SIFAT FISIKO KIMIA, ISOLASI DAN ANALISIS

SENYAWA FENOL
(part 3)
EFEK PENAMBAHAN PEREAKSI GESER
Penambahan NaOH/NaOMe Pola spectra UV jika terdapat gugus 4’-OH bebas
• Flavonoid 🡪 asam lemah, dg
basa akan membentuk garam
• Penambahan NaOH/NaOMe
dapat menyebabkan ionisasi
gugus –OH
• Terjadi pergeseran
batokromikdan hiperkromik
karena ggs –OH pada C4’
terionisasi.
• Untuk deteksi ggs –OH pada C4’,
terjadi pergeseran batokomik
(45 – 65 ) & juga terjadi
hiperkromik.
pola spectra UV jika gugus 4’-OH terikat
b. Penambahan dengan NaOAc (Natrium asetat)
pola spectra UV jika terdapat 7-OH bebas

• NaOAc (Natrium acetat), basa

lemah.
🡪 hanya mengionisasi gugus
hidroksi yang paling asam (OH
pada C7)
• NaOAc untuk deteksi adanya
ggs 7-OH bebas, terjadi
pergeseran batokromik pita II,
pergeseran flavon dan flavonol
5 – 20 nm.
Flavonoid, senyawa dengan gugus OH 🡪 mampu membentuk
komplek

a. Penambahan asam borat

Asam borat dengan keberadaan
NaOAc, akan mengkelat ggs
o-di-OH pada semua lokasi
pada inti flavonoid (kecuali
C5,6)

Untuk deteksi ggs o-diOH. Pada

flavon dan flavonol terjadi
pergeseran batokromik pita I
(12 – 30nm)
b. Penambahan AlCl3
Membentuk komplek dengan gugus :
1. gugus –OH dekat C=O
• 5-OH dengan 4-keto komplek stabil
• 3-OH dengan 4-keto asam
2. orto-diOH (komplek tidak stabil asam)

Besar pergeseran (Δ λmak) pita I terhadap

spektra dalam MeOH karena penambahan AlCl3:
• 3-hidroksi (flavonol), tanpa 5-OH 🡪 60 nm
• 5-hidroksi flavon 🡪 45 nm
• 3,5-dihidroksi flavon 🡪 50 – 55 nm
• o-di-OH cincin B 🡪 30 – 40 nm
• o-di-OH cincin A 🡪 20 – 25 nm
c. Perubahan spekturm UV karena AlCl3
Karakter serapan spektrum UV dari flavonoid 🡪 perlu penegasan
dengan metode :
Spektrofotometri Massa (MS)
Untuk memastikan BM dan pola fragmentasinya
Spektrofotometri HNMR

Flavonoid menunjukkan signal proton pada geseran 5 – 8 ppm

 Reaksi Flavonoid dengan AlCl3
Analisis Kuantitatif
Kadar Flavonoid Total
• Sampel 20 mg dilarutkan dalam 10 mL etanol pa kemudian disentrifuge
sehingga diperoleh konsentrasi 2000 ppm.
• Sebanyak 0,5 mL sampel uji ditambahkan dengan 0,1 mL aluminium (III)
klorida 10%, 0,1 mL natrium asetat 1 M dan 2,8 mL air suling, kemudian
diinkubasi 30 menit.
• Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang maksimum larutan standar kuersetin 437 nm.
ANALISIS KUANTITATIF FLAVONOID
DENGAN METODE KCKT
Pemisahan dengan hasil dapat dilakukan
dengan fase diam:
• mikrobondapak RP-18
• Licrosorb RP-8 dan RP-18
• Fase diam silika yang terikat dengan –NH2
(Untuk glikoflavon)

Fase gerak : berupa eluen polar seperti :

• campuran methanol – air,
• larutan asam asetat,
• larutan asam asetat dengan metanol
ANTOSIANIN
• Pigmen alami tumbuhan yang berwarna
merah – ungu – biru.
• Dalam bentuk glikosida yg larut air
- Jika monoglikosida 🡪 gula pada C3
- Diglikosida 🡪 gula pada C3 dan C5
• Antosianidin :
- aglikon antosianin yang terbentuk bila
antosianin dihidrolisis dengan asam.
- struktur inti : 2-fenilbenzopirilium
(flavilium) yang umumnya ditandai
gugus 3-OH
Karakteristik warna :
• Jenis warna yang timbul, tergantung pada :
• Jumlah, jenis dan kedudukan substituen pada cincin A dan B
• pH medium
• ion logam, dll
• Reaksi pada pH tinggi
Warna Antosianin :
Cincin B :
• Penambahan gugus hidroksi bebas pada cincin B suatu
molekul antosianin menyebabkan lebih pekatnya warna biru
yang ditimbulkan.
• Penambahan gugus metoksi akan makin besar pergeseran
kearah merah

pH Medium :
• Antosianin berwarna merah pada asam dan akan beubah
menjadi biru jika pH naik dan akhirnya akan rusak dalam
larutan alkali kuat.
 Sifat Antosianin
Tidak stabil dalam Dengan cahaya warna
larutan basa dan netral memudar

Stabil dalam larutan

asam
Prinsip Isolasi
diekstraksi dengan pelarut yang mengandung asam (HCl atau
asam asetat), larutan disimpan dalam gelap
• Jaringan segar diekstraksi dengan sedikit metanol yang
mengandung HCl %.
• Ekstrak pekat dapat langsung didentifikasi dengan
kromatografi kertas
 ISOLASI dan
IDENTIFIKASI
ANTOSIANIDIN ANTOSIANIN
• Jaringan segar dipanaskan dalam HCl 2M • Jaringan segar diekstraksi dengan sedikit
selama 40 menit 100°C. metanol yang mengandung HCl %.
• Ekstrak berwarna didinginkan dan • Ekstrak pekat dapat langsung didentifikasi
diendap-tuangkan dengan kromatografi kertas
• Ekstrak dicuci dengan etil asetat, lapisan etil
asetat dibuang dan lapisan air dipanaskan
80°C.
• Pigmen antosianin dalam air diekstraksi
dengan amil alcohol, dipekatkan dan
dikeringkan.

IDENTIFIKASI
• Ekstrak kering dilarutkan metanol – HCl, dilakukan KKt gerak forestal (HCl pkt -
asam asetat - air = 3 : 30 : 10), pengembangan 1 arah.
• Antosianidin dapat terpisahkan (seperti : pelargonidin, sianidin, peonidin,
deifinidin, peltunidin, malvidin)
PENETAPAN KADAR ANTOSIANIN TOTAL
• Alat SPEKTROFOTOMETER
• Metode pH differensial dengan
membuat larutan sampel dalam air pada
pH 1,0 dan 4,5 , kemudian diukur
serapannya (Suzery dkk, 2010)
• Penetapan antosianin dilakukan pada
perbedaan pH 1,0 dan pH 4,5. pH 1,0
antosianin berbentuk senyawa oxonium
dan pada pH 4,5 berbentuk karbinol tak
berwarna.
• Pengukuran serapan pada λmaks 510 nm
dan 700 nm

ANALISIS KUANTITATIF ANTOSIANIN
DENGAN METODE KCKT
Antosianin dapat dipisahkan dengan baik
dengan :
• fase diam C-18
• fase gerak dieluasi bertingkat dengan asam
asetat – air ( 15 : 85) dan air – asam asetat –
methanol (65 : 15 : 20)
Diglikosida:
1. Delfidin 3,5-diglukosida
2. Sianidin 3,5-diglukosida
3. Pentunidin 3,5-diglukosida
4. Peonidin 3,5-diglukosida
5. Malvidin 3,5-diglukosida
6. Delfidin 3-glukosida
7. Sianidin 3-glukosida
8. Petinidin 3-diglukosida
9. Peonidin 3-diglukosida
10. Malvidin 3-diglukosida
11. Delfidin 3-(6-O-kumaril-gluk)-5-glukosida
12. Sianidin 3- (6-O-kumaril-gluk)-5-glukosida
13. Petinidin 3-(6-O-kumaril-gluk)-5-glukosida
14. Peonidin 3-(6-O-kumaril-gluk)-5-glukosida
15. Malvidin 3- (6-O-kumaril-gluk)-5-glukosida
16. Delfidin 3-(6-O-kumaril-glukosida)
17. Sianidin 3- (6-O-pkumaril-glukosida)
18. Petinidin 3-(6-O-pkumaril-glukosida)
19. Peonidin 3-(6-O-pkumaril-glukosida)
20. Malvidin 3- (6-O-pkumaril-glukosida)
 TANIN
1. Tanin yang dapat dihidrolisis
Dibentuk dr molekul asam aromatik (as. gallat & turunannya) dg
monosakarida yang dihubungkan melalui ikatan ester.

Gallotanin 🡪 jika dihidrolisis menghslkan as. Galat

Ellagitanin 🡪 jika dihidrolisis menghasilkan as. Ellagat

Gallotanin
 2. Tanin yang tak dapat dihidrolisis

Merup. polimer katekin. Jika dihidrolisis menghslkan zat amorf tak

larut warna merah 🡪 phlobafen.

Tanin katekin
 Karakteristik TANIN
substansi komplek, berupa senyawa polifenol, dan
terdistribusi dalam tumbuhan tinggi.

Karakteristik kimia fisika ;

• sulit dikristalkan, dg air membentuk larutan koloidal,
• bereaksi asam dan pada lidah memberi rasa berkerut.
• mengendapkan larutan gelatin dan alkaloid
• mengendapkan protein, membentuk senyawa
gabungan protein dan tannin 🡪 tahan enzim proteolitk
🡪 pada jaringan hidup 🡪 efek adstringent 🡪 dasar
dalam aplikasi tannin pada :
✔ luka bakar dan
✔ saluran pencernaan (tannalbin) dan
✔ penyamakan kulit
TANIN 🡪 SENYAWA POLIFENOL :

• Dg BM 500 – 3000, tiap 100 satuan BM

mempunyai gugus OH (1-2).
• dapat membentuk ikatan yang stabil dengan protein
dan biopolymer lain (seperti selulosa dan pectin).
Polifenol dg BM :
kurang 500 🡪 mengikat protein 🡪 labil
🡪 tidak bersifat sbg penyamak
lebih 3000 🡪 mengikat protein 🡪 stabil
🡪 tetapi tidak bersifat sbg penyamak.
 SIFAT TERHADAP GARAM FERRI ( )
• Dengan Potassium ferrisianida dan ammoniak memberikan warna
merah.
• Dengan garam Ferri memberikan warna biru atau hijau kehitaman.
Warna hijau 🡪 tanin turunan katekol (2 gugus –OH)
Warna biru 🡪tanin turunan pirogalol (3 gugus OH)
dalam tanaman dapat kombinasi, warna ditentukan yang dominan
PENETAPAN KADAR
FENOL TOTAL (FHI)
TAHAPAN PEMISAHAN SENYAWA FENOL
Ekstraksi senyawa fenol dari bahan tanaman :
1. Langkah awal
Sampel digiling/diserbuk :
• untuk meningkatkan luas permukaan
• memungkinkan kontak lebih baik dgn pelarut
• membantu pencampuran sampel untuk memastikan
bahwa bagian diekstrak merupakan perwakilan dari
seluruh sampel
• senyawa fenolik terjadi sebagai glikosida atau ester.

2. pemurnian dari ekstrak kasar

metode yang umum diterapkan : ekstraksi cair-cair,
kromatografi kolom, ekstraksi fase padat (SPE)
PRINSIP METODE
• Pereaksi Folin-Ciocalteu berisi larutan kompleks ion polimerik dari
asam fosfomolibdat dan asam heteropolifosfotungstat. (Pereaksi
terbuat dari air, natrium tungstat, natrium molibdat, asam fosfat, asam
klorida, litium sulfat, dan bromin)
• Prinsip metode Folin-Ciocalteu adalah :
• Oksidasi gugus fenolik hidroksil. Pereaksi mengoksidasi menjadi
fenolat (garam alkali), dan terjadi reduksi asam heteropoli
menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten (Mo-W).
• Selama reaksi belangsung, gugus fenolik-hidroksil bereaksi
dengan pereaksi Folin-Ciocalteu, membentuk kompleks
fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru (dengan
struktur yang belum diketahui), dapat dideteksi dg
spektrofotometer 750 nm.
• Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan
konsentrasi ion fenolat yang terbentuk,
Prosedur Folin and Ciocalteau
Disiapkan larutan uji dan larutan pembanding
Pada msg2 1 ml larutan uji dan larutan pembanding, ditambahkan 5 ml
Folin-ciocalteau LP (7,5% dalam air). Diamkan 8 menit, tambah 4 ml
NaOH 1%, inkubasi selama 1 jam. Ukur serapan masing-masing pada
λmaks sekitar 730. Lakukan pengukuran blanko dg cara sama tanpa
penambahan larutan uji