ANALISIS PROFIL AS.

AMINO GELATIN
SAPI DAN BABI

Kelompok 6
Citra Reza APP 1110102000028
Hadi Qudsi
1110102000066
Khalida Handayani 1110102000008
Liana Puspita Cahyaningrum
1110102000072
Nirmala Kasih 1110102000042

ASAM AMINO
Asam amino adalah senyawa organik yang
memiliki gugus fungsional karboksil (-COOH)
dan amina (NH2). Dalam biokimia seringkali
pengertiannya dipersempit: keduanya terikat
pada satu atom karbon (C) yang sama (disebut
atom C "alfa" atau ).
Asam
amino merupakan monomer yang
menyusun polimer-polimer pada protein. Asam
amino dapat mengalami proses hidrilisis yang
menghasilkan hidrolisat protein.

Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus

amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan,
asam amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi
asam pada larutan basa dan menjadi basa pada
larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino
mampu menjadi zwitter-ion.
Asam amino termasuk golongan senyawa yang paling
banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat
penting dalam organisme, yaitu sebagai penyusun
protein. Asam amino adalah komponen utama protein,
yang ditemukan dalam semua organisme hidup dan
memainkan peranan dalam sel hidup

GELATIN
Gelatin

merupakan campuran heterogen

dari polipeptida yang diperoleh melalui
hidrolisis kolagen dari jaringan ikat
hewan.
Di eropa sumber utama gelatin diekstrak
dari kulit babi 80%, kulit sapi 15%, dan
5% sisanya berasal dari tulang babi dan
sapi, unggas dan ikan

berdasarkan cara pembuatannya, gelatin dibedakan

atas dua jenis, yaitu gelatin tipe A dan tipe B
Gelatin yang berasal dari kulit babi diperlakukan
dengan metode asam (tipe A) untuk menghindari
saponifikasi karena kandungan lemak yang tinggi
di kulit. Umumnya, perlakuan asam terbatas pada
jaringan hewan muda yang memiliki ikatan kovalen
dalam kolagen yang lebih rendah yang menjamin
kualitas gelatin yang baik.
Perlakuan alkali (tipe B) digunakan untuk gelatin
yang bersumber dari tulang

Gelatin merupakan salah satu bahan baku yang

banyak digunakan dalam industri pangan seperti
permen, es krim, produk susu, roti, kue, keju, yogurt,
dan marshmallow.
Gelatin digunakan sebagai stabilizer atau emulsifier,
memperbaiki dan mempertahankan sistem emulsi
produk pangan. Disamping itu, gelatin juga
dimanfaatkan dalam industri kosmetik, farmasi,dan
lain-lain

ANALISI AS.AMINO GELATIN BABI

DAN SAPI
KCKT/
PCA

HPLC

HPLC

IDENTIFIKASI ASAM AMINO

DENGAN HPLC
Untuk identifikasi senyawa organik
Tahap2 :
1.
Pembuatan hidrolisat protein(asam /basa),
2.
Derivatisasi
3.
Injeksi

HIDROLISIS METODE ASAM

Sampel halus dicampur dgn 6 N HCL dan
dimasukkan dalam gelas ampul, dialiri gas
nitrogen, ampul gelas di sealed dgn api bunsen.
Ampul gelas dimasukkan oven 110 oC selama 20
jam.
(-) asam amino tryptophan rusak, sebagian
cystein dan methionine juga rusak.

HIDROLISIS BASA
Sampel halus di ekstrak dengan 4,2 N NaOH
dimasukkan dalam ampul gelas, di sealed,
dibekukan dalam es kering. Kemudian
dipindahkan ke tabung gelas (Oehlhlegel glass),
agar hidrolisat bisa divakumkan (0,18 mm Hg).
Gelas ini pindahkan kesuhu kamar dimasukkan
oven 110 OC selama 16jam.
Note : khusus di gunakan untuk recovery
tryptophan, dimana dgn methode asam 100%
asam amino tryptophan rusak.

DERIVATISASI

1.
2.
3.
4.

Tujuan :
Meningkatkan deteksi
Merubah struktur molekul(polaritas analit)m-> mhslkan puncak kromatografi yg
lbh baik
Mubah matriks -> pemisahan lbh baik
Mstabilkan analit yg sensitif

Syarat rx derivatisasi :
5.
Produk yg dihslkan hrs mampu menyerap sinar uv/ s.tampak/ membentuk senyawa
berfluoresen.
6.
Proses derivatisasi cepat dan hrs menghasilkan produk yg sebesar mungkin (100%)
7.
Produk harus stabil selama proses derivitasi dan deteksi
8.
Sisa pereaksi u/ derivatisasi harus tdk menggangu pemisahan kromatografi
Note:
Derivatisasi dilakukan sebelum analit masuk kolom (pre-column derivatization)
atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization)
Kelebihan dari derivatisasi pra kolom yaitu waktu analisa cepat, dan cocok
untuk analisa dengan jumlah residu yang lebih sedikit atau sekitar 20 residu.

REAGEN DERIVATISASI
GUGUS

REAGEN U/ DIDETEKSI UV/VIS

FUNGSIONAL

FLUORESEN

As.karboksilat;
as.lemak; as.folat

>P-nitrobenzil N,N-diisopropiliso urea

(PNBDI)
>3,5-dinitrobenzil N,N-diisopropiliso urea
(DNBDI)
>P-bromofenasil bromida (PBPB)

alkohol

>3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC)

>4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil
(Dabsyl-Cl)
>1-naftilisosianat (NIC-1)

Aldehid; keton

>P-nitrobenziloksiamin hidroklorida
(PNBA)
>3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida
(DNBA)

Amin primer
Amin primer &
sekunder

REAGEN U/ DIDETEKSI
>4- bromometil-7-asetoksikumarin
>4-bromometil-7- metoksikumarin

Dansil Hidrazin

Fluoresamin 0- ftalaldehid (OPA)

> 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC)
> N-Suksinimidil-p-nitrofenilasetat(SNPA)
> N-Suksinimidil-3,5
dinitrofenilasetat(SDNPA)
Dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-

7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl)
7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3diazol(NBD-F)
Dansil klorida

Keuntungan

Kerugian

Tingginya peak dari as.amino dpt digunakan

untuk perbedaan yg sederhana dari gelatin
babi dan sapi

efektivitas pemisahan, kecepatan analisis

dan sensitivitas deteks. karena dengan
HPLC campuran analit dapat dipisahkan
secara langsung dalam kolom yang sesuai,
seperti dalam metoda analisis asam amino

Penggunaannya hanya untuk

profil as.amino
Untuk perbedaan antara analisa
gelatin babi dan sapi mungkin
tidak cukup dipercaya
(memerlukan bantuan analisa
lain)

PERBEDAAN AA BABI DAN SAPI

MENGGUNAKAN HPLC
Konsentrasi dari aa. Yang lebih tinggi antara aa
keduanya
Babi : as. Glutamat, trypthophan, phenylalanine,
glutamine, tyrosine,methionin
Sapi : as.aspartat, asparagin, histidine, alanin,
arginin, isoleusine, leusin, lysine

BAHAN DAN LARUTAN STANDAR

Bahan:
Standar asam amino
ortho-phtalaldehyde
(OPA)
2-mercaptoethanol
(MCE)
gelatin babi dan sapi
methanol,
tetrahydrofuran, NaOH,
HCL, Pb(II)asetat, asam
oksalat
Air bidistilled steril
Sampel permen (soft
candy)

Larutan

Larutan standar dan reagen:

standar asam
amino disiapkan dengan
melarutkan 10 mg dari
asam amino dengan air
bidistilled sampai 10 ml
dalam labu volumetri
standar
Reagen derivatisasi OPAMCE disiapkan dengan
melarutkan 100 mg ortophtalaldehid (OPA) dan 100
l 2-mercaptoethanol (MCE)
dalam labu volumetri 50 ml.
Tambahkan dengan 10 m
metanol dan dibuat dalam
volume menggunakan bufer
borat (pH 9,1 0,05)

PREPARASI SAMPEL (SOFT CANDY)

Sekitar 20 gr dari gelatin
sapi atau babi ditimbang
secara kuantitatif dan
kemudian rendam dengan
100 ml air selama 15 menit.

Biarkan selama 4 jam untuk

mendapatkan tekstur yang
halus dan kenyal. Setelah
keras dipotong dan
kemudian di celupkan dalam
gula bubuk.

Kemudian 150 gram gula,

dan 3 ml perasa buah
dilarutkan dalam 100 ml air

Larutan kemudian
didinginkan, dan
dituangkan ke dalam panci

Gelatin yang telah direndam

kemudian dituangkan ke
dalam larutan yang
mengandung perisa gula
dan buah.

kemudian larutan tersebut

dimasak dan diaduk terus
sampai semua gelatin larut
dan mengental

CARA KERJA
profil asam amino
ditentukan dengan
menggunakan RP-HPLC
dengan detektor
fluorosensi, dan
Langkah-langkah
analisis meliputi
hidrolisis gelatin untuk
melepaskan residu asam
amino dan derivatisasi
asam amino dengan
OPA-MCE.

Kolom yang digunakan adalah

Eurospher
Sistem eluen terdiri dari dua
komponen (sistem gradien)
Eluen A adalah buffer asetat
0,01 M (pH: 5,9), sedangkan
eluen B adalah metanol: buffer
asetat 0,01 M (pH: 5,9):
tetrahidrofuran (400: 75: 25 v /
v / v).
Laju alir eluen adalah 1,5 ml /
menit.
Detektor fluoresensi di set
pada panjang gelombang
eksitasi dan emisi di 340 dan
450 nm

5 gram sampel
ditimbang

Encerkan sampai 100 ml

dengan air steril dan di
guncang pelan

sampel disaring dengan

menggunakan jarum
suntik-driven filter
dengan ukuran pori 0,45
pM

Ditaruh ke dalam botol

kaca yang berisi 20 ml
HCL 6N

Masukkan sampel ke
labu ukur 100 ml,
tambah dengan 5 ml Pb
asetat (II) 40% dan 2 ml
asam oksalat 15 %

tambahkan dengan 950

uL reagen derivatisasi

Tutup rapat, masukkan

dalam Autoklaf pada
suhu 110C

Netralkan dengan
NaOH 1M

30 uL larutan
diinjeksikan ke dalam
sistem HPLC.

KEGUNAAN REAGEN

HCl 6N : mendestruksi sampel mnjd unsur2nya karena HCl

bersifat oksidatir kuat
NaOH 1M : menetralkan
Pengenceran dengan air steril dan di guncang pelan :
membilas hidrolisat
OPA-MCE: reagen derivatisasi gugus amine primer agar
dapat terdeteksi dgn spektrofloromtr

5 ml Pb asetat (II) 40% : penjernih dan mengendapkan asamasam organik.

2 ml asam oksalat 15 % : mengendapkan Pb

Kegunaan menggunakan HPLC dengan fluorosensi dalam

analisis ini adalah untuk memisahkan kadar asam amino
yang terkandung dalam gelatin sapi dan babi. Kadar asam
amino yang didapat kemudian diproses menggunakan PCA
Penggunaan HPLC dalam determinasi asam amino banyak
digunakan terutama dari segi efektivitas pemisahan,
kecepatan analisis dan sensitivitas deteks. karena dengan
HPLC campuran analit dapat dipisahkan secara langsung
dalam kolom yang sesuai, seperti dalam metoda analisis
asam amino
Derivatisasi dengan HPLC bertujuan untuk mengubah
analit menjadi bentuk yang dapat terdeteksi oleh sistem
detektor yang digunakan, sesuai dengan sensitivitas yang
diperlukan. Untuk mendapatkan sensitivitas dan
selektivitas yang tinggi digunakan detektor
spektrofluorometer. Dalam hal ini derivatisasi dilakukan
supaya didapat senyawa yang berfluoressensi kuat.

HASIL

HASIL
Babi : as. Glutamat,
trypthophan,
phenylalanine,
glutamine,
tyrosine,methionin
Sapi : as.aspartat,
asparagin,
histidine, alanin,
arginin, isoleusine,
leusin, lysine

PCA
Princypal Component Analysis

PCA adalah suatu alat yang digunakan untuk

menganalisis data atau mengklasifikasi suatu
data mislanya gelatin sapi atau babi dengan
sistem mengurangi dimensi dari satu set data
tapi bisa memberikan terhadap suatu variabel
asli.
Atau alat yang mampu meganalisa suatu
senyawa berdasarkan asam amino pada
proteinnya

LANJUTAN..
Berdasarkan Kaiser criterion
Komponen utama (PC) yang digunakan adalah PC dengan eigen
Value (nilai ciri atau varians setiap komponen utama ) lebih dari
1 sedangkan proporsi keragaman yang dianggap cukup mewakili
data jika keragaman kumulatif mencapai 70-80%
PC diurutkan dari variasn terbesar hingga terkecil
PC1 kombinasi linier dari suatu variabel yang diamali dan
memiliki varians terbesar
PC2 komponen dari suatu variable yang diamati yangberdifat
ortogonal terhadap PC1 dan memiliki variasn kedua terbesar

Kurva score plot digunakan jk ada 2 komponen

pertama yang merupakan nilai terbanyak dalam
variabilitas di dalam data
Komponen utama pertama (PC1) sbg absis
Komponen utama kedua (PC2) sbg ordinat
Kurva score plot digunakan untuk menaksir data
yaitu sebagai dasar perbedaan gelatin sapi dan
babii semakin dekat letak antara sampel pada
score plot, maka semakin besar pula
kemiripannya atau sampel merupakan kelompok
yang sama

PCA ( PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS)

PCA

merupakan suatu teknik

untuk mengurangi banyaknya
data ketika adanya korelasi,
namun
PCA
tidak
akan
membantu saat variabel-variabel
tidak memiliki korelasi.
PCA digunakan untuk memilih
variabel yang signifikan dari
parameter persentase peak yang
tinggi untuk tiap asam amino.
Hasil
PCA adalah komponen

HASILNYA ADALAH :
1 = PC1 (-) DAN PC2
(-)
2 = PC1 (+) DAN PC2
(-)
3 = PC1 (-) DAN PC2
(-)
4 DAN 5 = PC1 (+)
DAN PC2 (+)
6 DAN 7 = PC1 (-)
DAN PC2 (+)

KESIMPULAN
Penggunaan kombinasi HPLC dan PCA dalam
menentukan profil asam amino dari gelatin sapi
atau babi dapat dilakukan hanya dalam skala
laboratorium karena metode pembuatan
gelatin yang masih sederhana.
Penggunaan kombinasi HPLC dan PCA dalam
menentukan profil asam amino dari gelatin sapi
atau babi tidak dapat dilakukan dalam skala
industri karena proses pembuatan gelatin
dalam
industri
yang
kompleks
dapat
mempengaruhi profil asam amino sehingga data
yang dihasilkan tidak dapat dijadikan acuan.

PERTANYAAN

Tidak ada penanya.

% susut pengeringan =
=

DAPUS

=
88,44%

Analisis Komposisi Asam Amino Gelatin

Sapi dan Gelatin babi Pada Produk Kapsul
Lunak Simulasi Menggunakan Teknik
Kombinasi High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) dan Principal
Component Analysis (PCA)
Differentiation of Bovine and Porcine
Gelatins in Soft Candy Based on Amino
Acid Profiles and Chemometrics