KLT

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di

laboratorium kimia.

Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk
pemisahan analitik dan preparatif.

Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan dan
kromatografi preparative hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran.

Pemisahan secara kromatografi dilakukan juga diperlukan fraksi murni dari campuran.

Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat
fisika umum dari molekul.
Sifat utama yang terlibat ialah:

(1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam

cairan (kelarutan),

(2) Kecenderungan molekul untuk melekat pada

permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan)

(3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau

berubah ke keadaan uap (keatsirian).
 Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan
terutama dilakukan dengan menggunakan salah
satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan
teknik tersebut.

Keempat teknik kromatografi itu adalah:

Kromatografi Kertas (KKt),

Kromatografi Lapis Tipis (KLT),

Kromatografi Gas Cair (KGC),

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

• Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung
pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan
dipisah. KKt dapat digunakan terutama bagi kandungan
tumbuhan yang mudah larut dalam air (karbohidrat, asam
amino, dan senyawa fenolat),
• KLT merupakan metode pilihan untuk

KLT pemisahan semua kandungan yang larut lipid

(lipid, steroid, karotenoid, dan klorofil),

• KGC penggunaannya terutama untuk minyak

KGC atsiri (asam lemak, mono- dan seskuiterpen,

hidrokarbon, dan senyawa belerang),

• cara lain yaitu KCKT, dapat memisahkan

KCKT kandungan yang keatsiriannya kecil. KCKT

adalah suatu metode yang menggabungkan
keefisien kolom dan kecepatan metode analisis.
 METODE ISOLASI
• Metode pemisahan dan pemurnian
kandungan tumbuhan terutama dilakukan
dengan menggunakan salah satu dari empat
teknik atau gabungan teknik tersebut.
 Kromatografi dapat digolongkan :
• 1. Berupa zat padat (Kromatografi serapan (Adsorption
Berdasarkan sifat-sifat dari Chromatography )
fasa tetap : • 2. Berupa zat cair (Kromatografi partisi ( Partition Chromatography )

Berdasarkan fasa gerak yang dapat berupa zat cair atau

gas maka ada empat macam sistem kromatografi :
• Dikenal sebagai kromatografi serapan yang meliputi :
1. Fasa gerak zat cair, • - Kromatografi Lapis Tipis : KLT : TLC
fasa tetap padat : • - Kromatografi Penukar Ion : IEC :Ion Exchange Chromatography

• Kromatografi Gas Padat : GSC : Gas Solid Chromatography

2. Fasa gerak gas, fasa
tetap padat :
• Dikenal sebagai Kromatografi Partisi
3. Fasa gerak zat cair, • Kromatografi Kertas : K Kt : PC : Paper Chromatography
fasa tetap zat cair :
• Kromatografi Gas-Cair : GLC : Gas Liquid Chromatography
4. Fasa gerak gas, fasa • Kromatografi Kolom Kapiler
tetap cair :
 PRINSIP UMUM
Pola elusi kromatografi
• Sejumlah sampel yang dilarutkan dalam fasa gerak, dituangkan pada puncak kolom
atau awal elusi, dengan segera terdistribusi diantara kedua fasa gerak dan fase
diam. Dengan tambahan fasa gerak (eluen), solven yang mengandung sebagian
dari sampel akan terdesak ke bagian fase diam atau kolom yang lebih bawah, dan
akan terjadi distribusi baru antara fasa gerak dan fasa diam baru.
• Dalam waktu yang bersamaan, distribusi baru juga terjadi pada puncak kolom atau
dari awal penotolan antara fasa gerak baru dengan fasa diam yang telah
mengandung sebagian sampel. Karena solut hanya dapat bergerak dengan fasa
gerak, rata-rata kecepatan migrasi solut tergantung pada fraksi waktu pada saat
solut berada dalam fasa gerak. Apabila solut mengalami retensi pada fasa diam,
fraksi waktu ini akan lebih kecil bila dibandingkan terhadap solut yang tidak
mengalami retensi. Perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing solut dalam
campuran menyebabkan terjadinya pemisahan campuran menjadi pita-pita solut
sepanjang kolom atau noda sepanjang fase diam.
• Proses terbawanya solut dari puncak kolom atau awal penotolan sampai akhir
kolom atau akhir perjalanan eluen disebut Elusi.
 Koefisien partisi atau konstanta
distribusi
• Apabila solut masuk dalam sistem kromatografi, segera akan terdistribusi
diantara fasa diam dan fasa gerak. Bila alir fasa gerak dihentikan, akan terjadi
keseimbangan diantara kedua fasa, dan perbandingan konsentrasi pada tiap fasa
dapat digambarkan sebagai Koefisien Partisi ( K ) :

Cs
K = ────
Cm

• Koefisien partisi ini disebut juga Konstanta Distribusi. Cs dan Cm adalah

konsentrasi solut dalam fasa diam dan fasa gerak. Koefisien partisi
menggambarkan kecepatan rata-rata tiap solut pada waktu fasa gerak bergerak ke
ujung kolom. Pada keadaan ideal, harga rasio partisi konstan untuk kisaran
konsentrasi yang luas, sehingga Cs proporsional terhadap Cm dan korelasi antara
keduanya membentuk kurva garis lurus.
• Bila harga K besar berarti populasi dalam fasa diam lebih besar daripada populasi
dalam fasa gerak, sehingga rata-rata molekul menghabiskan waktunya lebih lama
di dalam fasa diam.
 Retensi solut
Retensi menunjukkan adanya distribusi solut antara
fasa gerak dan fasa diam. Volume fasa gerak yang
dibutuhkan untuk membawa pita solute dari titik
injeksi / permulaan kolom, melalui kolom,
didefinisikan sebagai Volume Retensi ( retention
volume = VR ).
VR = tR. Fc
tR adalah waktu retensi, Fc adalah kecepatan
alir volumetric yang dinyatakan dengan volume fasa
gerak persatuan waktu.
Rasio partisi atau faktor kapasitas
• Rasio kapasitas didefinisikan sebagai rasio jumlah solut dalam fasa
diam terhadap jumlah solut dalam fasa gerak.

Cs Vs Vs
K’ =  = K 
CMVM VM

Rasio kapasitas juga dapat dinyatakan sebagai rasio waktu yang dibutuhkan untuk elusi
solut dalam kolom terhadap waktu yang dibutuhkan untuk elusi solut tak ditahan
kolom.

Jika harga K’  10, membutuhkan waktu analisis yang lama, sedangkan bila harga K’ 
1, solut yang segera terelusi keluar kolom, tidak terpisah.

Fraksi waktu tinggal solut dalam suatu fasa hampir sama bagi seluruh molekul solut
yang pada waktu itu berada bersamaan dalam salah satu fasa, oleh karena itu rata-rata
fraksi waktu tinggal solut dalam fasa gerak :
•
• CM VM 1
•  = 
• CM VM + Cs Vs 1 + K’
•
• Sedangkan waktu tinggal solut dalam fasa
diam :
• Cs Vs K’
•  = 
• CM VM + Cs Vs 1 + K’
 Retensi relatif

Retensi relatif (  ) antara dua solut, solut 1 yang terelusi sebelum

solut 2, dapat dinyatakan dengan berbagai tetapan

• V’ R,2 t’ R,2
•  =  = 
• V’ R,1 t’ R,1
• VR,2 - VM,2 tR,2 - tM,2
• =  = 
• VR,1 - VM,1 tR,1 - tM,1
•
• Retensi relatif tergantung pada :
a. sifat fasa gerak dan fasa diam
b. temperatur kolom pada waktu bekerja
—Totolan bercak sekecil mungkin
—Biasanya 1- 2 mm, totolan besar: bercak menyebar dan bertumpuk
—Digunakan pelarut sampel yang bisa melarutkan sampel dengan baik,
tetapi mudah menguap dan daya elusinya kecil
—Secara manual/otomatis
—Dapat digunakan pipa kapiler, mikropipet, mikrosiring
 1. KROMATOGRAFI KERTAS
• Pada kromatografi kertas sistem partisi sebagai fasa pendukung dipakai
kertas saring biasa atau kertas Whatman.
• Jadi faktor yang bekerja pada kromatografi kertas adalah pembagian/partisi
antara fasa stasioner yang terdiri dari kompleks air-selulosa dan fasa mobil
(cairan penghantar).
• Pada kromatogarfi kertas, serat-serat selulosa mempunyai afinitas yang kuat
terhadap air, maka air akan diikat sebagai fasa stasioner.
• Fasa mobil akan mengalir melalui kertas yang mengandung zat tersebut;
maka akan terjadi pembagian zat itu antara fasa mobil dengan fasa
stasionernya.
• Dalam pengalirannya bila fasa mobil tiba pada kertas/bagian kertas yang
tidak/belum mengandung zat, maka akan terjadi pembagian; yaitu
pembagian zat yang terlarut dalam pelarut organik (fasa mobil) akan pindah
ke fasa stasioner.
• Proses ini berlangsung terus-menerus selama fasa mobil mengalir, sehingga
akan terjadi perpindahan zat dari titik asalnya ke suatu titik tertentu
menurut arah pengaliran fasa mobil.
 Dengan demikian akan terjadi pemisahan dari
zatnya. Supaya terdapat pembagian yang ideal,
maka harus memenuhi syarat :

zat yang melarut tidak boleh

teradsorpsi oleh fasa pendukung.

b. koefisien pembagian zat itu tidak

boleh dipengaruhi oleh konsentrasinya
atau adanya zat-zat lain.
Analisis pembagian secara kromatografi
kertas secara singkat dilakukan sebagai
berikut :
• Campuran zat yang akan diperiksa dilarutkan
dalam pelarut (sebaiknya yang mudah
menguap)
• - Larutan zat itu diteteskan pada kertas
• - Elusi dalam kolom dan sesudah kering
difiksasi / dicelupkan dengan suatu pereaksi
tertentu ataupun secara fisika.
Pembagian kromatografi kertas

• satu dimensi dan

Berdasarkan
dimensinya : • dua dimensi

Berdasarkan • * cara menurun

jalannya elusi • * cara mendatar /
: * cara menaik sirkuler
 Kromatografi Kertas Menaik (
Ascending Methods )
• . Satu dimensi
• Cara ini paling banyak dipakai dalam praktek. Kita ambil kertas saring/Whatman
panjang  30 cm lebar 5 – 6 cm. Pada jarak 2,5 – 3 cm dari ujung bawah dibuat
garis dengan pensil. Pada jarak 2 cm ditotolkan zatnya dengan pipa kapiler dimana
ø tak boleh  3 mm. Elusi dalam kolom tertutup (yang telah dijenuhkan) dengan
zat pengelusi tertentu sampai batas permukaan tertentu ( ¾ x panjang kertas).
Keringkan, fiksasi/ dengan sinar UV.
• Kebaikan :
• Untuk pemeriksaan pendahuluan dapat dicobakan dengan memakai tabung yang
kecil dan untuk menjenuhkan diperlukan waktu yang relatif singkat.
• Keburukan :
• Larutan elusi kadang-kadang hanya dapat naik sampai 25 cm, karena gravitasi
bumi, dimana kadang-kadang kita memerlukan jarak  25 cm, sebab harga Rf dua
zat yang hampir bersamaan akan terdapat noda-noda yang belum terpisah betul,
maka dilakukan lebih lanjut dengan kromatografi dua dimensi.
 Kromatografi Kertas Menaik (
Ascending Methods )
• Dua dimensi
• Digunakan bila dengan cara satu dimensi pemisahan zat tidak sempurna karena
harga Rf dari zat-zat itu hampir sama nilainya.
• Banyak dipakai untuk asam-asam amino yang difiksasi dengan ninhidrin.
• Pada kromatografi menurun dari dua zat yang berdekatan ( Rfnya) mungkin masih
dapat dipisahkan dengan mengelusi terus, tetapi pada cara menaik hal ini tidak
mungkin tercapai karena jarak yang ditempuh oleh zat cair penghantar dibatasi
oleh gaya gravitasi bumi.
• Dalam hal demikian untuk memisahkan campuran dapat digunakan Kromatografi
Dua Dimensi, elusi dilakukan dua kali berturut-turut. Arah elusi kedua diambil
tegak lurus pada arah elusi pertama, sedangkan zat cair penghantar untuk kedua
elusi tidak sama satu sama lain.
• Misal : Campuran yang hendak dipisahkan ( A+B+C ) ditotolkan pada tempat x.
Elusi dengan zat penghantar EI → didapat komponen A dan B yang belum terpisah
karena harga Rf yang berdekatan dengan eluen ini, sedangkan C sudah terpisah
sempurna. Maka dielusi sekali lagi dengan zat cair penghantar EII (eluen II).
Supaya terpisah A dari B harus dipisahkan sedemikian rupa eluennya sehingga
harga Rf A tidak berdekatan dengan Rf zat B.
• Kromatografi Kertas Menurun ( Descending Method )
• Prinsip sama dengan kromatografi menurun, hanya larutan
elusi dijalankan dari atas ke bawah dengan alat khusus.
•
• 3. Kromatogarfi Kertas Mendatar / Sirkuler
• Dengan cara ini dipakai suatu kertas yang bulat dan
ditengahnya diberi lubang tempat untuk meletakkan sumbu
yang terbuat dari gulungan kertas dimana melalui ini pelarut
dapat naik, yang kemudian membawa kertas, untuk
kemudian mengembang melingkar membawa senyawa yang
dipisahkan.
• Kesukaran larutan eluen bergerak kurang cepat, untuk
mengatasi ini larutan eluen diteteskan dari atas.
• Menentukan noda :
• · bila dipakai satu pereaksi warna maka seluruh kertas disemprot
• · bila dipakai beberapa pereaksi, gunting menjadi beberapa sektor,
masing-masing sektor disemprot dengan berbagai pereaksi
• Kebaikan :
• a. Kerja cepat dan rapih, untuk kertas ø 20 cm dalam waktu 2 jam,
kertas ø 32 cm dalam waktu 4 – 5 jam.
• b. Pemisahan zat-zat lebih jelas dari cara 1 dan 2.
• c. Dapat dipotong-potong menjadi sektor.
• d. Masing-masing pereaksi dapat dipakai sekaligus.
• e. Dapat untuk menentukan secara kuantitatif.
 Fase Diam
• Kertas terdiri dari serat-serat selulosa yang mengandung “kotoran” tergantung dari
jenis kertasnya. Misalnya kotoran yang berupa ion logam ( Ca2+, Mg2+, Fe3+, Cu2+,
dll ) Dapat mengganggu karena terjadi pertukaran ion. Kertas yang khusus dibuat
untuk kromatografi telah mengalami proses-proses pemurnian, misalnya pencucian
dengan HCl dan lain-lain untuk menghilangkan ion-ion logam. Adapula pada
pembuatannya, kertas itu serat-serat selulosanya tersusun menurut arah tertentu.
Pada kartas kromatografi sering tanda ( → ) untuk menunjukkan arah elusi. Elusi
sebaiknya dilakukan menurut arah panah itu ( arah serat ) supaya diperoleh noda-
noda yang lebih nyata.
• Kertas kromatografi banyak jenisnya. Aliran pelarut (eluen) pada kertas pada suhu
tertentu dipengaruhi oleh kerapatan atau ketebalan kertas.

• Kertas antara lain mempengaruhi :

• 1. baik tidaknya pemisahan

• 2. jelas atau tidaknya noda
• 3. pembentukan “ekor” noda
• 4. kecepatan mengalir pelarutnya
• 5. harga Rf
• Kertas yang banyak dipakai adalah kertas Whatman. Kertas Whatman No. 4
mempunyai karakteristik mirip seperti no.1, tetapi memberikan efek dua kali
lebih cepat. Kertas-kertas yang lebih tebal ( Whatman no.3 ) biasanya
digunakan untuk pemisahan jumlah yang lebih besar, karena mereka dapat
menempung lebih banyak “cuplikan” tanpa menaikkan area dari noda mula-
mula.
• Kertas disediakan dalam bermacam-macam standard, bulatan dan gulungan
dan dalam bentuk tertentu. Harus disimpan di tempat jauh dari setiap
sumber uap (terutama ammonia, yang mempunyai afinitas tinggi terhadap
selulosa ) dan jangan ditempatkan pada tempat yang mempunyai perubahan
kelembaban yang tinggi.
•
• Karakteristik dari kertas-kertas kromatografi
Tipe Kertas Kecepatan aliran
Cepat Sedang Lambat
Kertas No. 4 No.7 No.2
Tipis No.54 No.1 No.30
No.540
Kertas No.31 No.3
Tebal No.17 No.3 mm
 Adanya kertas yang dipakai harus

• didapar (buffer) dulu untuk

mendapatkan hasil yang lebih baik.
• kerapatan serat-serat Dapar / buffer yang biasa dipakai
adalah
• kecepatan mengalir (flow rate)
larutan elusi • sitrat-fosfat pH 8 - 9 untuk
• tebal kertas barbital
• kehalusan permukaan • fosfat pH 8 dan borat pH 8
• cara pembuatan dan
pemurnian

Perbedaan antara jenis-jenis kertas

terletak pada :
 Pelarut
Beberapa larutan elusi yang sering dipakai :
Golongan Larutan Elusi
Sulfa-sulfa, asam-asam organik, fenol Normal butanol 40 ml
NH4OH 10 ml
Aqua ad 100 ml
Kocok kuat-kuat dan diamkan beberapa jam, timbul 2 lapisan,
ambil lapisan n-butanolnya yang jenuh dengan NH4OH
Disebut Butanol/NH3/air

Asam-asam amino * Fenol/air larutan jenuh

* n butanol/asam cuka/air 4 : 1 : 5
* n butanol/asam cuka/air 12 : 3 : 5
* n butanol/piridin/air 1:1:1
Alkaloida Normal butanol 100
Asam cuka biang 10
Jenuhkan dengan air (penambahan air sedikit-sedikit sambil
dikocok sampai tampak adanya lapisan air di bawah)
Ambil bagian yang jernih

Karbohidrat * etil asetat/piridin/air 2:1:2

* etil asetat/n propanol/air 6 : 1 : 3
* etil asetat/asam cuka/air 3 : 1 : 3
Asam-asam lemak n butanol/1,5 M NH3 larutan jenuh

Fe, Cl, Br, I ( garam-garam Na ) Piridin/air 90 : 10

Hg, Pb, Cd, Cu, Bi (klorida-klorida) n butanol/3 M HCl larutan jenuh
Larutan elusi pada kromatografi pembagian umumnya terdiri dari 2 fase, yaitu
fasa air (stasioner) dan fasa mobil (pelarut organik). Pemilihan larutan elusi
ditentukan oleh banyak faktor, terutama oleh kelarutan zat yang diperiksa
dalam pelarut.

Perbandingan di atas menentukan harga Rf, makin besar perbedaan nilai

tersebut makin baik pemisahan. Kecepatan mengalir larutan elusi juga
berpengaruh. Umumnya larutan elusi yang lambat bergeraknya memberi
noda-noda yang jelas.

Rf terutama sekali dipengaruhi oleh koefisien pembagian itu, selain itu

dipengaruhi oleh temperatur / suhu, tekanan uap / kelembaban udara.
Selama elusi ruang kromatografi harus jenuh uap larutan itu, maka sebelum
elusi dimulai harus disediakan waktu untuk menjenuhkan ruangan itu dengan
uap larutan elusi. Temperatur selama elusi harus konstan. Karena dalam
praktek tidak selalu dapat diadakan pada keadaan-keadaan yang sudah
ditentukan, seringkali digunakan zat pembanding untuk membantu
identifikasi.
 Syarat larutan elusi :

tidak boleh bereaksi dengan zat

harus cukup stabil, sehingga waktu penguraian tidak mengalami perubahan

mudah menguap sehingga kertas mudah dikeringkan

viskosita tidak selalu besar sehingga pengaliran tidak terlalu lama

Sedangkan kecepatan merambat elusi selain tergantung pada viskosita juga

tergantung dari mutu kertas, berat jenis dan tegangan permukaan.
 Cara menyatakan noda ( pendeteksi )
Pada kromatografi dari zat yang tidak berwarna, maka
tidak akan tampak dimana letak noda setelah dielusi, untuk
mengetahui tempat nodanya dapat dipakai cara :

•
• a. Cara fisika
• Untuk zat-zat yang berfluoresensi dapat dilihat di bawah sinar UV
254 nm dan 366 nm, dimana nantinya akan nampak bintik-bintik
fluoresen.
•
• b. Cara kimia
• Kromatogram dikerjakan dengan pereaksi warna sehingga nampak
noda-noda berwarna.
•
• c. Cara mikrobiologi
• Terutama untuk menyatakan antibiotika dan vitamin.
• Dengan pereaksi warna :
• Banyak sekali pereaksi warna yang dapat dipakai untuk maksud ini, yang perlu diperhatikan :
•
• a. Kekhasan ( spesifisitas )
• Suatu pereaksi warna dapat memberi warna khas/spesifik dengan suatu warna tertentu. Tetapi banyak
pula pereaksi yang memberi warna sama dengan segolongan zat, untuk ini identifikasi didasarkan atas
harga Rf. Jadi secara umum untuk identifikasi suatu zat diperhatikan warna serta Rf nya.
• b. Kepekaan
• Untuk kebanyakan reaksi warna, penggunaannya pada kertas mengurangi kepekaan. Tetapi sebaliknya
ada pula kemungkinan bahwa warna yang diperoleh pada kertas lebih jelas dari warna pada reaksi
tetes.
• Cara mereaksikan :
•
• a. Dengan menyemprotkan ( spraying )
• Dengan suatu alat penyemprot, pereaksi disemprotkan pada kromatogram. Pereaksi jangan terlalu
berlebih karena dapat menyebabkan noda-noda kurang jelas kelihatan. Dianjurkan untuk
memperhatikan pada bagian belakang dari kertasnya ( jadi bagian yang tidak langsung berhubungan
dengan pereaksi ) karena seringkali memperlihatkan noda-noda yang lebih jelas.
• b. Dengan mencelupkan (dipping)
• Kromatogram dicelupkan dalam larutan pereaksi dan didiamkan selama waktu tertentu.Cara ini hanya
dapat dilakukan bila zat yang akan dinyatakan tidak larut dalam pereaksi tersebut. Sebelum
direaksikan dengan pereaksi (warna), kromatogram dikeringkan dulu. Pengeringan dilakukan pada
suhu kamar dan dapat juga dengan pemanasan setelah penambahan pereaksi, kadang-kadang perlu
pemanasan lagi agar noda-noda kelihatan lebih jelas, misalnya mendeteksi asam amino dengan
ninhidrin. Pada suhu kamar baru memberikan warna setelah kira-kira 24 jam. Tetapi pada pemanasan
pada kira-kira 100 0C warna akan timbul setelah kira-kira empat menit.
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Kromatografi Lapis Tipis ( KLT ) adalah suatu cara pemisahan yang berdasar pada
pembagian campuran dua senyawa dalam dua fasa dimana fasa gerak bergerak
terhadap fasa diam. Fasa diam berupa suatu bidang datar.

Kerugiannya :
• Pemisahan yang amat baik
(noda yang dipisahkan lebih
jelas dan terlokalisir) • Sukar dalam penyimpanannya
• Waktu yang diperlukan lebih • Ketelitian dan ketepatannya
singkat kurang baik
• Alat yang dipakai lebih
sederhana dan relative murah

Keuntungan dari
metode Kromatografi
Lapis Tipis adalah :
• Teori Kromatografi Lapis Tipis umumnya sama dengan teori dari kromatografi kolom.
Pada Kromatografi Lapis tipis derajad retensi dinyatakan sebagai faktor
penghambatan (“Retardation factor” = Rf)

Jarak gerakan zat terlarut fasa gerak


Jarak gerakan pelarut kedua fasa

Jarak gerakan pelarut diukur sampai bidang batas pelarut

Jarak gerakan zat terlarut diukur sampai tengah-tengah bercak atau titik kerapatan
maksimum
• Jarak lintasan yang ditempuh rata-rata molekul zat terlarut = kecepatan pelarut x
waktu yang dihabiskan dalam fasa gerak. Faktor penghambatan (Rf) dapat
dinyatakan sebagai perbandingan jumlah molekul dalam masing-masing fasa atau
sebagai pembagian zat terlarut antara dua fasa.
• Harga Rf merupakan bentuk modifikasi dari tetapan keseimbangan dan bergantung
pada ukuran-ukuran retensi seperti halnya pada kromatografi kolom.
• Nilai Rf dipengaruhi oleh beberapa variable seperti : penyerap, cara pengembangan,
ukuran dan kadar cuplikan, jarak perjalanan bercak serta macam eluen yang dipakai.
Oleh karena itu akan lebih baik jika digunakan nilai Rf relatif terhadap Rf baku yaitu
perbandingan jarak perjalanan yang ditempuh bercak sampel dengan jarak
perjalanan yang ditempuh zat baku dalam pengembangan yang sama.
 2. Teknis Eksperimental
a. Garis Besar Metoda
• Dibuat dahulu lapisan tipis dari bahan penyerap pada fasa pendukung yang inert (kaca). Serbuk bahan
penyerap yang halus dibuat bubur dengan air atau pelarut organik yang mudah menguap. Bubur tersebut
kemudian diratakan pada lempeng pendukung dengan suatu alat dan dengan ketebalan yang dapat
diatur. Sesudah kering lempeng lapis tipis tersebut diaktifkan dengan cara dipanaskan pada suhu 100 oC
selama paling sedikit 30 menit. Jika aktivasi telah dijalankan lempeng disimpan dalam eksikator, atau
tempat lain yang bebas dari kelembaban. Setiap kali akan digunakan lempeng sebaiknya diaktifkan lagi.
• Sampel dilarutkan dalam pelarut organik yang mudah menguap dan sesuai. Dengan pipet kapiler atau
pipet micrometer, larutan sampel ditotolkan sedikit-sedikit dengan bercak sekecil mungkin. Dibiarkan
kering sebentar, kemudian dimasukkan ke dalam bejana pengembangan yang telah dibuat jenuh dengan
uap pelarut pengembang/“solvent”. Fasa gerak dibiarkan mengembang dan sedudah mencapai batas
yang diinginkan lapisan tipis diambil dan dibiarkan kering, kemudian dilakukan penentuan lokasi dan
identifikasi bercak dengan cara kimia, fisika atau biologi.
•
• b. Fasa Diam
• Fasa diam yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis adalah bahan penyerap (“adsorbent”). Sifat
umum dari bahan penyerap untuk Kromatografi Lapis Tipis sama dengan yang digunakan untuk
Kromatografi Kolom. Dua sifat penting yang harus diperhatikan untuk Kromatografi Lapis Tipis adalah
besar/kecilnya (ukuran) serta homogenitasnya, sebab daya lekat pada pendukung sangat ditentukan oleh
kedua sifat tersebut. Partikel yang kasar tidak dapat memberikan pemisahan yang baik dan untuk
memperbaikinya dapat digunakan butiran yang halus. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25
mikron. Berbeda dengan tujuan untuk kromatografi kolom, dimana partikel yang kecil dan halus dapat
memperlambat aliran pelarut, sedang pada Kromatografi Lapis Tipis malahan akan mempercepat aliran
pelarut.
 Beberapa macam bahan penyerap yang digunakan dalam
Kromatografi Lapis Tipis :
• 1) Silika gel
• Paling banyak dipakai dan bersifat asam, zat pengikatnya untuk
memberikan kekutan pada lapisan dan menambah adisi pada gelas
penyokong, biasanya dalah Kalsium sulfat (CaSO4 ) = Plaster of Paris =
Gypsum.
• Dalam perdagangan biasanya silica gel telah diberi zat pengikat misalnya
Silica gel “G” Merck. Suspensi silica gel yang “G” telah dicampur dengan air
harus dipakai paling lambat 3 – 4 menit sesudah dibuat. Disamping Kalsium
sulfat (CaSO4) semihidrat dapat pula dipakai tepung beras sebagai
pengikatnya, tetapi kurang baik. Jika zat yang dipisahkan basa-basa, maka
pelarut sebaiknya mengandung sedikit Amonium hidroksida atau dietilamin
(  1 % ). Jika asam-asam yang akan dipisahkan perlu ditambah asam asetat
(  1 % ). Asam dan basa ini bersifat pertolongan aditif sebagai buffer untuk
zat yang akan dipisahkan → akan tetap dalam bentuk non ionik, sehingga
dapat memberikan noda yang kompak. Disamping air dapat pula dipakai
pelarut organik misalnya aseton, atau kloroform dan metanol ( 2 : 1) untuk
membuat pastanya. Untuk memudahkan identifikasi ditambah lagi dengan
zat yang berfluoresensi sehingga dikenal “Silica gel GF”..
• Beberapa tipe silica gel :
• a) Silika gel G : Silika gel dengan zat pengikat, yang biasa digunakan adalah
CaSO4 dengan kadar antara 5 – 15 %.
• b) Silika gel S : Silika gel yang menggunakan zat tepung (pati) sebagai zat
pengikat. Tetapi penggunaan pati sebagai pengikat mempunyai kelemahan,
terutama jika penentuan lokasi bercak dengan asam sulfat dan atau Iodium.
• c) Silika gel GF 254 : Silika gel dengan pengikat dan indikator fluoresensi.
Jenis silica gel ini biasanya berfluoresensi kehijauan jika dilihat pada sinar
ultra violet panjang gelombang pendek. Sebagai indikator biasanya
digunakan Timah Kadmium Sulfida atau Mangan Timah Silika aktif.
• d) Silika gel H / N : Silika gel tanpa pengikat. LApisan ini dibandingkan
dengan yang mengandung CaSO4, menunjukkan hasil yang lebih stabil.
• e) Silika gel HF254 : Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indikator
fluoresensi.
• f) Silika gel PF 254 = 366 : Silika gel untuk keperluan preparatif yang
mengandung campuran dua indikator untuk cahaya ultra violet panjang
gelombang panjang dan pendek.
• g) Silika gel modifikasi Silika gel yang ditambah dengan polisiloxane
biasanya disebut silika gel Silanised dan digunakan untuk Kromatografi Lapis
Tipis fasa terbalik
• 2) Alumina
• Alumina atau aluminium oksida ( Al2O3 ) suatu adsorban yang sedikit bersifat basis. Tetapi kini dalam
perdagangan ada juga yang bersifat asam dan netral
• a) Al2O3 bersifat basis ( pH = 9 )
• b) Al2O3 bersifat netral ( pH = 7,5 )
• c) Al2O3 bersifat asam ( pH = 4 )
• Daya menyerapnya tidak sekuat silika gel. Tidak baik untuk memisahkan asam-asam karena akan diikat
lebih kuat pada adsorben dan sangat susah bergerak. “Edge – effect” disebabkan penyerapan yang
tidak rata dari pelarut. Komponen yang mudah menguap,pada sisi keping lapis lebih mudah daripada
di tengah  karena itu harga Rf makin ke pinggir (sisi) makin besar  perlu penjenuhan, dipakai
kertas saring pada sisi bejana. Terutama dipakai untuk memisahkan basa-basa.
• 3) Selulosa
• Penyerap jenis ini dapat digunakan dengan atau tanpa bahan pengikat. Pada Kromatografi Lapis Tipis,
penyerap ini terdapat sebagai butiran-butiran yang halus dan ukurannya sama, berbeda seperti pada
Kromatografi kertas dimana selulosa berupa serabut. Lapisan tipis yang dibuat dari sellulosa
mempunyai ruang antara yang lebih kecil,akan tetapi lebih teratur sehingga aliran pelarut lebih cepat
dan peristiwa difusi lebih sedikit.
• 4) Sephadex
• Jenis penyerap ini yang digunakan pada Kromatografi Lapis Tipis mempunyai ukuran 10 – 40 m dan
digunakan untuk pemisahan zat atas dasar perbedaan besar molekul seperti protein, hormon, enzim,
asam amino dan lain lain.
• 5) Kiesulguhr ( Diatomaceus earth )
• Adalah suatu adsorben yang netral, tetapi daya adsorpsinya lebih lemah daripada silika gel atau
alumina dan mempunyai daya pemisahan lebih kecil. Dapat ditambahkan pada silika gel untuk
mendapatkan bentuk yang kurang aktif, untuk memisahkan zat-zat yang sangat polar misalnya :
karbohidrat, asam-asam amino.
• 6) Magnesium silikat
• 1 bagian Magnesium silikat dengan 3 bagian air dikocok dan dioleskan
Bahan penyerap yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis

Bahan penyerap Digunakan untuk memisahkan

Silika gel Asam amino, alkaloid, gula, asam-asam lemak, lipida, mimyak menguap, anion
dan kation organik, steroid dan terpenoid

Alumina Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin,karotenoid dan asam amino

Keisulguhr Gula, oligosakarida, asam-asam lemak, trigliserida, asam-asam amino, steroid

Serbuk selulosa Alkaloid,asam amino dan nukleotid

Pati ( Amylum ) Asam amino

Sephadex Asam amino dan protein

Poliamida Protein, asam-asam aromatik, antioksidan, antosianin dan flavonoid

• . Fasa Gerak
• Pemilihan fasa gerak untuk Kromatografi Lapis Tipis tergantung
pada faktor yang sama pada pemilihan fasa gerak untuk keperluan
Kromatografi Kolom penyerapan. Sebaiknya digunakan pelarut yang
polaritasnya rendah sebab pelarut dengan polaritas yang tinggi sifat
kromatografi berubah menjadi kromatografi pembagian, disamping
itu pelarut tersebut dapat mempermudah lepasnya/rusaknya
lapisan tipis. Selain pelarut tunggal dapat juga digunakan campuran
pelarut tetapi sebaiknya jangan lebih dari 3 jenis pelarut sebab
campuran yang lebih kompleks akan cepat mengalami perubahan-
perubahan fasa terhadap perubahan suhu. Kemurnian pelarut
penting karena dalam hal ini digunakan untuk pemisahan sampel
dengan jumlah sedikit.
•
• Skema hubungan antara fasa diam, gerak dan senyawa yang dipisahkan
• Untuk memisahkan senyawa hidrokarbon dengan cara kromatografi penyerapan,
maka hidokarbon yang jenuh akan sukar diadsorpsi hingga perjalanannya paling
cepat. Hidrokarbon yang mempunyai ikatan rangkap akan lebih kuat diserap dan
banyak ikatan rangkapnya makin kuat penyerapannya. Adanya gugus fungsional
akan menaikkan afinitas adsorpsi, dimana akan bertambah menurut urutan berikut
: CH3, OR ( Alkali ), C=O ( Karbonil ), NH2 ( Amina ), OH ( Hidroksil ) dan COOH (
Karboksil ). Maka untuk memisahkan hidrokarbon yang banyak mempunyai ikatan
rangkap diperlukan yang aktif dan pelarut yang polar. Untuk penentuan fasa gerak
dan diam pada pemisahan suatu senyawa maka dapat dilakukan pergerakan dari
segitiga ke tengah. Misalnya unrtuk pemisahan senyawa non polar (lipida),
pertama-tama ujung segitiga digerakkan ke kata non polar dari senyawa yang
dipisahkan. Dua ujung segitiga lain akan menuju angka I pada aktivitas fasa diam
dan kata non polar pada deret Eluotropik pada fasa gerak. Artinya untuk
memisahkan senyawa yang non polar ( misal lipida atau hidrokarbon ) harus
digunakan bahan penyerap yang aktif dan pelarut yang kurang polar.
• Pembuatan lapisan tipis
• Pendukung yang biasa digunakan adalah kaca dengan ukuran 20 x20 cm
atau 20 x 10 cm. Permukaan pendukung harus rata dan bebas noda lemak.
Kadang-kadang untuk pemisahan secara cepat dan untuk keperluan
kualitatif dapat digunakan obyek gelas yang digunakan pada mikroskop.
• Bahan penyerap dibuat bubur dengan air dengan perbandingan 1 bagian
penyerap dengan 2 bagian air. Bila dipakai bahan penyerap yang
mengandung bahan pengikat, maka pembuatan bubur sampai lapisannya
harus selesai dalam waktu 4 menit, sebab setelah itu akan terjadi
pengerasan. Kadang-kadang dapat ditambahkan pula suatu zat yang
berfluoresensi.
• Pada kromatografi lapis tipis, tebal lapisan merupakan faktor penting pada
pola pemisahan komponen, biasanya tebal lapisan 0,25 mm tetapi untuk
keperluan preparatif tebal lapisan dapat lebih tebal ( 0,5 – 2,0 mm ).
• Pada waktu pemanasan, lapisan yang amat tipis memberikan hasil
pemisahan yang tidak tetap.
Pembuatan lapisan tipis dapat dilakukan dengan 4 cara :
• 1) Pembentangan
Cara yang biasa dilakukan adalah wadah tempat bubur, bahan penyerap
digerakkan pada kaca yang berkedudukan tetap. Ada juga cara pembentangan
dimana kaca yang bergerak.
• 2) Penuangan
Bahan penyerap yang sangat halus, homogen dan tidak mengandung bahan
pengikat dituangkan pada pendukung dan dibiarkan mengalir sampai rata.
Cara penuangan ini biasanya dilaksanakan untuk alumina sebagai bahan
penyerap dan sebagai cairan adalah pelarut yang mudah menguap
• 3) Penyemprotan
Dengan cara ini sukar didapat lapisan yang rata dan ketebalannya sukar
diketahui.
• 4) Pencelupan
Cara ini terutama untuk pembuatan lapisan dengan ukuran kecil seperti
sebesar gelas mikroskop. Dapat dilakukan dengan mencelupkan pendukung ke
dalam bubur bahan penyerap dalam pelarut yang mudah menguap. Tebal
lapisan yang pasti tidak diketahui dan kadang-kadang kurang rata. Untuk
kualitatif cara ini cukup memadai.
• . Pengembangan
• Bila cuplikan telah ditempatkan maka kemudian lapisan dimasukkan ke dalam bejana
kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan uap pelarut yang digunakan. Tepi
bagian bawah dicelupkan ke dalam fasa gerak (pelarut) kira-kira 0,5 – 1 cm.Bejana kromatografi
harus ditutup rapat, kalau dapat volumenya sekecil mungkin serta tidak berhubungan dengan
atmosfir di luar bejana. Untuk penjenuhan bejana biasanya pada dindingnya dilapisi kertas
saring yang tercelup dalam fasa gerak.
•
• Ada tiga cara pengembangan dalam Kromatografi Lapis Tipis :
• 1) Menaik
• Cara yang umum digunakan
• 2) Menurun
• Dimaksudkan untuk memperpanjang jarak gerakan. Komponen yang mempunyai nilai Rf kecil
dapat terpisah dengan baik. Lapisannya tebal, fasa geraknya kental.
• 3) Mendatar
• Pengembangan mendatar dapat berupa pengembangan satu arah ataupun radial.
•
• Pengembangan satu arah dimaksudkan untuk pemisahan dengan suhu yang lebih rendah dari
suhu kamar, dapat dikerjakan dengan menggunakan alat pendingin. Pengembangan radial
digunakan dengan memenfaatkan efek konsentrasi dan penyebaran zona-zona dalam garis-
garis tipis dan bukan sebagai bercak-bercak. Dengan cara ini dapat dipisahkan komponen-
komponen yang mempunyai harga Rf berdekatan. Pengembangan radial, fasa geraknya
dialirkan dengan sumbu atau pompa melalui pipa kapiler di tengah lapisan, senyawa terlarut
bergerak cepat dari tengah totolan  lingkaran.
 F. Deteksi Bercak Pemisahan
• . Bercak pemisahan pada Kromatografi Lapis Tipis umumnya merupakan bercak yang tidak
berwarna dan untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika maupun biologi.
• 1) Cara kimia
• Yang biasa digunakan adalah direaksikan dengan suatu pereaksi sehingga noda jadi tampak terlihat.
Pada Kromatografi Lapis Tipis tidak dilakukan dengan cara pencelupan tetapi penyemprotan. Untuk
senyawa organik dapat dilakukan dengan disemprot dengan asam sulfat pekat dan kemudian
dipanaskan pada 200 oC selama 10 menit. Bercak dari senyawa organik akan berwarna hitam.
Pereaksi lain untuk senyawa organik adalah Iod. Lapisan yang berisi hasil pemisahan diletakkan dalam
bejana tertutup yang telah diisi dengan kristal Iod. Dibiarkan beberapa saat untuk memberi
kesempatan terjadinya uap Iod. Warna bejana ungu, sedang bercak berwarna coklat, senyawa
organik tidak jenuh akan tidak berwarna. Jika dikeluarkan, warna bercak akan cepat hilang, sehingga
perlu cepat-cepat menandai bercak. Keuntungan Iod sebagai penampak bercak adalah tidak merusak
senyawa. Untuk senyawa-senyawa lain, kadang-kadang dapat digunakan pereaksi yang spesifik untuk
senyawa tersebut.
• 2) Cara fisika
• Yang dapat digunakan untukmenampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan
fluoresensi sinar ultra lembayung. Fluoresensi sinar ultra lembayung terutama untuk senyawa yang
dapat berfluoresensi maka bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka
bahan penyerapannya yang diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan
kelihatan hitam sedang latar belakangnya yang kelihatan berfluoresensi.
• 3) Cara biologi
• 4) Dapat digunakan untuk senyawa yang misalnya mempunyai aktivitas biologis, seperti anti bakteri
atau dapat menghidrolisis.Lapisan hasil pemisahan dialiri dengan suspensi bakteri misalnya, maka
pada bercak itu akan terlihat tidak adanya pertumbuhan bakteri.
 g. Identifikasi Harga Rf
Faktor yang mempengaruhi harga Rf
• 1) Bahan penyerap, sifat dan aktivitasnya
• Penyerap yang berbeda memberikan hasil pemisahan yang berbeda walaupun fasa gerak dan bahan yang dipisahkan
sama. Harga Rf dipengaruhi oleh aktivitas dari bahan penyerap karena dapat mempengaruhi daya adsorpsi. Aktivitas
dapat dicapai dengan pemanasan yang berarti pengusiran terhadap molekul-molekul air.
• 2) Tebal dan kerataan dari lapisan
• Ketidakrataan lapisan menyebabkan aliran fasa gerak tidak sama sehingga harga Rf juga tidak sama. Tebal baku yang
biasa digunakan adalah 0,25 mm
• 3) Kemurnian fasa gerak
• Pelarut yang tidak murni akan memberikan pemisahan yang kurang baik. Demikian juga jika digunakan fasa gerak yang
berupa campuran, maka perbandingan yang dipakai harus diperhatikan dan ditepati.
• 4) Kejenuhan bejana kromatografi
• Pemisahan yang dilakukan dalam dua bejana yang mempunyai kejenuhan tidak sama juga memberikan harga Rf yang
tidak sama.
• 5) Suhu
• Pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu yang tetap, dimaksudkan untuk mencegah perubahan komposisi fasa gerak
atau kejenuhan dari bejana.
• 6) Jumlah cuplikan yang dianalisis
• Jumlah cuplikan yang dianalisis jika terlalu banyak maka ada dianalisis jika terlalu banyak maka ada kecenderungan
terjadi penyebaran-penyebaran bercak atau terjadinya ekor sehingga akan memperbesar kesalahan harga Rf.  cuplikan
10–20 g
• 7) Kesetimbangan
• Faktor kesetimbangan ini terlihat lebih nyata pada Kromatografi Lapis Tipis dibanding pada Kromatografi kertas,sehingga
sangat perlu untuk kromatografi Lapis Tipis diusahakan ruangan di dalan bejana jenuh dengan uap pelarut.
Ketidakseimbangan di dalam bejana akan terlihat dari permukaan fasa gerak yang berbentuk cekung atau fasa gerak lebih
cepat pada bagian tepi dibanding bagian tengah.
• 8) Struktur dan sifat kimia senyawa yang dipisahkan
• Sifat kimia seperti mudah larut, tekanan uap dan kepolaran dapat mempengaruhi harga Rf dari suatu senyawa dibanding
senyawa yang lain.
• 9) Mutu pelarut
• Harus dipakai pereaksi yang pro analisa jika diperlukan pelarut campur, maka harus diperbaharui pada waktu-waktu
tertentu,karena menguapnya pelarut yang mudah menguap akan mengubah susunan pelarut.
• 10) Teknik
• Sudut yang dibentuk waktu meletakkan plat/keping dalam bejana tidak begitu mempengaruhi harga Rf, tetapi bila
dipakai metoda menurun atau mendatar/horisontal (tidak menaik) akan mempengaruhi
 Variasi Kromatografi Lapis Tipis
• Dengan tujuan untuk mencapai pemisahan yang sempurna dan memperluas pemakiannya maka Kromatografi Lapis
Tipis mengalami berbagai perubahan seperti :
• a. Kromatografi lepas tipis
• Pada pendukung dari kaca, serbuk kering bahan penyerap dibentangkan dan diratakan. Cuplikan ditempatkan dan
dilakukan pengembangan mendatar. Untuk penentuan lokasi dapat dilakukan penyemprotan
• b. Lapisan bertingkat ( “gradient plate” )
• Cara ini mempunyai daya adsorpsi yang berbeda sepanjang lapisan. Dapat dibuat dengan alat khusus yang disebut
“gradient spreader” dimana diisi dengan dua macam bubur bahan penyerap misalnya A dan B. Lapisan berubah dari
100 % A ke 100 % B. Cara ini dapat digunakan untuk menemukan campuran bahan penyerap yang terbaik.
•
• c. Pengembangan Bertingkat ( “gradient elution” )
• Komposisi fasa gerak selalu berubah selama pengembangan. Lapisan dapat dimasukkan ke dalam fasa gerak
misalnya suatu pelarut dan kemudian fasa gerak yang kedua ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk-aduk.
• d. Pengembangan berganda ( “multiple elution” )
• Pengembangan dilakukan pada arah yang sama dan dilakukan berkali-kali baik dengan pelarut yang sama atau yang
divariasi.
• e. Lapisan beralur ( “grooved plates” )
• Pendukung yang berasal dari kaca gelas yang diberi garis-garis, maka setelah bahan penyerap dibentangkan akan
terjadi lapisan yang beralur. Pada tiap jalur ditempatkan bercak cuplikan.
• f. Lapisan dengan pendukung yang lentur
• Lapisan ini sudah banyak diperdagangkan misalnya pendukung lembaran poliester dimana bahan penyerap dengan
pengikat polivinil asetat dibentangkan di atasnya. Contoh pendukung lain adalah kertas selulosa yang dilapisi dengan
bahan penyerap.
• g. Kromatografi fasa balik ( Reversed phase partition chromatography )
• Lapisan tipis yang sudah jadi dicelupkan dalam pelarut yang non polar tetapi mudah menguap atau pelarut tersebut
dibiarkan mengalir melewati lapisan tadi. Dengan cara itu maka fasa diam bersifat non polar. Sebagai fasa gerak
digunakan pelarut polar seperti air, metanol atau asetonitril. Hasil pemisahan berbeda dengan kromatografi
normal dimana pada cara ini komponen yang paling polar terelusi lebih dahulu.
Perkembangan dari kromatograf lapis tipis (TLC) adalah kromatografi lapis tipis penampilan tinggi
(HPTLC), perbandingan TLC dan HPTLC sebagai berikut
Keuntungan HPTLC :
· Memperkecil difusi sehingga meningkatkan efisiensi pemisahan
· LOD menurun 1/10 hingga 1/15 x lebih kecil
· Lebih ekonomis (plate / solven per sampel lebih kecil)

Parameter TLC HPTLC

Ukuran partikel 12 – 50 m 5 – 6 m

Tebal layer 0,1 – 0,3 mm 0,1 atau 0,2 mm

Jarak pengembangan 10  15  20 cm 3 – 6 cm

Jarak pemisahan 100 – 120 mm 50 mm

Volume penotolan 0.5 – 5 L 0,1 – 1 L

Ukuran sampel 3 – 4 mm 1 – 1,5 mm

 3. KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi kolom berguna untuk sampel yang mengandung molekul
besar atau zat yang bersifat ion dengan tekanan uap yang rendah dan untuk
zat yang termolabil yang tidak dapat diuapkan tanpa penguraian.

• a. KROMATOGRAFI ADSORPSI
• Sifat-sifat atom, ion atau molekul yang terletak pada permukaan partikel padat
ternyata berbeda dengan sifat-sifat atom, ion atau molekul yang terletak pada bagian sebelah
dalam dari partikel padat. Ikatan-ikatan yang terletak pada bagian permukaan dipengaruhi
oleh tidak terdapatnya struktur kimia di atomnya, karena itu lapisan permukaan berada pada
tingkat energi yang lebih tinggi dan hal ini dikatakan mempunyai aktivitas permukaan.
• Bila partikel padat dicelupkan dalam suatu cairan, maka permukaan zat aktif
tersebut menarik dan cenderung mengadsorpsi species (atom, ion atau molekul) dari cairan
tadi. Gaya tarik tersebut mungkin bersifat ionik (elektrostatik). Bila cairan tersebut berupa
suatu larutan, maka salah satu atau semua zat terlarut atau pelarutnya mungkin dapat
diadsorpsi. Adsorben yang baik harus mempunyai daerah permukaan yang luas yang
mengandung banyak bidang-bidang yang aktif secara kimiawi. Biasanya permukaan tersebut
akan kehilangan aktivitasnya jika tertutup oleh suatu lapisan species yang diadsorpsi.
• Bila suatu larutan mengalir melalui permukaan aktif dari zat padat, maka suatu
keseimbangan akan terbentuk untuk proses adsorpsi atau desorpsi dari species yang terdapat
dalam larutan tersebut.
• Hubungan antara kadar species dalam larutan dan jumlah yang disdsorpsi dapat dinyatakan
sebagai suatu persamaan atau grafik hubungan Cs (yang diadsorpsi) dan CM (yang ada dalam
fasa gerak) dan garis yang diperoleh disebut adsorption isotherm.
• Diperoleh bermacam-macam bentuk garis seperti :
• Garis lurus
• Bentuk seperti ini menunjukkan bahwa permukaan adsorben tidak menjadi jenuh dengan species yang ada.
Keadaan ini adalah yang diinginkan. Kemiringan dari garis memberikan koefisien distribusi yang dalam hal ini tidak
tergantung pada ka.
•
• K = Cs / CM atau Cs = K CM
•
• Garis cembung
• Bentuk ini disebabkan adanya variasi dari bidang adsorpsi yang ada. Banyak sistem cair padat yang mengikuti
hubungan ini yang dikenal sebagai Freundlich isotherm
•
• K = Cs / CM atau Cs = K CM
•
• Garis cekung
• Terjadi bentuk ini dikarenakan adanya reaksi-reaksi tambahan pada peristiwa adsorpsi yang kadang-kadang dapat
meningkatkan proses adsorpsi secara keseluruhan.
• Mengingat bahwa laju perjalanan dari suatu komponen melalui sistem kromatografi merupakan fungsi dari bagian
komponen yang terdapat pada dalam fasa gerak dan bila pita yang dihasilkan memencar maka tentunya ada daerah
yang berkadar tinggi dan terletak dibagian tengah. Bila bentuk kurva itu cembung maka pusat pita akan berjalan
pada laju yang lebih cepat dibanding dengan kedua ujung haluan dan butitan.
• Pada kasus yang luar biasa pusat tersebut hampir menyusul ujung haluan, sehingga memberikan batas depan yang
tajam dan ujung buritan yang panjang. Hal ini disebut band tailing dan jelas kejadian ini tidak diharapkan. Kejadian
yang berlawanan terjadi jika bentuk kurva seperti garis cekung dimana memberikan ujung haluan panjang dan
batas belakang yang tajam ( fronting ) . Band tailing lebih jelas dengan adsorben yang aktif. Salah satu cara
mengurangi akibat buruk adalah membuat tidak aktif sebagain zat padat dengan menutup bidang yang aktif
dengan zat lain atau dengan menaikkan suhu. Pendekatan lain adalah mengurangi ukuran dari sampel sehingga
sistem tersebut masih berada dalam bagian yang hampir lurus dari isotherm yang diperoleh pada kadar yang
sangat rendah.
• Adsorben ( Penyerap )
• Banyak zat padat yang dapat dipakai sebagai adsorben . Kemungkinan yang paling popular dan
biasanya digunakan sebagai penyerap adalah alumina, tetapi tidak berarti yang lain tak dapat
digunakan.
• Suatu pengertian yang digunakan dalam hubungannya dengan adsorben adalah “aktivasi”. Kadang-
kadang ini dihubungkan dengan luas permukaan spesifik dari zat padat, yaitu luas permukaan yang
diukur dalam meter persegi dalam tiap gram, dalam hal karbon, silica gel dan alumina dapat dibuat
menjadi aktif dengan memiliki permukaan spesifik beratus-ratus meter persegi. Sedangkan seperti
kalsium karbonat dan kalsium hidroksida, mempunyai luas permukaan spesifik yang mempunyai
ukuran dalam puluhan meter persegi atau kurang, hingga ini dapat dikatagorikan relative kuarang
aktif. Dalam kromatografi pengertian “aktivitas” sering digunakan untuk menyatakan kekuatan dari
adsorpsi. Kekuatan adsorpsi dari gugus polar pada senyawa-senyawa polar naik dengan urutan :
•
• - CH = CH, -OCH, -CO2R, =C=O, -CHO, =SH, -NH2, -OH, -CO2H
•
• Banyak penyerap seperti alumina, silika gel, karbon aktif dan magnesium silikat dapat diperoleh dalam
perdagangan. Sebelum dipakai mereka sering memerlukan aktivasi yang dapat dikerjakan dengan
pemanasan, mungkin dengan pengurangan tekanan. Untuk aktivasi alumina biasanya dengan
pemanasan 400 oC selama 4 jam. Tanpa keterangan lain dilakukan pemansan 200 oC selama 2 jam.
• Pemilihan suatu pelarut untuk elusi adalah sama pentingnya dengan pemilihan adsorben. Fasa gerak
cair tidak hanya menyediakan pengangkutan sebagai wahana tetapi juga mempengaruhi koefisien
pembagian melalui daya pelarutnya. Disamping kelarutan relatif zat terlarut dalam pelarut elusi, perlu
dipertimbangkan pula persaingan antara zat terlarut dengan pelarut terhadap bidang adsorpsi pada
permukaan dari fasa diam.
• Pelarut yang mengelusi zat terlarut cepat tidak akan dapat memisahkan dengan baik, sebaliknya
pelarut yang bergerak terlalu lambat akan memberikan waktu retensi yang terlalu panjang. Waktu
retensi yang terlalu panjang dapat menyebabkan pelebaran pita dan peristiwa pengenceran yang tidak
perlu. Kadang-kadang perlu digunakan suatu campuaran pelarut atau suatu seri pencampuran (
gradient elution ) dengan variasi eluen yang polaritasnya makin tinggi.
•
Zat padat Digunakan untuk memisahkan
Alumina/magnesia Sterol-sterol, zat warna, vitamin-vitamin, ester-ester, alkaloid-alkaloid,
senyawa anorganik

Silika gel Sterol-sterol, asam-asam amino

Karbon Peptida-peptida,karbohidrat-karbohidrat, asam-asam amino

Magnesium silikat Sterol-sterol, ester-ester, gliserida-gliserida, alkaloida-alkaloida

Magnesium karbonat Porphirin

Kalsium hidroksida Karotenoida-karotenoida

Kalsium karbonat Karotenoida-karotenoida, Xantofil
Kalsium fosfat Enzim-enzim, protein-protein, polinukleotida-polinukleotida

Aluminium silikat Sterol-sterol

Pati Enzim-enzim
Gula Klorofil, xantofil
• Ada istilah yaitu kekuatan adsorpsi dari suatu adsorben dalam kolom. Untuk
adsorben yang polar (seperti alumina dan silica gel ) kekuatan adsorpsinya naik jika
polaritas zat yang diadsorpsi juga naik. Menurut Trappe kekuatan elusi dari
pelarut-pelarut berikut akan diturunkan dalam suatu kolom yang berisi silika gel :
• Air  metanol  etanol  propanol  aseton  etilasetat dietil eter  kloroform 
metilena klorida  benzene  toluene ( trikloroetilena )  karbontetraklorida 
sikloheksana  heksana
• Sedang untuk adsorben karbon aktif, pelarut-pelarut di bawah ini diturunkan daya
elusinya untuk pemisahan asam-asam amino dan sakarida-sakarida
• Etil asetat  dietil eter  propanol  aseton  etanol  metanol  air
• Dari kedua contoh tersebut dapat diambil kesimpulan bahwa daya elusi pelarut
sangat tergantung pada fasa padat (adsorben) dan zat yang dipisahkan (zat
terlarut).
• Pada dasarnya suatu hidrokarbon yang tidak polar akan diikat lebih erat pada isi
kolom yang tidak polar dibandingkan dengan zat yang polar.
• Teknik analisis
• 1) Pengisian kolom
• Pengisian adsorben yang tidak baik akan menyebabkan rusaknya batas-batas jalur-jalur kromatografi.
Adanya gelembung udara atau tempat berongga pada kolom mengakibatkan putusnya penyerap
(adsorben). Kolom yang digunakan untuk kromatografi biasanya mempunyai garis tengah yang besar
sehingga dapat dilakukan penggoyangan atau penekanan selama pengisian adsorben, cara tersebut
disebut cara kering.
• Cara lain untuk pengisian adsorben adalah dengan menuangkan pelan-pelan bubur adsorben dalam
pelarut. Biasanya perlu disertai dengan penggoyangan pelan-pelan untuk mendapatkan pengisian
yang homogen dan jika adsorben yang digunakan mempunyai ukuran yang sama maka akan lebih
mudah dicapai pengisian yang homogen, Yang perlu mendapatkan perhatian adalah jangan sampai
ada penyerap yang kering.
• Untuk menunjang bahan penyerap maka pada bagian bawah kolom diberi sumbat dari kapas, gelas
wool atau penyaring dari gelas.
•

• 2) Pemasukan cuplikan
• Cuplikan dimasukkan dan dibuat serata mungkin pada puncak dari kolom. Cuplikan dalam bentuk
larutan yang pekat dan jangan sampai terjadi jalur-jalur yang terputus. Untuk memperoleh
permukaan yang rata biasanya pada bagian atas kolom diberi kertas saring atau dengan pasir yang
bersih. Untuk memasukkan sampel dapat digunakan pipet yang kecil dan panjang. Ujung pipet
digerakkan ke sekeliling kolom dan hendaknya ujung pipet jangan menyentuh adsorben. Cuplikan
yang tertinggal pada dinding kolom dapat dilarutkan dengan pelarutnya. Setelah semua cuplikan
berada dibagian atas kolom maka dapat ditambahkan eluen perlahan-lahan menggunakan corong
pisah dan diberikan beberapa waktu ( 5 menit ). Setelah itu proses elusi dapat dimulai.
• 3) Elusi
• Ada tiga macam cara elusi yaitu :
• Elusi sederhana
• Yaitu elusi yang menggunakan campuran pelarut dengan komposisi yang tidak berubah selama
proses pemisahan.
•
• Elusi berfraksi ( fractional elution)
• Adalah elusi dimana untuk memisahkan suatu komponen dari suatu campuran digunakan satu
macam eluaen, sehingga untuk memisahkan suatu campuran perlu digunakan bebarapa macam
eluen yang berbeda-beda.
• Elusi bertingkat ( gradient elution )
• Adalah elusi untuk memisahkan suatu komponen campuran dimana eluen yang digunakan terus
menerus berubah. Misalnya mula-mula digunakan air dalam pemisahan dan kemudian
ditambahkan sedikit demi sedikit pelarut yang lain misalnya etanol.
•
• 4) Cara deteksi
• Kebanyakan fasa diam berupa suatu serbuk yang berwarna putih atau tidak berwarna sehingga
memberi kemudahan untuk mengamati pemisahan zat yang berwarna. Dalam teknik yang
khusus lusi dihentikan jika pita yang pertama tampak pada ujung bawah. Kemudian bahan
penyerap dikeluarkan dan ditambahkan suatu peraksi yang dapat menunjukkan posisi pita.
Komponen-komponen yang terpisah dapat diekstraksi dengan pelarut yang sesuai.
• Cara lain adalah memisahkan setiap fraksi dari eluen dan dipeiksa dengan alat-alat lain seperti
spektrofotometer, fluorometer, pH meter dan sebagainya. Selain itu fraksi pelarut dapat
diuapkan dan diidentifikasi.
• KROMATOGRAFI KOLOM PEMBAGIAN
Di dalam sistem kromatografi pembagian, fasa diam berupa
zat cair sedang fasa gerak dapat berupa zat cair ataupun gas.
Kalau pada kromatografi penyerapan digunakan zat padat
maka pada kromatografi pembagian zat padat digunakan
sebagai penunjang fasa diam ( yang berupa zat cair ). Zat
penunjang harus mengadsorpsi dan menahan fasa diam dan
membuat luas permukaan fasa diam seluas-luasnya. Selain itu
juga dipersyaratkan harus stabil, mudah diisikan dan tidak
menghalangi aliran fasa gerak. Senyawa yang dipisahkan
dengan sendirinya akan terdistribusi diantara dua zat cair
tergantung dari koefisien pembagiannya. Sebagai zat padat
penunjang dapat digunakan silika gel, serbuk selulosa dan
tanah diatomae.
• 1) Teknik Analisis
• a) Pemasukkan penyerap
• Mula-mula mencampur penunjang dengan cairan yang akan digunakan sebagai fasa diam, diaduk-
aduk dan dibuat bubur dengan fasa gerak yang akan digunakan. Bubur ini kemudian dimasukkan ke
dalam kolom sedikit demi sedikit dimana kolom telah diisi dengan sedikit pelarut.Sebaiknya setiap
pemasukkan bubur ke dalam kolom disertai dengan penekanan dengan batang gels yang ujungnya
datar. Semakin kompak isi kolom semakin baik pemisahan yang terjadi.
• b) Pemasukkan cuplikan
• Cara pemasukkan cuplikan dengan menggunakan pipet seperti pada kromatografi kolom adsorpsi.
Cara lain adalah dengan melarutkan cuplikan dalam suatu pelarut dan mencampurkannya dengan
sejumlah zat padat penunjang sehingga diperoleh suatu bubuk yang kering. Bubuk ini kemudian
diletakkan dibagian atas kolom dan sedikit fasa gerak ditambahkan.
• c) Elusi
• Cara elusi yang digunakan dalam kromatografi kolom pembagian sama seperti ada kromatografi
penyerapan. Jika fasa diam adalah molekul air maka fasa gerak dapat digunakan pelarut organik.
• Pada perkembangan selanjutnya ada suatu teknik dalam kromatografi partisi dengan menggunakan
pelarut organik yang bersifat non polar sebagai fasa diam, teknik ini dimaksudkan agar diperoleh nilai
koefisien partisi yang lebih menguntungkan untuk proses pemisahan. Oleh sebab itu sebagai
penunjang digunakan yang bersifat tidak polar. Teknik ini dikenal dengan Kromatografi partisi fasa
terbalik.
Contoh beberapa pemisahan pada kolom partisi

Pemisahan Penyokong Fasa tetap Fasa gerak

Alkohol-alkohol C1 – C4 Celite Air CHCl3 atau CCl4

Asam-asam lemak C1 – C4 Silika gel Air CHCl3 / n-BuOH

Asam-asam amina Pati Air n-PrOH atau n-BuOH / HCl

Fenol-fenol Selulosa Air Me-OH / n-BuOH / CHCl3

Lipida-lipida Silika gel Air Bermacam-macam

• KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION
• Asas pertukaran ion digunakan pada kromatografi kolom, kertas dan lapis tipis. Sebagai bahan penukar ion
digunakan resin penukar ion sintetik yang mempunyai stabilitas kimiawi serta ukuran partikel yang seragam. Resin
merupakan suatu polystyrene yang dibuat dengan proses polimerisasi dari styrene dan adanya sedikit divinyl
benzene. Kemudian ke dalam polystyrene dimasukkan gugus-gugus polar yang dapat memberikan sifat pertukaran
ion. Resin dapat dibuat dalam bentuk butiran-butiran atau dalam bentuk lembaran (membran). Selain polystyrene
dapat juga digunakan asam polimetakrilat (polymetacrylic acid).
•
•
•
•
• Mekanisme pemisahan :
• Resin penukar ion dibedakan menjadi 2 macam :
• - penukar kation yaitu yang mempunyai gugus polar yang bersifat asam seperti : -SO3H atau –COOH
• - penukar anion yaitu yang mempunyai gugus polar yang bersifat basa seperti ; -CHNR
•
• Untuk melukiskan pemisahan berdasar pertukaran ion, dapat dibayangkan suatu resin yang bersifat asam kuat (misal
yang mengandung SO3H) dirumuskan sebagai RH. Jika butiran resin dimasukkan ke dalam air maka gugus sulfon akan
terionisir seluruhnya, tetapi proton-protonnya tidak dapat pergi meninggalkan kerangka resin karena secara elektris
tidak netral dan disebabkan tidak adanya kemungkinan dapat terjadi pertukaran antara kation tersebut dengan
proton karena biasanya larutan juga terdapat anion.
•
• M+ + RH  H+ + RM
• M+ adalah kation bebas
• RH adalah simbol dari proton yang terikat
•
• Dengan mengingat adanya faktor aktivitas, maka dapat ditulis persamaan sebagai berikut
•
 aH+ aRM
Kd = ───────
aM+ aRH
•
• Kd sering dikenal sebagai koefisien distribusi keseimbangan atau koefisien selektivitas. Untuk
larutan yang encer selektivitas dapat diganti dengan kadar.
• Bila larutan yang mengandung ion M mengalir lewat kolom resin maka akan diganti oleh ion
H sesuai dengan harga dari Kd. Bila larutan yang dituangkan hanya sedikit dan kemudian
dilakukan pencucian dengan air murni maka semua ion M akan diganti seluruhnya oleh ion H
dan membentuk pita adsorpsi yang diam (stasioner). Distribusi ion-ion dalam pita akan
tergantung pada harga Kd, bila harga Kd besar maka pita akan sempit dan pekat, sebaliknya
jika Kd kecil maka pita adsorpsi akan lebar dan defus. Supaya pita adsorpsi ion M bergerak ke
bawah maka perlu dielusi dengan larutan asam atau larutan kation lain sehingga dapat terjadi
pertukaran ion. Ion M akan tercuci keluar dari kolom dan akan meninggalkan dalam bentuk
aslinya. Laju gerak ion-ion tidak tergantung pada pH dari asam pengelusi dan juga harga Kd.
Jadi dua ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin akan bergerak keluar dengan laju
yang tidak sama dan terjadilah proses pemisahan.
•
• Teknik Analisis
• 1) Pembuatan Resin
• Dalam perdagangan banyak didapatkan bermacam-macam resin, sehingga orang harus memilih
dengan berbagai kriteria seperti ukuran partikel, persentase hubungan silang dan kualitas sesuai
dengan tujuan analisis. Kualitas Analytical Grade biasanya disukai karena mempunyai ukuran
yang seragam serta bebas dari bahan organik atau anorganaik pengganggu.
• Beberapa sifat dari resin untuk keperluan analisis :
• a) harus mempunyai gugus pertukaran yang berfungsi tunggal
• b) mempunyai derajat hubungan silang yang tertentu ( 4 – 8 % )
• c) ukuran partikel sebaiknya sekecil mungkin
• Kadangkala perlu dilakukan perubahan bentuk resin yaitu bentuk yang satu ke bentuk yang lain,
misal dari bentuk hidrogen menjadi bentuk natrium dengan cara pencucian memakai larutan
natrium klorida pekat sampai eluennya bereaksi netral. Resin yang pernah dipakaipun perlu
dilakukan peremajaan (regenerasi) untuk menaikkan kembali aktivitasnya.
• 2) Pengisian Kolom
• Untuk analisis mikro dapat digunakan buret dengan sumbat kapas atau gelas wool penyangga
resin. Kolom biasanya dibuat dari gelas dengan suatu reservoir untuk tempat eluen yang
diletakkan di sebelah atas. Pada bagian bawah diberi sumbat kapas atau gelaswool atau piringan
berpori.
• Resin diisikan dalam bentuk bubur dan dibiarkan mengenap dan kadang-kadang perlu digoyang-
goyang. Setelah diisi puncak resin harus terendam cairan agar tidak kemasukkan udara. Di
puncak resin sering ditempatkan kertas saring untuk mengecilkan gangguan yang dapat terjadi
jika sampel ditempatkan.
• 3) Metode Pemisahan
• Karena pada kromatografi biasanya digunakan larutan sampel yang encer, maka pemisahan
dengan teknik elusi banyak digunakan dan seringkali memberikan hasil yang memuaskan.
• 4) Kapasitas Pertukaran Ion
• Kapasitas pertukaran ion suatu kolom mempengaruhi ukuran sampel maksimum yang dapat
dipisahkan dan digunakan untuk memeriksa stabilitas resin dalam jangka lama. Kapasitas
resin dinyatakan dalam mili-ekivalen/gram resin kering, biasanya dituliskan pada dasar bejana
oleh pabrik pembuatnya. Tetapi kapasitas ini mudah ditentukan dengan cara mengubah resin
seluruhnya ke dalam bentuk hidrogen (bila tadinya bersifat kationik), dan kemudian dielusi
dengan Natrium klorida hingga seluruhnya menjadi bentuk Natrium. Eluat tentu mengandung
asam klorida dengan jumlah yang ekivalen dengan kapasitas kolom yang mudah ditentukan
dengan titrasi Natrium hidroksida. Resin umumnya mempunyai kapasitas 1 – 5 miliekivalen /
ml atau secara kasar 1 – 5 N dalam asaasam atau basa
• Metoda Deteksi
• Kesulitan menentukan komponen sampel dalam jumlah kecil dengan adanya ion eluen yang
kadarnya tinggi, merupakan kerugian utama metoda pertukaran ion. Cara deteksi yang paling
umum adalah mengumpulkan sesama volume fraksi-fraksi untuk spesies yang dicari.
Digunakan pula cara deteksi dengan adsorpsi cahaya indeks bias, pH radioaktivitas,
polarografi dan spektrofotometri.
 3. Pemakaian
• a. Untuk menghilangkan ion
• Misalnya untuk menghilangkan ion-ion dari air sadah guna keperluan rumah tangga. Cara
menghilangkan ion-ion ini dilakukan dengan mengalirkan air sadah tersebut mula-mula melalui
penukar kation yang akan mengganti semua kation dalam air dengan hidrogen, selanjutnya
dialirkan melalui penukar anoin dimana semua anion yang ada akan diganti dengan ion OH.
Akibatnya garam yang ada akan diganti dengan senyawa air (ion-ion dari air). Dua macam resin
penukar ion di atas dapat pula digabungkan menjadi satu lapisan tunggal hingga air cukup dialirkan
satu kali saja. Air yang dihilangkan ionnya secara ini belum murni karena senyawa non elektrolit
tidak dihilangkan pada proses ini.
• Proses di atas digunakan pula untuk mengganti satu atau lebih ion pengganggu dengan ion yang
tidak merugikan dan untuk menentukan kandungan garam jumlah dalam satu larutan (kation
diubah menjadi hidrogen ion atau anion menjadi hidroksida ion, kemudian diikuti titrasi asam
secara sederhana).
•
• b. Untuk menentukan kadar konstituen yang sangat kecil
• Bila suatu ion terdapat sangat sedikit dalam volume yang sangat besar dan akan ditentukan
kadarnya, salah satu metode yang terpilih adalah memisahkan ion tersebut dari dalam larutan
dengan penukar ion kemudian diikuti dengan elusi ke dalam volume eluen yang lebih sedikit.
• Cara ini merupakan langkah umum untuk menentukan jejak logam dalam air, untuk mendeteksi
tembaga dalam air susu atau untuk memperoleh logam yang langka.
•
• .
• c. Larutan baku primer dari asam kuat dan basa kuat
• Sukar dibuat karena tidak adanya reagen baku primer, tetapi larutan baku primer natrium atau
kalium klorida mudah dibuat dan larutannnya sangat stabil. Maka sejumlah tertentu dari larutan
natrium klorida baku ini dialirkan lewat resin bentuk nitrogen atau hidroksida sehingga akan
diperoleh asam atau basa dalam jumlah ekivalen. Dengan cara demikian dapat dibuat larutan
baku asam kuat (klorida) atau basa kuat (natrium hidroksida).
•
• d. Pemisahan logam-logam
• Pertukaran ion sangat menguntungkan untuk pemisahan logam-logam alkali dengan sifat yang
sangat mirip, misalnya campuran logam alkali dan alkali tanah.
•
• e. Pemisahan asam-asam amino
• Pada pH tertentu asam-asam amino dapat dipisahkan dengan mengalirkan mereka lewat dua
macam resin. Sifat amfoternya memungkinkan bergantinya tanda muatan atau terhapusnya
muatan hingga dapat dipisahkan ke dalam tiga golongan. Asam amino dapat dipisahkan dengan
resin yang mengandung ion-ion logam yang tidak dimobilisir, seperti misalnya Cu dan Cd yang
berperan sebagai tempat pertukaran ligand. Bila satu campuran asam amino dialirkan lewat
resin semacam itu maka gugus asam amino akan bersaing untuk pembentukan kompleks
dengan ion logam tersebut. Disini komponen sampel yang akan dipisahkan tidak perlu bersifat
ionik dan prosesnya disebut ligand exchange
• c. KROMATOGRAFI GEL
•
• Pada kromatografi gel, fasa diam adalah gel yaitu suatu matriks polimer yang
berpori-pori dan pori-porinya seluruhnya terisi oleh pelarut yang digunakan
sebagai fasa gerak. Ukuran pori adalah sangat menentukan karena dasar
pemisahan pada sistem ini adalah bahwa molekul yang ukuran besar diatas ukuran
pori akan sama sekali tidak dapat masuk ke dalam gel, sedang molekul yang lebih
kecil dari ukuran pori akan dapat masuk dan menggunakan sebagian atau seluruh
ruangan bagian gel tersebut. Aliran fasa gerak akan menyebabkan molekul yang
lebih besar bergerak melewati kolom tanpa hambatan tanpa menembus masuk ke
dalam matriks gel, sementara molekul yang lebih kecil akan terhambat sesuai
dengan masuknya ke dalam gel. Komponen dari campuran akan muncul keluar dari
kolom berurutan tergantung masa molekul, yang paling besar akan keluar paling
dahulu. Senyawa yang sama sekali tidak dapat masuk ke dalam gel akan terpisah
satu sama lain. Molekul dengan ukuran intermediate (diantara besar dan kecil)
akan tertahan yang lamanya bergantung pada perembesan mereka dalam matriks.
Efek adsorpsi pada permukaan butiran gel biasanya dapat diabaikan.
• Fasa diam cair adalah cairan yang terdapat dalam matriks ge, sedang fasa gerak
adalah eluen yang mengalir yang menempati sisa ruang di kolom.
• Teknik analisis
• 1) Pemilihan gel
• Gel merupakan senyawa yang terdiri dari rantai-rantai polimer panjang berhubungan
silang dan membentuk kerangka tiga dimensi. Kebanyakan mempunyai gugus polar yang
mampu mengadsorpsi air atau pelarut lain yang polar, ada pula yang mampu
mengadsorpsi pelarut lain yang non polar.
• Bila suatu gel mengadsorpsi cairan, maka akan terjadi perentangan struktur dan
pembukaan dan terjadi penghilangan celah-celah yang terdapat di dalam gel, tergantung
pada banyaknya hubungan silang, terdapat pula macam-macam ukuran molekul yang
tepat dapat masuk ke ruang dalam gel. Batas-batas ukuran molekul yang dapat masuk
disebut Ukuran Kritis (exclusion limit) yang bervariasi pada berat molekul antara 1000 –
beberapa juta.
• Untuk dapat memilih gel yang sesuai untuk suatu campuran yang akan dipisahkan perlu
diketahui tipe-tipe dari gel seperti :
• · Sephadex untuk pemisahan molekul yang besar dalam biokimia
• · Biogel P untuk molekul dengan bobot molekul 1.800 – 400.000
• · Agarose untuk molekul dengan bobot molekul  500.000
• · Styragel untuk molekul dengan bobot molekul 1.600 – 40 juta
•
• 2) Pembuatan Kolom
• Kolom gel dibuat dengan cara yang sama seperti kolom pertukaran ion. Gel
mula-mula dimuaikan dulu dengan pelarut selama beberapa jam,
kemudian dimasukkan ke dalam kolom dalam bentuk bubur. Lapisan gel
ditopang dengan gelas wool atau jala nilam dan diusahakan tidak ada
gelembung udara yang terperangkap di dalam lapisan dengan cara
permukaan zat cair di atas lapisan.
•
• 3) Pemasukkan Cuplikan
• Sampel dimasukkan secara berhati-hati sehingga tidak merusak lapisan.
Elusi biasanya dilakukan di bawah tekanan hidrostatik (atmosfer) yang
tetap untuk memperoleh laju aliran yang tetap.
•
• 4) Deteksi
• Metode deteksi yang umum meliputi pengumpulan dan penganalisaan
fraksi-fraksi eluat. Metode deteksi secara kontinyu dilakukan dengan hasil
pemisahan yang dilewatkan wadah-wadah dimana dilakukan pengukura-
pengukuran seperti spektrofotometri UV, index bias atau radioaktivitas.
• 5) Pemakaian

• a) Penghilangan garam (desalting)

• Menghilangkan garam dan molekul kecil dari makromolekul dan merupakan masalah umum dalam
pemisahan biokimia.
• Desalting dengan mudah dapat dilakukan dengan kolom gel yang sederhana dengan laju aliran yang
tinggi.

• b) Pemekatan
• Larutan encer makromolekul dengan Bobot Molekul lebih tinggi dari exclusion limit suatu gel dapat
dipekatkan dengan menggunakan sifat higroskopis dari gel kering. Bila gel kering dimasukkan dalam
larutan encer maka air dan garam-garam serta molekul yang kecil akan terpisah oleh gel tersebut,
sedang makromolekul tertinggal dalam larutan sisa dengan kadar lebih tinggi.
•
•
• c) Pemisahan
• Untuk senyawa-senyawa berbobot molekul tinggi seperti protein, pestisida, asam nukleat,
polisakarida, enzim dan hormon.
•
• d. KROMATOGRAFI AFINITAS
• Dalam sistem ini fasa diam berupa suatu kerangka zat
padat yang mempunyai afinitas berlainan dengan
berbagai senyawa. Pemisahan terjadi karena
komponen hasil reaksi akan dapat melewati keluar
sedang komponen yang belum/tidak bereaksi akan
tertahan oleh fasa diam. Proses ini digunakan misalnya
dalam reaksi enzimatis secara kontinyu. Enzim mula-
mula diikatkan pada fasa diam, kemudian zat yang akan
direaksikan dialirkan melalui kerangka yang telah
mengikat enzim tersebut.
 SPEKTROFOTODENSITOMETRI – TLC SCANNER
• 4. Analisa kuantitatif dari KLT dapat dilakukan baik pada plat maupun setelah noda
komponen diekstraksi dari plat. Cara mana diantara keduanya yang sebaiknya dipilih,
tergantung dari berbagai persoalan analisa yang dihadapi, seperti misalnya keberulangan
yang diinginkan, sifat komponen-komponen yang akan dipisahkan dan jumlah cuplikan
yang tersedia.
• Salah satu cara analisa kuantitatif yang sering digunakan adalah dengan
mengukur transmisi dari noda yang menyerap sinar ultra violet. Pada cara ini, sinar yang
diabsorpsi oleh sejumlah tertentu luas lapisan absorben, dimana terdapat noda
komponen dibandingkan terhadap sinar yang diabsorpsi oleh sejumlah sama lapisan
absorben yang bersih (tanpa noda komponen). Pada analisa kuantitatif dengan KLT,
keberhasilan analisa sangat dipengaruhi oleh ketelitian volume larutan yang ditotolkan,
besar titik totolan dan jarak antar totolan serta jarak elusi yang berpengaruh pada
besarnya bercak. Pada pengukuran spektrofotometri secara densitometri, faktor-faktor
tersebut akan berpengaruh pada kadar zat yang dianalisa.
• Sumber kesalahan yang lain adalah penggunaan mikrokapiler ukur dan alat
penyuntik mikro (microsyringe) dalam hal penotolan larutan uji pada plat lapis tipis.
Kesalahan tersebut dapat diatasi menggunakan teknik penyemprotan sampel secara
otomatis yang bekerja secara elektronik. Larutan dalam microsyringe disemprotkan pada
KLT menggunakan gas nitrogen. Dengan teknik penotolan ini, noda bercak yang terbentuk
setelah dielusi diharapkan dapat terpisah dengan baik.
•
• Noda yang mempunyai sifat dapat mengabsorpsi sebagian sinar, dapat terdeteksi hanya jika
bahan plat yang dipakai tidak mengabsorpsi terlalu kuat pada panjang gelombang pengukuran.
Pengukuran sinar yang diabsorpsi tidak perlu dilakukan pada seluruh noda. Pengukuran tesebut
cukup dilakukan hanya pada sebagian kecil noda saja. Untuk itu harus digunakan lebar celah
sinar yang cukup sempit.
• Alat yang dipakai untuk mengukur transmisi sinar ini disebut densitometer dan
prinsip pengukurannya adalah sebagai berikut ini :
• Berkas sinar dengan panjang gelombang tertentu, melalui suatu celah yang sempit,
dikenakan dan digerakkan sepanjang plat kromatogram. Pada waktu sinar datang pada lapisan
absorban tanpa noda, maka sinar dipantulkan kembali seluruhnya (gambar). Sebaliknya jika
sinar datang pada lapisan absorban, dimana terdapat noda, maka sebagian sinar akan diserap
oleh noda. Oleh karena itu, jumlah sinar yang dipantulkan akan berkurang.
• Perbedaan intensitas sinar ini yang diubah oleh detektor menjadi signal listrik dan
dicatat oleh pencatat atau rekorder sebagai suatu puncak seperti pada gambar. Alat
densitometer yang telah dilengkapi dengan pencatat dikenal dengan nama TLC – Scanner.
• Luas puncak atau tinggi puncak dari kromatogram ( a ) di atas sebanding dengan
intensitas noda komponen yang berarti pula sebanding dengan konsentrasi komponen. Prinsip
inilah yang dijadikan dasar analisa kuantitatif.
•
• Adapun prinsip dari analisa kuantitatif secara spektrofotodensitometri
dengan TLC – Scanner adalah plat yang sudah dipisahkan dimasukkan
dalam spektrofotodensitometer, kemudian bercak dikenai sumber cahaya
atau gelombang elektromagnetik kemudian direfraksi di detektor, direkam
dalam rekorder. Dengan mengingat keterbatasan pemisahan senyawa
kompleks, pemakaian metode spektrofotodensitometri untuk analisa
kuantitatif masih sangat terbatas, tetapi metode ini memiliki berbagai
keuntungan, antara lain :
• a. Evaluasi kuantitatif dapat diulang tanpa harus melakukan pemisahan
kromatogram lagi. Misalnya selektivitas penetapan dapat
diperbaiki dengan merubah model scanning atau panjang gelombang
yang digunakan.
• b. Sensitivitas deteksi dapat lebih ditingkatkan dengan tidak adanya fasa
gerak.
• c. Waktu scanning atau pengamatan lebih santai karena dapat
dihentikan sewaktu-waktu pada panjang gelombang yang dikehendaki.
• perangkat pemilih panjang gelombang ( monokromator ), detektor, serta rekorder.
• 1. Sumber cahaya
• Sebagai sumber cahaya digunakan lampu Deuterium untuk daerah ultraviolet
• ( 200 – 370 nm ), daerah cahaya tampak digunakan lampu Halogen ( 370 – 700 nm ). Apabila
pengukuran dengan intensitas yang lebih tinggi digunakan lampu Mercury ( Hg ) atau Xenon. Lampu-
lampu tersebut dipilih salah satu sesuai dengan kebutuhan.
•
• 2. Perangkat Pemilih Panjang Gelombang ( Monokromator )
• Sumber cahaya yang digunakan biasanya memancarkan radiasi kontinyu pada panjang gelombang
yang lebar. Tetapi pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang hampir monokromatis, atau
idealnya monokromatis. Maka diperlukan alat yang dapat memisahkan radiasi polikromatis menjadi
hampir monokromatis. Ini berupa filler atau monokromator. Bagian-bagian monokromator meliputi :
• a) Celah masuk ( entrance slit )
• Tempat masuknya radiasi dari sumber cahaya
• b) Collimator Mirror
• Berupa lensa atau cermin cekung untuk mensejajarkan cahaya
• c) Alat Dispersi
• Berupa cermin untuk menguraiakan radiasi panjang gelombang
• d) Concave Mirror
• Berupa lensa atau cermin cekung untuk memfokuskan cahaya
• e) Celah keluar ( exit slit )
• e. Instrumentasi
• Alat TLC – Scanner mempunyai rancang bangun tertentu, meliputi sumber cahaya, perangkat
pemilih panjang gelombang ( monokromator ), detektor, serta rekorder.
• 1. Sumber cahaya
• Sebagai sumber cahaya digunakan lampu Deuterium untuk daerah ultraviolet
• ( 200 – 370 nm ), daerah cahaya tampak digunakan lampu Halogen ( 370 – 700 nm ). Apabila
pengukuran dengan intensitas yang lebih tinggi digunakan lampu Mercury ( Hg ) atau Xenon. Lampu-
lampu tersebut dipilih salah satu sesuai dengan kebutuhan.
•
• 2. Perangkat Pemilih Panjang Gelombang ( Monokromator )
• Sumber cahaya yang digunakan biasanya memancarkan radiasi kontinyu pada panjang gelombang
yang lebar. Tetapi pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang hampir monokromatis, atau
idealnya monokromatis. Maka diperlukan alat yang dapat memisahkan radiasi polikromatis menjadi
hampir monokromatis. Ini berupa filler atau monokromator. Bagian-bagian monokromator meliputi :
• a) Celah masuk ( entrance slit )
• Tempat masuknya radiasi dari sumber cahaya
• b) Collimator Mirror
• Berupa lensa atau cermin cekung untuk mensejajarkan cahaya
• c) Alat Dispersi
• Berupa cermin untuk menguraiakan radiasi panjang gelombang
• d) Concave Mirror
• Berupa lensa atau cermin cekung untuk memfokuskan cahaya
• e) Celah keluar ( exit slit )
• Tempat keluarnya radiasi yang hampir monokromatis jatuh tegak lurus menuju sampel
• 3. Detektor.
• Foton dari cahaya tampak atau ultraviolet
mempunyai cukup energi untuk melepaskan
elektron dari permukaan senyawa tertentu. Aliran
elektron semikonduktor menimbulkan arus listrik
sebanding dengan foton yang diserap.
•
• 4. Rekorder
• Sinyal elektronik yang dihasilkan oleh
detektor harus diubah menjadi bentuk yang dapat
diinterpretasikan. Hal ini dilakukan menggunakann
alat elektronik berupa rekorder atau komputer.
• f. METODE SCANNING
• Dalam spektrofotodensitometri terdapat dua macam metode scanning, yaitu :
• 1) Linear Scanning ( Slit Scanning )
• Gambar Skema Slit Scanning
•
• Berkas sinar berupa celah panjang ( harus lebih besar dari lebar noda ), memayar plat KLT ke arah
lebar.
•
• 2) Zigzag Scanning ( Flying Spot Scanning )
• Berkas sinar berupa bujur sangkar, memayar ke kiri – kanan, mencakup keseluruhan bercak sambil
maju lurus bertahap ke arah tertentu.
•
• Gambar Skema Zigzag Scanning
•
• Dua cara Scanning tersebut, bukan sumber sinar yang bergerak, tetapi plat KLT yang bergerak.
Gerakan ini menurut sumbu X dan sumbu Y, sehingga kebebasan untuk mengatur sebelumnya sesuai
dengan tujuan analisa. Noda hendaknya bulat dan teratur agar memberikan hasil dengan satu puncak
dan berbentuk simetris, namun umumnya bercak pada kromatogram tidak selalu mempunyai bentu,
ukuran dan distribusi yang sama. Bercak bulat dan distribusi konsentrasi uniform, scanning linear
sudah cukup. Bercak yang mempunyai bentuk, ukuran dan distribusi konsentrasi yang tidak seragam,
scanning linear tidak memberikan pengukuran yang akurat. Bercak yang demikian digunakan cara
scanning zigzag.
•
• . KROMATOGRAFI GAS
•
• Kromatografi gas adalah suatu cara untuk memisahkan senyawa atsiri dengan melewatkan arus gas melalui
fasa diam. Bila fasa diam berupa zat padat  kromatografi gas padat ( GSC ). Didasarkan pada sifat
penjerapannya kemasan kolom untuk memisahkan cuplikan teutama cuplikan gas. Kemasan kolom yang
lazim dipakai adalah gel adalah silika gel, ayakan molekul dan arang. Bila fasa diam berupa zat cair 
kromatografi gas cair ( GLC ). Fasa cair disaputkan berupa lapisan tipis pada zat padat pembawa dan
pemisahan didasarkan pada partisi, cuplikan yang masuk ke dan keluar dari lapisan zat cair. Banyak fasa cair
yang dapat digunakan sampai suhu 400 oC mengakibatkan kromatografi gas cair merupakan bentuk
kromatografi gas yang paling serba guna dan selektif.
•
• Keuntungan Kromatografi Gas
• a) Kecepatan
• Gas yang merupakan fasa bergerak sangat cepat mengadakan kesetimbangan antara fasa bergerak dengan
fasa diam. Kecepatan gas yang tinggi dapat juga digunakan.
• Hingga waktu pemisahan sangat cepat ( diukur dalam menit).
• b) Sederhana
• Alat kromatografi gas mudah dijalankan dan mudah dipahami. Interpretasi data yang diperoleh cepat dan
langsung, serta mudah.
• c) Sensitif
• GLC ( Gas Liquid Chromatography ) sangat sensitive. Alat yang paling sederhana dapat mendeteksi
konsentrasi dalam ukuran 0,01 % ( = 100 ppm). Alat-alat GLC yang lebih rumit dapat mendeteksi senyawa
yang konsentrasinya hanya beberapa ppm. Disebabkan sensitivias yang tinggi dari GLC maka hanya
memerlukan sejumlah kecil dari cuplikan, biasanya dalam ukuran mikroliter.
• d)
d) Pemisahan ( Resolution = performance )
• Dengan GLC memungkinkan untuk memisahkan molekul-molekul dari suatu
campuran, dimana hal ini tidak mungkin dipisahkan dengan cara-cara lain.
• e) Analisa kualitatif
• Dengan membandingkan waktu retensi. Waktu retensi ialah waktu sejak
penyuntikan sampai maksimum puncak. Sifat ini merupakan ciri khas cuplikan dan
fasa cair pada suhu tertentu. Beberapa senyawa mungkin mempunyai waktu
tambat yang saam atau berdekatan, tetapi tiap senyawa hanya mempunyai satu
waktu tambat saja. Waktu tambat ini tidak terpengaruh oleh adanya komponen
lain.
• f) Analisa kuantitatif
• Dengan penghitungan luas puncak. Luas setiap puncak yang terbentuk berbanding
lurus dengan konsentrasi puncak tersebut.
• g) Alat GLC ( Gas Liquid Chromatography ) dapat dipakai dalam waktu yang lama
dan berulang-ulang.
•
• Dasar kerja GLC adalah sebagai berikut :
• Cuplikan diinjeksikan kedalam injektor. Aliran
gas dari gas pengangkut akan membawa
cuplikan yang telah teruapkan masuk ke
dalam kolom. Kolom akan memisahkan
komponen-komponen dari cuplikan.
Kemudian komponen-komponen dideteksi
oleh detektor dan sinyal dalam bentuk puncak
akan dihasilkan oleh pencatat.
 Keuntungan cara elusi ini adalah :
1. kolom terus menerus dipulihkan oleh fasa gas pembawa
2. biasanya komponen cuplikan terpisahkan secara sempurna dan hanya tercampuri oleh gas
pembawa sehingga pengumpulan dan penentuan kadar menjadi lebih mudah.
3. waktu analisis pendek.
Kekurangannya adalah :
Komponen yang tertahan kuat akan bergerak sangat lambat, atau dalam beberapa kasus tidak
bergerak sama sekali.
1. Gas pengangkut
Gas pengangkut ditempatkan dalam silinder bertekanan tinggi (biasanya 150 atm). Gas yang sering
digunakan : He, Ar, H2, N2
Pemilihan gas sebagai gas pembawa tergantung dari tipe detektor yang digunakan.

Tipe detektor Gas pembawa

TCD H2, He, Ar dan N2
FID N2, Ar, He
FPD N2, He

FTD / NPD He, N2

ECD N2, Ar + 10 % CH4
 Syarat gas pengangkut :

• a. harus inert, tidak bereaksi dengan

cuplikan, pelarut dan material dalam kolom.
• b. murni dan mudah diperoleh.
• c. sesuai/cocok untuk detektor.
• d. harus mengurangi difusi gas sehingga
diperoleh koefisien difusi rendah.
• 2. Pengatur tekanan dan pengatur aliran
• Disebut pengatur atau pengurang Drager. Drager bekerja baik pada
2,5 atm, dan mengalirkan massa aliran dengan tetap. Tekanan lebih pada
tempat masuk kolom diperlukan untuk mengalirkan cuplikan masuk
kedalam kolom. Suhu kolom tetap diatur oleh thermostat, maka aliran gas
tetap yang masuk kolom akan tetap juga. Juga komponen-komponen akan
dielusikan pada waktu yang tetap disebut waktu penahanan (the retention
time), tR. Karena kecepatan gas tetap, maka komponen juga mempunyai
volume karakteristik terhadap gas pengangkut = volume penahanan (the
retention volume), VR. Kecepatan gas akan mempengaruhi efisiensi kolom.
• Harga-harga yang umum untuk kecepatan gas untuk kolom yang memiliki
• diameter luar : ¼ inch
• kecepatan gas : 75 ml / menit
• 1/8 inch : kecepatan gas 25 ml / menit
• Laju aliran optimum dapat ditentukan dengan berdasarkan percobaan,
denagn membuat grafik Van Deemter, H vs kecepatan gas linier. Laju aliran
yang paling efisien ialah pada H minimum atau pelat maksimum
• 3. Tempat Injeksi
• Cuplikan harus dalam bentuk fasa uap. Gas dan uap
dapat dimasukkan secara langsung. Kebanyakan senyawa
organik berbentuk cairan dan padatan, untuk itu perlu
diuapkan dulu. Ini perlu pemanasan sebelum masuk dalam
kolom. Panas itu terdapat pada tempat injeksi. Suhu tempat
injeksi sekitar 50 oC lebih tinggi dari titik didih campuran
dari cuplikan yang mempunyai titik didih yang paling tinggi.
Suhu tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi, sebab
kemungkinan akan terjadi perubahan karena pana atau
peruraian dari senyawa yang akan dianalisa. Cuplikan
dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan
melalui tempat injeksi dengan pertolongan jarum injeksi
yang sering disebut “ a gas tight syringe “. Karena GLC
sensitive, maka cuplikan tidak boleh diinjeksikan terlalu
banyak. Biasanya diinjeksikan 0,5 – 50 µl untuk gas dan 0,2 –
20 µl untuk cairan, padat terlarut 0,1 – 3 mg.
 4. Kolom
Bentuk dari kolom dapat lurus, bengkok misal berbentuk V atau W, dan kumparan/spiral.
Biasanya bentuk dari kolom adalah kumparan. Kolom selalu merupakan tabung.
Tabung dapat terbuat dari :
· Tembaga (murah dan mudah diperoleh), bereaksi dengan amina, asetilen, steroid, terpen.
· Plastik (Teflon) dipakai pada suhu yang tidak terlalu tinggi.
· Baja (stainless steel), mahal
· Aluminium
· Gelas
Panjang kolom dapat dari 1 m sampai 3 m. Diameter kolom mempunyai berbagai ukuran,
biasanya pengukuran berdasarkan diameter dalam dari kolom gelas yaitu 0,3 mm hingga 5 mm.
Kebanyakan kolom yang digunakan berupa stainless steel dengan diameter luar (OD) dari 1/8
atau ¼ inch ( 0,3 atau 0,6 cm ). PAda GSC, kolom diisi dengan penyerap (adsorbent), sedangkan
GLC, kolom diisi dengan “solid support” (padatan pendukung) yang diikat oleh fasa diam.
a. Jenis kolom
Volum cuplikan untuk berbagai kolom :
Ukuran Cuplikan
Jenis kolom
Gas Zat cair
Preparatif
0,05 – 5 liter 0,02 – 2 l
DL 1”, fasa cair 20 %
Analisis biasa
0,5 – 50 ml 0,2 – 20 l
DL ¼ “,fasa cair 10 %
Sangat efisien
0,1 – 10 ml 0,04 – 4 l
DL 1/8 “, fasa cair 2 %
Kapiler
0,1 – 10 ml 0,004 – 0,5 l
DL 1/6 “,lapis tipis 5,0 
• Pada dasarnya kolom kromatografi gas dibedakan menjadi
dua yaitu :
• 1) Kolom kemas, mempunyai ukuran panjang 1 – 4 m dan
diameter dalam 1,6 – 9,5 mm.
• 2) Kolom kapiler, mempunyai ukuran panjang 10 – 100 m
dengan diameter dalam berkisar 0,2 – 1,2 mm.
• Kolom kapiler dibagi menjadi dua yaitu kolom “micro
packed” dan “open tubular”.
• Tiga tipe kolom “open tubular” yaitu :
• · SCOT : Solid Coated Open Tubular
• · PLOT : Porous Layer Open Tubular
• · WCOT : Wall Coated Porous Tubular
• WCOT adalah tipe kolom yang banyak digunakan dengan
ukuran panjang 10 – 30 m, diameter dalam 0,53 mm dan
tebal lapisan 1 – 2 m.
Tipe kolom dan jumlah pelat teori (N)

Jenis kolom Dimensi Jumlah pelat teori (N)

Kolom kemas 2 m x 2,1 mm 7000

4 m x 2,1 mm 14000

Kolom “wide bore” 10 m x 0,53 mm 11000

25 m x 0,53 mm 26000
100 x 0,53 mm 10000

Kolom kapiler 25 x 0,53 mm 110000

• b. Isi kolom
• 1) Padatan pendukung
• Padatan pendukung berfungsi mengikat fasa
diam.Kebanyakan zat ini berupa tanah diatomae yang telah
dipanaskan/dikeringkan. Padatan pendukung mempunyai luas permukaan
yang besar yang dibutuhkan untuk mendistribusi fasa diam yang bersifat
cairan dalam CLC.
• Persyaratan dari padatan pendukung yang baik :
• a) Inert (tidak mengerp cuplikan).
• b) Kuat, stabil pada suhu suhu yang tinggi.
• c) Memiliki luas permukaan yang besar 1 – 20 m2/g.
• d) Permukaan yang teratur, ukuran yang sama : ukuran pori sekitar 10 .
• e) Harus mempunyai tahanan yang rendah terhadapgas pengangkut.
• Padatan pendukung yang biasa digunakan adalah Keisulguhr
(forementionned-diatomaceus earth). Nama dalam perdagangan :
• · Diatoport
• · Celite
• · Chromosorb
• Padatan pendukung ini terutama terdiri dari SiO2
• 91 % - SiO2
• 5 % - Al2O3
• 2 % - Fe2CO3
• 0,5 % - CaO dan oksida oksida lainnya
• Yang paling penting adalah Chromosorb. Ada beberapa jenis Chromosorb
• · Chromosorb G : luas permukaannya kecil (0,5 m2/g),hingga hanya dapat digunakan untuk
mengikat fasa cair dalam jumlah yang sedikit (  5 % ), merupakan materi yang sangat keras; baik
untuk pemisahan senyawa-senyawa polar.
• · Chromosorb P : berwarna kemerah-merahan (P=pink); digunakan untuk senyawa-senyawa
yang apolar terutama hidrokarbon.
• · Cromosorb W : berwarna putih, agak mudah hancur, terutama digunakan untuk senyawa
senyawa polar.
• Ukuran dari padatan pendukung yang digunakan adalah :
• · untuk kolom 1/8 inch : 100/120 atau 80/100 mesh
• · untuk kolom ¼ inch : 60/80 atau 40/60 mesh.
• 100/120 mesh  0,15 – 0,13 mm ; 80/100 mesh  0,18 – 0,15 mm
• 60/80 mesh  0,25 – 0,18 mm ; 40/60 mesh  0,40 – 0,25 mm
• Deaktivasi permukaan padatan pendukung pada kolom kapiler dilakukan karena adanya gugus
silanol pada permukaan silika gel merupakan problem, bila senyawa yang akan dipisahkan
merupakan senyawa-senyawa polar (alkohol-alkohol atau hidrokarbon aromatis) akan
teradsorpsi oleh gugus-gugus silanol tersebut sehingga kan mempengaruhi ke hasil
kromatogram, akan terjadi peak brodening atau peak tailing.
•
• OH OH OH OH OH OH
• O O O O O
• Si Si Si Si Si Si
•
•
•
•
• Deaktivasi padatan pendukung dilakukan dengan Reaksi Silanisasi :
•
• CH3 CH3
•
•

• - Si – OH + Cl – Si – Cl  - Si – O – Si – Cl + HCl
•
•

• CH3 CH3
•
• CH3 CH3
•
• - Si – O – Si – Cl + CH3 – OH  - Si – O – Si – OCH3 + HCl
•
• CH3 CH3
•
• (Silanisasi)
• 2) Fasa Diam
• Dalam GLC fasa diam berupa cairan. Pada fasa cairan ini pemisahan
komponen-komponen dari cuplikan terjadi. Dasar kerja adalah Partisi
antara fasa caian dan fasa gerak (gas).
• Persyaratan untuk fasa cair yang baik adalah sebagai berikut :
• a) Cuplikan-cuplikan harus menunjukkan koefisien distribusi yang
berbeda.
• b) Cuplikan-cuplikan harus mempunyai kelarutan tertentu dalam pelarut
(fasa cair).
• c) Fasa cair harus mempunyai tekanan uap yang sangat rendah pada
suhu-suhu yang tinggi : 0,01 – 0,1 mm Hg.
• d) Secara kimia harus stabil dan inert.
• e) Harus mempunyai kekentalan yang rendah, sehingga tidak mengikat
gas.
• f) Harus dengan baik tersebar dan mengikat pada padatan pendukung.
• g) Harus larut dengan baik pada pelarut organik yang mempunyai titik
didh rendah.
•
Beberapa fasa cair yang digunakan

Fasa cair Jenis cuplikan Polaritas Suhu

maksimum
Squalene Hidrokarbon Non polar 125 oC
Metilsilikon Steroid, Non polar 300 oC
Peptida,
Alkaloida, Ester
Sianosilikon Semua jenis Agak polar 275 oC
Resin Senyawa amino Polar 300 oC
poliamida
Carbowax Alkohol, amino Polar 250 oC
20 aromatik,keton

Pemilihan fasa diam didasarkan pada cuplikan-larutan dalam fasa cair. Dengan
kata lain dari komponen cuplikan dan fasa diam harus sama untuk memperoleh
pemisahan yang baik. Sehingga senyawa polar akan terpisah dengan baik pada
fasa cair yang polar dan senyawa senyawa non polar akan terpisah dengan baik
pada fasa cair yang non polar.
• c. Suhu Kolom
• Suhu kolom harus cukup tinggi sehingga analisis dapat diselesaikan dalam waktu yang layak dan
harus cukup rendah sehingga pemisahan yang dikehendaki tercapai.
• Aturan umum :
• Kenaikan 30 oC dapat menurunkan ½ harga k sehingga menurunkan ½ dari tR menyebabkan waktu
analisis akan turun.
• Jadi suhu kolom yang baik adalah :
• · Harga rata-rata dari titik didih sampel
• - Di atas titik lebur dari sampel
• - Tergantung dari % fasa cair pada padatan pendukung
• - Di bawah suhu maksimum kolom
•
• d. Dasar kerja kolom
• Dasar kerja kolom dalam GLC adalah pemisahan komponen-komponen dari cuplikan terjadi di antara
gas pengangkut dan fasa cair. Proses pemisahan dapat dipandang sebagai serangkaian dari partisi
dimana cuplikan masuk ke dalam larutan dari fasa dan selang waktu akan teruapkan lagi. Di dalam
GLC harus diketahui juga tentang waktu penahanan ( the retention time ) = tR yaitu waktu dimana
cuplikan ditahan oleh fasa diam.
•
• e. Kromatografi gas suhu konstan (Isotermal)
• Kromatogram gas biasnya diperoleh dengan kolom yang dijaga pada suhu konstan (isotermal).
Kerugiannya :
• · puncak-puncak awal tajam, berimpitan (resolusi jelek), puncak-puncak akhir rendah, melebar.
• · Senyawa-senyawa dengan titik didih tinggi sering tidak terdeteksi (utamanya : campuran yang
tidak diketahui komposisinya dan rentang titik didihnya lebar)
• · Untuk itu dihindari dengan ”PROGRAM SUHU”
• f. Kromatografi gas suhu terprogram
• Kelebihan :
• · mengijinkan pemisahan senyawa dengan rentang titik didih yang
luas jauh lebih cepat dibanding teknik isotermal.
• · Puncak-puncak kromatogram lebih tajam/ramping dan bentuknya
lebih seragam, dengan demikian :
•
• 5. Detektor
• Pada detektor, komponen-komponen cuplikan yang telah terpisah
dideteksi. Ciri detektor yang dikehendaki adalah :
• · kepekaannya tinggi
• · tingkat deraunya rendah
• · kelinieran tanggapannya lebar
• · tanggap terhadap semua jenis senyawa
• · kuat
• · tidak peka terhadap perubahan aliran dan suhu
• · harganya murah
 Sehingga detektor
• a) Detektor hantaran panas ( The Thermal
Conductivity Detector = TCD ) juga disebut
memberikan data :
Katharometer.
• b) Detektor ionisasi nyala ( The Flame Ionisation • a) Kualitatif : mendeteksi ada beberapa
Detector = FID ) komponen terelusi
• c) Detektor mengubah sejumlah sifat-sifat • b) Kuantitatif : kebanyakan luasan dari puncak
molekul dari senyawa organik menjadi arus yang terelusi sebanding dengan massa
listrik. Arus ini diteruskan ke pencatat untuk komponen yang terelusi.
menghasilkan kromatogram.
• d) Komponen merupakan gambar dari jawaban
(respon) detektor vs waktu.

Dua macam detektor

yang populer :
• Detektor hantaran panas (TCD) peka terhadap konsentrasi, tetapi juga tergantung pada kecepatan
dari gas pengangkut. Hingga untuk analisa kuantitatif yang teliti kecepatan gas pengangkut harus
dibuat tetap.
• Keuntungan TCD :
• · tidak merusak cuplikan
• · semua macam molekul dapat dideteksi
• Kekurangan TCD :
• a. kurang sensitif, biasanya 6 x 10 –10 g / det
• b. FID hampir peka terhadap semua senyawa, kecuali H2O, CS2 dan beberapa gas (gas mulia, O2,
N2). FID tidakmemberikan puncak udara. FID sangat tergantung pada kecepatan alir gas.
•
• Kecepatan alir gas yang paling baik adalah :
• Gas pengangkut N2 : 30 ml/min atau dengan perbandingan 1 : 1 : 10
• H2 : 30 ml/min
• Udara : 300 ml/min
• Keuntungan FID :
• sangat sensitif  9 x 10 –13 g/det   1000 x lebih sensitif daripada TCD, perbandingan jumlah
minimum yang dapat dideteksi oleh :
• FID  2.10 –11
• TCD  1.10-5
• Kerugian FID
• cuplikan harus dibakar, sehingga cuplikan menjadi rusak.
• 6. Rekorder
• Alat ini berupa gawai listrik mekanik untuk menghasilkan krpmatogram. Untuk menghasilkan hasil
kuantitatif yang teliti, harus dicek tentang kelinieran, rentang, kecepatan pena, pita mati dan nol
listrik.
•
• 7. Suhu Pada GLC / Termostat
• Ada tiga macam suhu yang penting untuk pemisahan yang baik dalam GLC
• a. Suhu tempat injeksi
• Disimpulkan sebagai berikut :
• 1) Harus cukup tinggi untuk menguapkan cuplikan. Biasanya = 50 oC lebih tinggi daripada titik didih
dari komponen cuplikan. Harus dicoba hingga diperoleh bentuk puncak yang paling baik.
• 2) Tidak telalu tinggi sebab kalau terlalu tinggi akibatnya kemungkinan terjadinya perubahan oleh
panas atau peruraian dari molekul-molekul.
•
• b. Suhu kolom
• 1) Dalam semua hal : di atas titiklebur dari fasa cair, tetapi di bawah suhu maksimum yang
diperbolehkan dari fasa cair.
• 2) Dalam praktek suhu kolom berdasarkan atas kompromi.
• Suhu suhu yang lebih rendah memberikan pemisahan lebih baik, tetapi waktu retensi lebih panjang.
• 3) Waktu retensi menjadi lipat dua untuk setiap 30 oC penurunan suhu kolom.
•
• c. Suhu detektor
• Cukup tinggi untuk mencegah kondensasi dari cuplikan. Keadaan ini dapat dilihat pada kromatogram
dengan adanya pelebaran puncak atau hilangnya puncak.
• Dengan TCD (The Thermal Conductivity Detector), suhu detektor harus tetap dijaga, tetap  0,1 oC.
• Untuk FID ( The Flame Ionisation Detector), pengontrolan suhu tidak begitu penting.
•
• 1. Derivatisasi
• Beberapa sampel tidak dapat langsung diinjeksikan pada Kromatografi gas, karena :
• · polaritasnya tinggi
• · volatilitasnya rendah
• · tidak stabil terhadap panas
• Untuk itu dibuat derivat yang volatil, umumnya dengan pereaksi sililasi dengan
Si(CH3)3 atau special silyating agents yang mengandung Cl, Br.
• Derivatisasi pada kromatografi gas bertujuan untuk :
• · merubah struktur molekul atau polaritas analit untuk tujuan kromatografi yang baik
• · untuk menstabilkan analit
• · untuk meningkatkan kemampuan deteksi
• · untuk merubah matriks guna pemisahan yang lebih baik
• Reaksi derivatisasi sebaiknya :
• · cepat dan kuantitatif
• · hasil samping seminimal mungkin
• · kelebihan pereaksi harus tidak mengganggu analit atau mudah dihilangkan dari
campuran
• Pada kromatogram gas normal, tidak ada puncak-puncak kecil, tetapi
berupa bentuk-bentuk kurva yang disebut kurva-kurva Gauss (pelebaran
puncak), bila keadaannya lebih jelek akan menghasilkan puncak-puncak
berekor atau pemanjangan di muka.
• Hal ini disebabkan adanya :
• a. Difusi Eddy (olakan) : difusi ini disebabkan oleh kenyataan bahwa
kecepatan gas pengangkut tidak sama di dalam seluruh kolom. Ini
disebabkan oleh kenyataan, bahwa bagian-bagian dari pori yang dilalui
tidak sama panjang “Multipath Effect” (pengaruh jalan berganda).
• b. Difusi molekular : terutama dalam fasa gas, molekul-molekul cuplikan
dapat bergerak dalam arah yang salah disebabkan oleh difusi.
• c. Kesetimbangan yang lambat : beberapa molekul tetap tinggal lama,
lainnya sebentar dalam fasa diam (hal ini disebabkan oleh perbedaan-
perbedaan suhu yang kecil).
• d. Harga k tidak tetap : disebabkan perbedaan rasio distribusi dalam
kolom.
• Keempat faktor ini menyebabkan perbedaan puncak.
• Faktor 1,2,3 memberikan pelebaran puncak yang simetris.
• Faktor 4 menyebabkan pelebaran puncak yang tidak simetris.
• Pelebaran-pelebaran puncak terjadi dalam berbagai metoda analisa. Dalam
keadaan yang paling buruk dapat menyebabkan puncak saling tumpang tindih.
• Pemisahan R (resolution) adalah pemisahan nyata antara dua puncak berdekatan :
•
• 2d
• R =  dalam hal dua puncak dengan luas sama
• W1 + W2
•
• Jika R = 1 pemisahan adalah 98 %
• Untuk pemisahan yang baik R harus : R ≥ 1,5 ini berarti pemisahan ≥ 99,7 %.
• Pemisahan dari puncak-puncak dalam kromatografi erat hubungannya dengan dua faktor :
• a. Efisiensi kolom : pelebaran puncak merupakan hasil dari bentuk kolom dan kondisi
operasi.
• b. Efisiensi pelarut : hasil dari interaksi cuplikan dengan fasa diam, efisiensi pelarut
menentukan kedudukan relative dari jalur-jalur solue pada sebuah kromatogram.
• a. Efisiensi Kolom
• Efisiensi kolom diukur sebagai jumlah pelat teoritis : N
•
•
L
• HETP = 
N
•
• N = jumlah pelat teoritis dari suatu kolom
• L = panjang (cm) dari kolom tersebut
• Efisiensi kolom tergantung pada :
• · pelarut = fasa diam
• · solut/zat yang dilarutkan = cuplikan
• · suhu
• · kecepatan aliran (dari gas pengangkut)
• · ukuran dari cuplikan
•
• a. Teori Pelat
• Pelat atau lebih baik HETP, adalah tinggi (atau panjang) dari kolom yang cukup untuk
tercapainya kesetimbangan antara solut dalam fasa gerak dan fasa cair yang tetap.
Lebih banyak pelat yang dimiliki oleh kolom, akan memberikan puncak yang lebih
kecil, atau efisiensi lebih baik.
• Pelat teoritis berhubungan dengan pelebaran puncak pada kromatogram.
•
•
•
•
• L 2
• HETP =  =  L
• N x2
•
• N = 16 ( x/y)2 ini berasal dari N = (x/) 2 dimana y = 4
• X = jarak dari injeksi ke puncak maksimum
• Y = panjang dari garis dasar terpotong oleh tangen-tangen dari kurva pada titik-titik
• pertemuan (biasanya 2/3 dari tinggi)
•  = deviasi standar
• b. Teori Kelajuan / Kecepatan
• Teori kelajuan dikembangkan oleh Van Deemter, bentuk persamaan tersebut :
•
• HETP = A + B/µ + Cµ
•
• µ : kecepatan linier gas (atau kelajuan aliran) melalui kolom :
panjang kolom (cm)
• µ= 
waktu penahanan udara (det)
•
• A : difusi olakan ( the eddy diffusion = efek jalan ganda)
• B : difusi molekular : pendefusian solut dalam gas pengangkut
• C : penahanan terhadap perpindahan massa
•
• Ini adalah ukuran dari jumlah atau kekentalan dari fasa diam (cair) di dalam kolom. Jika harga-harga A,
B dan C tertentu, maka kita dapat melihat persamaan dasar Van Deemteer harus terdapat kecepatan
kelajuan gas pengangkut optimum, dimana akan bekerja pada keadaan tersebut.
•
• µopt = HETPopt
• Jika digambarkan :
•
•
• HETP = A + B/µ + Cµ
• HETPmin = A + 2  B.C
• Untuk meningkatkan efisiensi kolom :
• a. Padatan pendukung harus terbuat dari partikel-partikel yang kecil, ukurannya sama
• b. Kecepatan alir gas pengangkut adalah optimum pada HETPopt
• c. Gas pengangkut BMnya besar, biasanya N2
• d. Fasa diam yang digunakan harus mempunyai kekentalan rendah.
• e. Jumlah fasa diam yang dipakai biasanya 1 – 10 % berat padatan pendukung.
• f. Perbandingan antara gas pengangkut yang masuk dan keluar harus rendah tekanan yang masuk
1,5 – 2,5 atm.
• g. Pemisahan akan lebih baik pada suhu kolom yang rendah  analisa lama.
• h. Diameter kolom kecil  pemisahan baik ( 1/8 atau 1/16 inch ).
•
• b. Efisiensi Pelarut
• Efisiensi pelarut didefinisikan sebagai perbandingan dari koefisien-koefisien partisi, atau waktu-
waktu retensi yang teratur.
•
•
• x1, x2 : waktu retensi (volume) dari puncak 1,2
• x1’, x2’ : waktu retensi terkoreksi atau diatur dari puncak 1,2
• Efisiensi pelarut,  = x2’ / x1’ = k2/k1
• Koefisien distribusi (=partisi),k , tergantung pada suhu.
• Harga k turun dengan kenaikan suhu, karena molekul-molekul akan lebih lama berada dalam fasa
gas pada suhu yang lebih tinggi.
•
• Untuk menghitung jumlah teoritis yang dibutuhkan, juga menentukan panjang kolom yang
diperlukan adalah :
•
 k2’ + 1
• N yang dibutuhkan = 16 R2 (  ) 2 ( ) 2
-x k2’
•
• R : pemisahan (resolution)
•  : efisiensi pelarut
• k2’ : faktor kapasitas
• waktu retensi terkoreksi
• 
• waktu retensi udara
•
• Pemakaian umum KGC:
• · pemisahan dan identifikasi semua tipe senyawa organik volatile
• · penentuan kualitatif dan kuantitatif
• · dapat menentukan konformasi molekul (isomer) dan stereoisomer
• · dapat diautomatisasikan
• Penggunaan lazim
• · pemisahan snyawa dalam campuran dan deteksi untuk identifikasi kualitatif dan kuantitatif
• · digunakan dalam industri untuk analisis bahan dasar, intermediet atau produk akhir
• · digunakan dalam pemakaian di lingkungan, forensik, farmasi dan klinik/kedokteran
• Kromatografi gas telah digunakan secara
berhasil terhadap sejumlah besar senyawa-
senyawa dalam berbagai bidang baik terhadap
senyawa organik maupun anorganik. Bahkan
senyawa logam sebagai khelat yang mudah
menguap dapat ditangani secara memuaskan.
Persyaratan yang dibutuhkan hanya tekanan
uap yang cocok pada suhu saat analisa akan
dilakukan.
 ANALISIS KROMATOGRAFI GAS
• 1. Analisis kualitatif
• Tujuan dari analisa kualitatif pada GLC adalah identifikasi
dari suatu komponen atau lebih dari duatu cuplikan. Jika ingin
menguji dua senyawa adalah sama dengan GLC maka diperlukan :
• · melakukan analisa dua kali pada dua kolom yang berbeda.
• · Dua analisa yang lain pada suhu yang berbeda.
• Bila kemudian ternyata didapatkan bahwa waktu waktu
retensinya sama, maka kita dapat mengatakan bahwa dua senyawa
adalah sama.
• Waktu retensi dari suatu senyawa dapat diulang dengan hasil yang
sama, tetapi waktu retensi yang tidak terkoreksi jarang digunakan
karena tergantung dari panjang dan diameter kolom, fasa cair, suhu
kolom, kecepatan aliran, jenis gas pembawa, “dead volume” dari
peralatan, sehingga yang paling baik adalah menggunakan waktu
retensi relatif.
 ANALISIS KROMATOGRAFI GAS
• 2. Analisa kuantitatif
• Analisa kuantitatif dalam GLC berarti menentukan
jumlah ( % ) dari komponen komponen yang terpisah dari
suatu cuplikan. Respon detektor dibuat nyala oleh
pencatat, dapat diubah menjadi konsentrasi/berat dari
suatu komponen dari cuplikan. Hal hal yang perlu dilakukan
dalam analisa kuantitatif adalah :
• a. Cara cara pengukuran puncak
• Dengan cara mengukur ketinggian puncak dan
mencari luas puncak
• b. Faktor faktor koreksi
• c. Standarisasi, digunakan dua cara :
• 1) Eksternal
• Dengan cara jumlah yang pasti dari cuplikabn murni diinjeksikan. Harga dari luasan puncak kemudian
digambarkan lawan berat berat senyawa yang diketahui yang diinjeksikan hingga diperoleh kurva
kalibrasi. Kelinieran dari sistem untuk larutan berarti bahwa :
Area/luas
• Konstanta (C) = 
Konsentrasi
• Konsentrasi dari cuplikan yang tidak diketahui :
Luas terukur
• Konsentrasi = 
Konstanta (C)
• 2) Internal
• Mempunyai keuntungan yang utama yaitu bahwa kita tidak memerlukan volume yang diketahui
untuk diinjeksikan .
• Caranya adalah sebagai berikut :
• Tambahkan pada cuplikan dengan berat yang tepat sejumlah standar internal, juga berat yang tepat
dengan konsentrasi kira-kira sama (biasanya 10 %)
• Tentukan faktor koreksi dalam suatu analisa yang terpisah, untuk semua komponen yang diukur.
• Persen berat dari setiap komponen cuplikan dapat dihitung dengan :
•
• Luas senyawa x berat standar internal x 100
• % berat = 
• faktor koreksi x luas standar internal x berat cuplikan
• d. Kesalahan kesalahan dalam analisis
• Kemungkinan kesalahan kesalahan pada
analisis dapat timbul sari :
• · Cara penyiapan cuplikan
• · Penampilan detektor
• · Cara kuantitatif
• · Penghitungan
•
 UJI KESESUAIAN SISTEM
• Merupakan suatu aplikasi umum pada instrumen kromatografi
gas.Konsep uji kesesuaian sistem tersebut berdasarkan bahwa baik
sistem instrumen,pereaksi, kondisi percobaan,metode analisis,
contoh maupun analisis adalah merupakan sistem yang harus diuji
fungsinya. Tujuannya adalah untuk mengetahui apakah suatu sistem
kromatografi gas yang digunakan memenuhi syarat yang telah
ditentukan sehingga mutu data yang dihasilkan dapt dipercaya dan
dipertanggungjawabkan. Menurut FI Ed IV data kesesuaian sistem
diperoleh dari hasil penyuntikan berulangkali ( 5 – 6 kali ) baik dari
larutan baku maupun larutan uji. Dilakukan sebelum kromatografi
gas digunakan. Parameternya meliputi presisi, faktor ikutan (tailing
factor), resolusi, efisiensi kolom dan waktu retensi relatif.
•
 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
(KCKT)
• Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan pengembangan dari
kromatografi kolom,mekanisme pemisahan yang terjadi pada fasa diam dari
kromatografi dengan cara berbeda-beda. Pemisahan sangat tergantung hubungan
antara fasa diam dan senyawa yang diuji atau linarut. Kromatografi kolom sevara
umum dikenal sebagai kromatografi yang mempunyai fasa diam padatan atau
solid, dan fasa gerak cairan,sehingga disebut Liquid solid chromatography, atau
LSC. Kromatografi kolom pada umumnya digunakan untuk pemisahan secara kasar
sehingga hasil yang didapatkan belum murni. Dari kromatografi kolom (LSC)
dikembangkan dengan sistem tertutup, perpindahan massanya semula hanya
karena gravitasi,kemudian dikembangkan dengan menggunakan tekanan, karena
itu namanya disebut High Pressure Liquid Chromatography atau HPLC.
• Perkembangan teknologi turut mempengaruhi penampilan HPLC ini seperti
otomatisasi, komputerisasi maka penampilan alat pemisahan ini lebih banyak
difungsikan sebagai alat analisis dan mempunyai penampilan yang
mengagumkan,sehingga HPLC menjadi High Performance Liquid Chromatography
• HPLC diterjemahkan menjadi Kromatografi Cair Tekanan Tinggi atau Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (KCKT).Semula kegunaan dan tipe KCKT terutama untuk analissi
kemudian kegunan untuk pemisahanpun dikembangkan, maka faktor yang sangat
berpengaruh dalam mekanisme pemisahan selalu terjadi,seperti :
• a. daya serap zat atau kapasitas fasa diam
• b. ukuran partikel fasa diam
• c. bentuk susunan partikel fasa diam
• d. sifat pelarut
• e. kelarutan cuplikan dalam pelarut
• b. kecepatan fasa gerak dalam kolom
• c. suhu sistem kromatografi
•
• Dari faktor-faktor tersebut didapatkan rumus :
Cs
• KD = 
Cm
• KD : koefisien distribusi
• Cs : kadar senyawa dalam fasa diam
• Cm : kadar senyawa dalam fasa gerak
• Atas dasar rumus di atas,dua zat atau lebih dapat dipisahkan dengan kromatografi kolom
bilaharga KD masing-masing senyawa jauh berbeda. Perbedaan harga KD, akan menghasilkan
daya tambat untuk setiap analit atau linarut (senyawa yang dianalisis) berbeda sehingga dapat
terpisah dengan sempurna,tetapi rumus senyawa yang hampir mirip dan daya tambatnya
tidak jauh berbeda akan sulit dipisahkan dengan cara kromatografi.
•
• Bila digambarkan pita pemisah yang ada di dalam kolom adalah sebagai berikut :
• Daya pisah dapat dirumuskan sebagai berikut :
•
2 ( t2 – t1 )
• R = 
( W1 + W2 )
•
• t1 : adalah waktu tambat puncak 1
• t2 : adalah waktu tambat puncak 2
• W1 : lebar alas puncak 1
• W2 : lebar alas puncak 2
•
• Daya tambat sangat tergantung kemampuan interaksi antara linarut dengan fasa diam,
kemampuan interaksi tersebut menimbulkan kemampuan memilih dari fasa diam terhadap
linarut yang ketetapannya dinamakan , atau selektivitas. Faktor ukuran dan bentuk partikel
fasa diam akan menentukan kemampuan menampung linarut.
• Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
• Proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan
daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang
akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap
adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen
bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal ini yang
menyebabkan pemisahan.
•
• Kromatotron
• Proses isolasi yang terjadi berdasarkan adsorpsi dan partisi. Adsorpsi
adalah senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya
serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama.
Sedangkan partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam
cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen
disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia dapat
bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda yang menyebabkan
terjadinya pemisahan.
• FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI VAKUM CAIR
• · Pada prinsipnya adalah kromatografi kolom yang dipercepat proses
elusinya dengan bantuan alat vakum (penghisapan)=> waktu lebih cepat,
lazimnya hanya 2 – 3 jam saja.
• · Tujuan KVC, untuk fraksinasi senyawa-senyawa dalam suatu ekstrak
(menyederhanakan campuran senyawa)
•
• Tahapan pelaksanaan KVC :
• 1. Pencarian eluen yang akan digunakan untuk KVC
• Prinsipnya :
• · dicari eluen yang memisahkan noda kromatogram dengan Rf mulai 0,1
hingga Rf = 0,5.
• · untuk menghemat pelarut, biaya lebih murah & menghindari efek toksik
yang terjadi, lazimnya digunakan campuran n-heksana:etilasetat.
•
• 2. Penyiapan kolom KVC
• Prinsipnya :
• · Berat sampel yang akan dipisahkan akan menentukan pemilihan diameter
kolom KVC yang akan digunakan, dengan arahan ketentuan :
•
Berat sampel (g) Diameter kolom KKT (cm) Silika kolom (g) Perbandingan sampel
: silica kvc

15 – 25 14 150 – 250 1 : 10 – 1 : 15

3–5 10 60 – 125 1 : 20 – 1 : 25

1–2 7 30 – 80 1 : 30 – 1 : 40
• Tinggi silica dalam kolom KVC lazimnya hanya 5 cm, hingga tinggi maksimal
= diameternya (Silica G 60, Katalog Merck : 7730/7731)
• · Packing kolom dilakukan dengan cara : silica dalam kolom KVC dengan
dibantu vakum, ditekan-tekan hingga rata, selanjutnya dihomogenkan
dengan eluen (fase gerak) n-heksana.
•
• Catatan : Kolom telah homogen, jika silica tidak ada yang retak & waktu
dialiri eluen merata
•
• 3. Penyiapan sampel dengan impregnasi
• · Sampel dilarutkan dalam pelarut yang paling sesuai (larut dengan
sempurna). Jika ada sebagian tidak larut, hendaknya sampel yang tidak
larut tersebut dipisahkan terlebih dahulu dari larutan dengan penyaringan
biasa. Larutan sampel kemudian dicampurkan dengan silika gel impreg
(mesh 30 – 70, Katalog : 7733) dengan perbandingan 1:2 antara sampel
dengan silica, dan diuapkan pada tekanan rendah menggunakan rotary
epaporator sampai kering (bebas pelarut).
• · Sampel yang sudah di-impregnasi dimasukkan ke dalam kolom KVC, dan
pada bagian atas sampel diberi kertas saring untuk menghindari
penyebaran ekstrak kedalam eluen.
 4. Fraksinasi
Fraksinasi dilakukan dengan menggunakan eluen yang telah terpilih, jumlah fraksi
lazimnya hanya 12 – 20 fraksi untuk fraksinasi tahap pertama. Volume eluen untuk setiap kali
elusi tergantung dari diameter kolom KVC, dengan arahan sbb. :

Berat sampel (g) Diameter kolom KKT (cm) Volume eluen per-elusi (mL)
15 – 25 14 100 – 175
3–5 10 75 – 125
1–2 7 50 – 75

5. Pemekatan fraksi dengan cara evaporasi

Pemekatan fraksi dilakukan untuk tujuan agar saat masing-masing fraksi ditotolkan dalam
plat KLT, lebih pekat sehingga mempercepat dalam penotolan & noda kromatogram lebih
baik.
• 6. Analisis KLT hasil fraksinasi
• Masing-masing fraksi hasil KKT ditotolkan pada plat KLT, dibandingkan
dengan sampel/ekstrak dan standar (chemical marker standar, jika punya).
Eluen yang dapat digunakan untuk analisis KLT adalah eluen yang
memberikan nilai Rf 0,2 – 0,8 untuk noda-noda kromatogram yang diamati.
Fraksi yang memberikan noda kromatogram tunggal dan memiliki Rf sama
dengan standar, menunjukkan senyawa murni hasil isolasi yang sama
dengan standarnya, selanjutnya digabungkan.
•
• 7. Penggabungan fraksi
• Berdasarkan analisis KLT terhadap fraksi-fraksi, maka fraksi yang memiliki
noda-noda kromatogram yang mirip dengan nilai Rf yang sama
digabungkan, selanjutnya dievaporasi untuk ditentukan beratnya. Fraksi
gabungan yang memiliki noda kromatogram lebih sederhana dengan berat
yang signifikan dapat dilanjutkan untuk pemurnian. Atau fraksi gabungan
yang memiliki noda kromatogram dari chemical marker yang akan diisolasi,
dimurnikan lebih lanjut dengan cara KKT atau kromatografi radial atau KLT
preparative.
•
 PEMURNIAN FRAKSI DENGAN CARA
KROMATOGRAFI KOLOM TEKAN
• Tahapan pelaksanaan KKT :
• 1. Pencarian eluen untuk pemurnian.
• Prinsipnya :
• · dicari eluen yang memisahkan noda kromatogram yang terbaik, dengan Rf = 0,2
– 0,3.
• · untuk senyawa flavonoid & turunannya, lazimnya dipakai
campuran (kloroform:n-heksana), (kloroform:etilasetat) atau
(kloroform:methanol) tergantung sifat polaritas dari chemical marker yang akan
dimurnikan.
• · Untuk senyawa terpenoid, lazimnya dipakai campuran n-heksana:etilasetat
atau n-heksana:kloroform.
•
• 2. Penyiapan kolom KKT
• Prinsipnya :
• · Berat sampel yang akan dipisahkan akan menentukan pemilihan diameter kolom
KKT yang akan digunakan, dengan arahan ketentuan :
 Berat sampel (mg) Diameter kolom KKT (cm)

< 50 1

100 – 250 2

250 – 500 3

· Tinggi silica dalam kolom 15 – 17 cm (Silica G 60 mesh 60 – 200, Katalog

Merck : 7734)
· Silica dalam kolom KKT dihomogenkan dengan eluen (fase gerak) yang telah
terpilih untuk pemurnian, hingga tidak nampak adanya gelembung-gelembung
udara (eluen boleh diulang-ulang untuk dimasukkan dalam kolom KKT). Catatan
: selama mengelusi tidak boleh kering, eluen melewati batas atas silica dalam
kolom.
• 3. Penyiapan sampel dengan silica impreg (mesh 30 – 70, Katalog : 7733)
• Sampel dilarutkan dalam pelarut yang paling sesuai (larut dengan sempurna). Jika ada sebagian
tidak larut, hendaknya sampel yang tidak larut tersebut dipisahkan terlebih dahulu dari larutan
dengan penyaringan biasa. Larutan sampel kemudian dicampurkan dengan silika gel (dengan
perbandingan 1:2 antara sampel dengan silica), dan diuapkan pada tekanan rendah
menggunakan rotary epaporator sampai kering (bebas pelarut). Sampel yang sudah di-
impregnasi dimasukkan ke dalam kolom KKT, dan pada bagian atas sampel diberi kapas
secukupnya saja.
•
• 4. Fraksinasi/pemurnian dengan KKT
• Fraksinasi dengan kolom KKT bertujuan untuk mendapatkan senyawa murni dalam beberapa
fraksi hasil pemisahan dengan KKT. Eluen yang digunakan lazimnya hanya satu system
campuran pelarut (polaritasnya tetap), lazimnya dibutuhkan 250 – 500 mL.
• Masing-masing fraksi ditampung dengan volume = 5 – 20 mL. Dan sebelum dihentikan atau
dibongkar, fraksi yang terakhir dianalisis KLT dengan dibandingkan dengan sampelnya. Jika
semua senyawa atau chemical marker target sudah keluar semua, proses fraksinasi dapat
dihentikan.
•
• 5. Analisis KLT hasil fraksinasi/pemurnian
• Masing-masing fraksi hasil KKT ditotolkan pada plat KLT, dibandingkan dengan sampel/ekstrak
dan standar (chemical marker standar, jika punya). Eluen yang dapat digunakan untuk analisis
KLT adalah eluen yang memberikan nilai Rf 0,2 – 0,8 untuk noda-noda kromatogram yang
diamati. Fraksi yang memberikan noda kromatogram tunggal dan memiliki Rf sama dengan
standar, menunjukkan senyawa murni hasil isolasi yang sama dengan standarnya, selanjutnya
digabungkan.
•
• 6. Analisis kemurnian hasil isolasi
• Fraksi gabungan yang memberikan noda kromatogram tunggal
dengan nilai Rf sama dengan standarnya, dielusi dengan 3 (tiga)
system eluen yang berbeda-beda (sifat polaritasnya). Misal; system I
campuran heksana:etilasetat; system II campuran
kloroform:methanol; system III campuran
heksana:kloroform:etilasetat.
•
• Jika dengan 3 system eluen yang berbeda tersebut, menunjukkan
noda kromatogram tunggal dapat disimpulkan bahwa isolat tersebut
telah murni. Jika belum murni, biasanya memerlukan 1 tahapan
kromatografi lagi untuk memurnikannya. Jika telah murni dapat
ditentukan kandungan chemical marker dalam ekstrak dengan
metode densitometer (TLC scanner) atau HPLC.