan posisi relatif antara dua peak

• Hal ini sama dengan rasio dari waktu retensi masing-masing
komponen yang melewati fasa diam
t’R(B) / t’R(A)

Persamaan ini sering disebutkan juga sebagai rasio capacity factor

antara dua komponen
k’(B) / k’(A)
Separation Factor ( )

Separation factor, atau biasa disebut juga sebagai column selectivity,

dipengaruhi oleh perubahan kimia dari suatu metoda kromatografi,
seperti:

• Perubahan pemilihan komponen fasa gerak

• Perubahan jenis kolom

Dalam kondisi asam yang kuat, ikatan kimia dalam kolom C18 lama-
kelamaan akan mengalami hidrolisis. Bagaimana dengan column
selectivity?

Bagaimana bila sampel bersifat netral?

Bagaimana bila sampel bersifat polar?
Resolusi (Rs)

Resolusi adalah tujuan akhir dari semua metoda analitik. Persamaan

dibawah menunjukkan bagaimana resolusi (Rs) bergantung pada
Capacity Factor (k’), Column Efficiency (N), dan Separation Factor (  ).

Rs = 1/4 ( k
k +1 )( N )( -1
 )
Resolusi (Rs)

Capacity Factor,
Efficiency, dan
Selectivity adalah tiga
Initial Separation
faktor yang mengontrol
resolusi.
Memahami tentang faktor
yang mempengaruhi
Vary k
ketiga hal diatas dapat
memecahkan masalah
mengenai masalah
pemisahan peak.
Vary N

Vary alpha

time
How Smart Are You??
Masalah yang terjadi dibawah ini adalah tentang Capacity Factor,
Efficiency, atau Selectivity? Apa yang terjadi pada sistem sehingga
terjadi perubahan seperti itu? Bagaimana cara memperbaikinya?

9263

Column: 150x4.6mm Spherisorb ODS-2 5um

Mobile Phase: ACN:20mM Potassium Phosphate
buffer pH 7.0 (65:35)
Flowrate: 1.0mL/min.
Column Temp: 30C
Detector: UV at 254nm

1. Uracil
2. Phenol
3. N,N-Diethyl-m-Toluamide
4. 3-Butylpyridine
9264 5. 4-Phenylbutylamine
6. Propylbenzene
7. Butylbenzene
Plat Teoritis

Plat teoritis adalah banyaknya permukaan kolom tempat terjadinya

interaksi kimia yang dilalui oleh fasa gerak.

Semakin besar nilai plat teoritis berarti kolom tersebut semakin efisien,
artinya, banyak bagian kolom yang dilalui oleh fasa gerak, sehingga
kemungkinan terjadinya interaksi kimia semakin besar.

Plat teoritis yang nilainya semakin kecil setelah lama dipakai

menandakan bahwa banyak tempat di permukaan material kolom tidak
bisa dilalui fasa gerak, mungkin ada penyumbatan, rusaknya silika
(larut), dsb.

Nilai plat teoritis yang rendah mengakibatkan suatu metoda analisis

tidak dapat dinilai validitasnya, sehingga untuk keperluan validasi
metoda hendaknya memakai kolom yang performanya masih baik.
 TERIMA KASIH

SAMPAI JUMPA PADA TRAINING

BERIKUTNYA !